Artículo de Investigación
Propiedades antimicrobianas in vitro de metabolitos secundarios aislados de Peltostigma guatemalense, una especie colombiana de Rutaceas contra el parásito Plasmodium falciparum y contra cepas bacterianas
In vitro antimicrobial properties of secondary metabolites from Peltostigma guatemalense, a Colombian Rutaceae specie, against the Plasmodium falciparum parasite and bacterial strains
Juan Manuel Lozano1, Luis Enrique Cuca Suárez2
1 Fundación Instituto de Inmunología de Colombia (FIDIC), Carrera 50 No. 26-00, Bogotá, Colombia. Tel.: +57-1-315-8920, ext. 139, fax +57-1-481-5269. Correo electrónico: jmlozanom@ciencias.unal.edu.co, jm_lozano@fidic.org.co
2 Universidad Nacional de Colombia, Bogotá Colombia, Facultad de Ciencias, Departamento de Farmacia.
Recibido para evaluación: agosto 4 de 2008 Aceptado para publicación: octubre 27 de 2008
RESUMEN
Con el estudio de los extractos de Peltostigma guatemalense, algunas fracciones sin purificar y metabolitos aislados, se determinó la actividad antimicrobiana frente a bacterias gram positivas (Staphylococcus aureus ATCC 6538 y Enterococcus faecalis ATCC 29212) y gram negativas (Salmonella typhimurium ATCC 14028s y MS 7953) así como la actividad antiparasitaria frente Plasmodium falciparum. Los metabolitos aislados de los extractos de hojas y extracto etanólico de madera fueron: siete alcaloides, skimmianina, γ-fagarina, anhidroevoxina, evoxina, 7-isopentiloxi-γ-fagarina, kokusaginina y 4-metoxi-1-metil-2-quinolona, una cumarina, escopoletina, un flavonoide, gardenina B, un lignano, siringaresinol, un terpeno, Lupeol, un esterol, sitosterol y dos derivados del ácido benzoico: p-hidroxibenzoato metilo y ácido fenilacético, los cuales fueron identificados por métodos espectroscópicos y por comparación con los datos reportados en la literatura. Los compuestos alcaloidales, anhidroevoxina, kokusaginina y 4-metoxi-1-metil-2-quinolona, mostraron una fuerte actividad anti Plasmodium y el compuesto p-hidroxibenzoato de metilo presentó la actividad antimicrobiana más promisoria comparada con los demás compuestos ensayados.
]]> Palabras clave: Peltostigma guatemalense, Rutaceae, alcaloide, flavonoide, actividad anti Plasmodium falciparum, actividad antibacteriana.ABSTRACT
With the study of extracts Peltostigma guatemalense, some fraction without purify and isolated metabolites were found antimicrobial activity against Gram-positive bacteria Staphylococcus aureus ATCC 6538 and Enterococcus faecalis ATCC 29212 and Gram-negative Salmonella typhimurium ATCC 14028s and MS 7953 and as antiparasitic activity against Plasmodium falciparum. The metabolites isolated from extracts of ethanol extract of leaves and wood were: seven alkaloids γ-fagarine, anhidroevoxyn, evoxyn, skimmianine, 7-isopenthyloxi-γ-fagarina, kokusaginina and 4-methoxy-1-methyl-2- quinolone one coumarin, escopoletina, one flavonoid, gardenine B, one Lignan, syringaresinol, one terpene, lupeol, one sterol, sitosterol and two derivatives of benzoic acid: methyl-p-hydroxybenzoate, phenylacetic acid which were identified by spectroscopic methods and by comparison with the data reported in the literature. The alkaloid compounds, anhidroevoxyn, kokusaginine and 4- methoxy-1-methyl-2-quinolone, showed a strong anti Plasmodium activity and the compound p-hydroxybenzoate presented the most promising antimicrobial activity compared with the other compound tested.
Key words:Peltostigma guatemalense, Rutaceae, alkaloid, flavonoid, anti Plasmodium falciparum activity, antibacterial activity.
INTRODUCCIÓN
Durante las últimas cuatro décadas, la pérdida de actividad antimicrobiana de los antibióticos convencionales, ocasionada por el incremento de la resistencia microbiana a los mismos, ha generado una crisis mundial antibiótica constituyéndose en un grave problema de salud pública. A pesar de la existencia de cientos de compuestos disponibles comercialmente, la vida útil de los antibióticos tradicionales ha decrecido ostensiblemente debido a la "habilidad" de los microorganismos para desarrollar estrategias moleculares de resistencia y además para transferir tal información biológica a otros microbios patógenos.
Es así como las bacterias y algunos hongos coexisten en una asociación física constante junto a diferentes especies de animales y plantas. Sin embargo, una enfermedad ocasionada por un microorganismo patógeno de tipo bacteriano u hongo, el cual llega a ocupar un nicho particular en un hospedero, da a lugar a su proliferación y al desarrollo de sus factores de virulencia y a desarrollar nuevos mecanismos para la evasión del sistema inmune del hospedero.
Por estas razones, urge el desarrollo de nuevos agentes antimicrobianos más potentes y también la necesidad de establecer nuevas estrategias para el control de las infecciones humanas de tipo bacteriano y parasitario, entre otras.
La incidencia global de una enfermedad transmisible como la malaria, que anualmente afecta a entre 200 y 500 millones de personas, causando la muerte a entre dos y tres millones de ellas -principalmente niños menores de cinco años en los países pobres- (1), requiere soluciones prontas basadas, por una parte, en el descubrimiento de nuevos agentes terapéuticos para el control de las cepas emergentes del Plasmodium resistentes a los antimaláricos convencionales y, por otra, en el desarrollo de nuevas y más potentes vacunas para prevenir esta enfermedad. La obtención de nuevas y más potentes vacunas contra la malaria, así como el descubrimiento de nuevos agentes terapéuticos basados en agentes de tipo no peptídico o proteico, posibilitarán cambiar o modificar los patrones y las estrategias terapéuticas tradicionales para el manejo y control de este tipo de enfermedades y, en consecuencia, alterar los patrones de diseminación normales en el mundo de las mismas. El estudio de las tradiciones culturales y etnobotánicas Latinoamericanas está consolidándose progresivamente como un componente de gran importancia en el descubrimiento de nuevos fármacos.
Las plantas del género Peltostigma pertenecen a la tribu Zanthoxyleae (Rutaceae: Rutoideae), que incluye a la subtribu Choisyinae. Este género está conformado por tres especies: P. exinium, P. parviforum y P. ptelioides, cuya principal característica son sus grandes flores de agradable aroma. Los programas de colección botánica desde Colombia hasta Costa Rica permitieron el descubrimiento de la Peltostigma, una especie relativamente nueva que difiere de las reportadas anteriormente debido a sus hojas sencillas y de flores más pequeñas (2, 3).
]]> En este trabajo reportamos el aislamiento y la identificación de siete alcaloides, una cumarina, un flavonoide, un lignano, dos terpenos y un derivado del ácido fenilacético a partir de los extractos etanólicos de madera y hojas. Con estos extractos se realizaron estudios preliminares de actividad antibacteriana y antiparasitaria contra Plasmodium falciparum in vitro.La actividad biológica de los compuestos aislados se ensayó in vitro empleando para ello cada extracto frente a microorganismos patógenos al humano y al ratón. Se emplearon dos cepas de bacterias gram positivas (Staphylococcus aureus ATCC 6538 y Enterococcus faecalis ATCC 29212) y dos cepas de bacterias gram negativas (Salmonella typhimurium ATCC 14028s) y MS 7953. La actividad contra el Plasmodium falciparum se evaluó frente a la cepa FCB-2 de este patógeno causante de malaria humana.
MATERIALES Y MÉTODOS
Material vegetal
El material analizado corresponde a extractos de hojas y madera de Peltostigma guatemalense (Rutaceae), recolectada en febrero de 1999 en la región de San Luis (Río Claro Antioquia) por el botánico álvaro Cogollo Pacheco. Una muestra de este material se mantiene en el herbario de la Fundación Jardín Botánico Rafael Uribe Uribe en la ciudad de Medellín (Colombia), codificado con el número 24509.
Extracción, aislamiento e identificación de los compuestos
A partir de las hojas secas y maceradas (2.750 g) y mediante el uso de la metodología convencional utilizada en Productos Naturales Vegetales, se aislaron e identificaron los siguientes compuestos: skimmianina (4) -8 mg-, γ-fagarina (5) -14 mg-, 7-isopentiloxiγ-fagarina (5) -11 mg-, gardenina B (6) -190 mg-, lupeol (4) -1.024 mg- y sitosterol (4) -243 mg-; ácido fenilacético (7) -128 mg-, anhidroevoxina (5) -13 mg-, evoxina (5) -41 mg-, escopoletina (8) -92 mg-, p-hidroxibenzoato metilo (8) -117 mg-, kokusaginina (5) -125 mg-, 4-metoxi-1-metil-2-quinolona (5) -34 mg- y siringaresinol (8) -720 mg-.
Actividad biológica de los compuestos de Peltostigma guatemalense
Ensayos de actividad antibacteriana in vitro
La actividad antibacteriana de los extractos crudos de Peltostigma guatemalense y de sus compuestos purificados se probaron contra dos cepas bacterias gram positivas (Staphylococcus aureus ATCC 6538 y Enterococcus faecalis ATCC 29212), obtenidas del IBUN, Instituto de Biotecnología, Universidad Nacional de Colombia. También se probaron frente a dos cepas de bacterias gram negativas (Salmonella typhimurium ATCC 14028s y MS 7953), gentilmente proporcionadas para este estudio por el doctor E. Groisman, Washington University, St. Louis, MO, USA.
]]> Las muestras se ensayaron para actividad antibacteriana mediante ensayos in vitro de difusión radial empleando una adaptación hecha de un ensayo semejante reportado previamente (9).Brevemente, una colonia de cada cepa bacteriana en ensayo se inoculó en 2 mL de medio de cultivo líquido (caldo) durante toda la noche, a 37°C con agitación. Posteriormente se realizó un inóculo bacteriano de 200 a 500 µL en 25 a 50 mL de medio fresco; según el caso, se empleó tripticasa de soya (TSB) al 3% (w / v) o medio líquido de Luria Bertoni (LB) (Becton-Dickinson, Cockesville, MD, USA) con agitación a 37°C. Una vez cada microorganismo alcanzó la fase logarítmica de crecimiento entre 2,5 y 5 horas, el material se centrifugó a 10.000 rpm durante 10 minutos a 4°C. Seguidamente se realizaron dos lavados con una solución 10 mM buffer fosfato salino (PBS) pH 7.2 y el sedimento bacteriano se suspendió en 10 mL del buffer frío. Posteriormente se determinó la densidad óptica (DO) de cada suspensión a una longitud de onda de 620 nm y se cuantificó el crecimiento de cada cepa teniendo en cuenta la relación reportada de DO620 0.20 = 5 x 107 UFC / mL. En seguida se tomó un volumen equivalente a 1 a 4 x 106 UFC, el cual se adicionó a 14 mL de una suspensión precalentada que contenía 3 mg de medio TSB, agarosa de baja electroendoósmosis al 1% (w/v) (Sigma Chemical Co, Saint Louis, MO, USA) y Tween-20 al 0.02% (v/v) (Sigma Chemical Co, Saint Louis, MO, USA). Luego de que las bacterias se dispersaron homogéneamente, la suspensión de agar se sirvió en cajas plásticas de Petri (Nunc, Naperville, IL, USA) y se dejaron en reposo para dar lugar a una capa uniforme solidificada. Luego del enfriamiento, se realizaron perforaciones de 3 mm de diámetro sobre la mezcla homogénea agar-bacterias, empleando para ello un sacabocados de acero inoxidable. Luego se adicionaron las muestras a ensayar, incluidos los controles positivos y negativos, en volúmenes entre 5-10 µL por pozo. Las cajas se incubaron durante aproximadamente 3 horas a 37°C, para luego ser cubiertas con una capa constituida por un volumen aproximado de 10 mL de un medio enriquecido en nutrientes que permite su solidificación. Finalmente, luego de 12 a 16 horas de incubación a 37°C, se determinó el valor del diámetro de inhibición del crecimiento bacteriano causado por las muestras en prueba. Los controles del ensayo fueron los antibióticos estándar Kanamicina, Ampicilina y Tetraciclina para efectos de comparación y tamizado de las diferentes muestras. Luego de este tamizado por difusión radial, se seleccionaron aquellas muestras promisorias para evaluación de actividad antibacteriana mediante ensayos cuantitativos in vitro. Las zonas claras correspondieron en todos los casos a la inhibición del crecimiento bacteriano causadas por la muestra en prueba. El valor de las Unidades de Actividad (UA) se reportó de acuerdo con la relación de que por cada 0.1 mm de zona clara producida por la inhibición del crecimiento bacteriano es igual a 1 UA (3). Las muestras positivas seleccionadas mediante el ensayo de difusión radial se evaluaron con ensayos antibacterianos de tipo cuantitativo. Este ensayo es una modificación del primero para el cual se evaluó el crecimiento continuo de 10.000-1 x 106 UFC durante el tiempo de incubación a 37°C de cada cepa bacteriana en presencia o ausencia de los controles y muestras en prueba. La inhibición del crecimiento bacteriano se calculó como porcentaje (%) de inhibición de crecimiento = 100 x (DO620 bacterias totales - DO620 medio) - (DO620 muestra en prueba - DO620 blanco) / (OD620 bacteria totales - DO620 blanco).
Ensayos in vitro de actividad antiparasitaria contra Plasmodium falciparum
Las muestras también fueron evaluadas por su actividad antiparasitaria contra Plasmodium falciparum mediante el empleo de un ensayo reportado previamente (10).Para tal efecto, se empleó la cepa de malaria humana FCB-2 del Plasmodium falciparum en un cultivo rico en nutrientes y de glóbulos rojos humanos del grupo sanguíneo O Rh (+).
Brevemente, el ensayo antiparasitario contra el Plasmodium falciparum se realizó por infección normal de glóbulos rojos humanos con parásitos de la malaria en estadio de anillo, hasta llegar a una parasitemia > 5%. En seguida se realizó la sincronización de esta infección en cultivo con el objeto de estabilizar una población estadio-específica del parásito, empleando para ello sorbitol e incubación en medio de cultivo celular RPMI-1640 suplementado con buffer Hepes 25 mM, hipoxantina 1 mg/mL, gentamicina 40 µg/mL, penicilina 5 U/mL, glucosa 2 g/L, NaHCO3 5 % y plasma humano O + al 10%.
Una vez los parásitos alcanzaron el estadio esquizonte, se distribuyeron cuantitativamente en una caja para cultivo celular de 96 pozos previamente servida con las muestras a analizar. El volumen final por pozo fue de 100 µL, con un hematocrito de 1,5% y 0,3% de parasitemia. Todas las muestras se ensayaron por triplicado y se incubaron durante 18 horas a 37°C, en una atmósfera de CO2 al 5%, O2 al 5% y N2 al 90%. Posteriormente, las cajas se centrifugaron, las células se cosecharon y de cada sobrenadante del cultivo se retiraron 50 µL, siendo reemplazados por 100 µL de una suspensión de leche descremada con una concentración de 15 µg/mL de hidroetidina. Seguidamente se incubaron durante otros 30 minutos a 37°C y posteriormente se realizaron lavados con PBS. El sedimento obtenido se resuspendió en 300 µL PBS y esta suspensión celular se vertió en tubos de poliestireno con el objeto de cuantificar los porcentajes de parasitemia en cada muestra mediante la técnica de citometría de flujo, en un equipo FACScan (Becton Dickinson, San José, CA, USA). La secuencia de eventos se registró y analizó empleando el programa Cell Quest del mismo fabricante. La cantidad de glóbulos rojos parasitados se cuantificó por análisis de cuadrantes. Los glóbulos rojos normales y los parasitados por el Plasmodium falciparum en presencia de una concentración de EGTA 15 µg/mL se emplearon como los controles negativo y positivo del ensayo, respectivamente. La inhibición de la invasión del parásito a los glóbulos rojos se calculó mediante la relación: % I I = (% parasitemia del control - % parasitemia de la muestra) / (% parasitemia del control) multiplicado por 100.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Actividad antibacteriana de los compuestos aislados de Peltostigma guatemalense
Ensayo cualitativo de difusión radial
Se analizaron extractos crudos obtenidos de hojas y madera de la Peltostigma guatemalense mostrando perfiles de actividad contra bacterias, como se observa en la Tabla 1, siendo los extractos provenientes de las hojas mucho más activos. Algunos de los extractos obtenidos mostraron propiedades antibacterianas luego de ser fraccionados por reparto en solventes; por ejemplo, el extracto en cloroformo de hojas fue activo contra los dos tipos de cepas de bacterias ensayadas tanto gram positivas como gram negativas. El extracto obtenido en acetato de etilo a partir de las hojas de la Peltostigma guatemalense, así como el extractos de la madera de esta planta obtenidos en éter de petróleo, éter etílico y en fase acuosa, no presentaron actividad contra ninguna de las cepas bacterianas.
]]>Ensayo cuantitativo de actividad antibacteriana
El ensayo cuantitativo de actividad antibacteriana se realizó empleando los extractos crudos que fueron positivos en los ensayos de tamizado cualitativos realizados por la técnica de difusión radial. Los extractos obtenidos por fraccionamiento del extracto total etanólico a partir de las muestras de Peltostigma guatemalense, mediante fraccionamiento por reparto con solventes de polaridad creciente, también fueron evaluados, como se puede observar en la Tabla 2. Los compuestos puros aislados de los diferentes extractos también fueron sometidos a análisis antimicrobianos, como se describió en la sección de materiales y métodos. Las densidades ópticas (DO) se midieron a una longitud de onda de 620 nm a diferentes tiempos, 0, 5 y 24 horas luego de iniciarse la prueba. Un valor superior a 25% de inhibición del crecimiento bacteriano se consideró como estadísticamente significativo. No fue posible detectar actividad inhibitoria alguna del crecimiento bacteriano para algunas de las muestras ensayadas debido a interferencias producidas por el desarrollo del color propio de las mismas, por lo que fueron reportadas como ND (actividad no detectada o determinada).
Como puede observarse en la Tabla 2, los extractos etanólicos de corteza y madera no tuvieron efecto alguno en el crecimiento de ninguna de las cepas bacterianas analizadas, mientras que el extracto etanólico de hojas inhibió significativamente el crecimiento de Enterococcus faecalis en un 41.84 ± 1.25% luego de 24 horas. Este hecho sugiere la presencia de algún componente activo en este extracto responsable de la actividad antibacteriana. El extracto acuoso obtenido de la madera inhibió el crecimiento de la misma cepa bacteriana en un 38.64 ± 1.28% luego de 5 horas de comenzado el ensayo, pero no se observó efecto alguno posterior a este tiempo, probablemente debido a un efecto temporal de tipo bacteriostático. Un comportamiento semejante presentó el extracto obtenido en acetato de etilo a partir de las hojas, inhibiendo el crecimiento bacteriano del Enterococcus en un 29.54 ± 1.32% sólo a las 5 horas de la prueba. No se encontró evidencia de actividad contra las cepas de bacterias gram negativas en ninguno de estos extractos.
Como se observa en la Tabla 3, los compuestos puros aislados de los extractos previamente estudiados mostraron una actividad inhibitoria diferencial contra todo el grupo de cepas bacterianas analizadas. La Gardenina B inhibió pobremente el crecimiento de las cepas de bacterias gram negativas, mientras que mostró una capacidad inhibitoria específica contra la cepa gram positiva de Staphylococcus aureus en un 44.64 ± 1.12% 24 a las horas del ensayo. El p-hidroxibenzoato de metilo, por el contrario, mostró cierta preferencia de actividad inhibitoria por las bacterias gram negativas, registrando valores de inhibición moderados de 20.32 ± 1.23% y 39.64 ± 1.44% a las 24 horas del ensayo frente a las cepas de Salmonella typhimurium.
Fue posible confirmar que los extractos de la Peltostigma guatemalense tuvieron una actividad antibacteriana moderada, como se observa en los ensayos de actividad cuantitativa del crecimiento bacteriano. Se demostró también un incremento en la actividad inhibitoria específica de los compuestos puros aislados de los extractos iniciales.
Actividad antiparasitaria contra Plasmodium de los compuestos asilados de Peltostigma guatemalense.
En este ensayo se observó que algunos de los extractos crudos obtenidos fueron capaces de inhibir el proceso de invasión in vitro del parásito de la malaria humana causada por el Plasmodium falciparum a glóbulos rojos humanos, incluso a concentraciones de 35 ppm. Los extractos acuosos de madera de Peltostigma guatemalense mostraron los valores de actividad más bajos respecto a los demás extractos analizados, como se observa en la Figura 1.
Los datos observados en la Figura 1 revelan que los extractos etanólicos de madera y el extracto obtenido en éter etílico de las hojas fueron capaces de inhibir la invasión del Plasmodium falciparum en los glóbulos rojos, incluso a concentraciones de 35 ppm. Los datos observados en la Figura 2 muestran que los compuestos 4-metoxi- 1-metil-2-quinolona y p-hidroximetilbenzoato de metilo, respectivamente, inhibieron el proceso de invasión del parásito de la malaria a glóbulos rojos humanos, mientras que los compuestos kokusaginina, 7-isopentiloxi-γ-fagarina y anhidroevoxina (alcaloides de tipo furoquinolínico, inhibieron este proceso infectivo in vitro de una manera dependiente de la dosis. La gardenina B mostró un efecto efectivo pero moderado respecto a este proceso infeccioso. Este compuesto se encuentra frecuentemente en plantas de la familia Rutaceae, pero rara vez aparece en plantas del género Peltostigma.
De acuerdo con los resultados obtenidos, 6 de los 12 compuestos aislados ensayados presentaron una fuerte actividad antiparasitaria contra el Plasmodium falciparum in vitro, incluso a una concentración de 35 ppm.
]]> El patrón de metabolitos secundarios encontrados en la especie colombiana de Peltostigma guatemalense confirmó que este grupo pertenece a la familia Rutaceae, como se había propuesto taxonómicamente (11).Estudios fitoquímicos para esta nueva especie de Rutaceae demuestran de esta manera que esta especie tiene una tendencia a expresar un patrón molecular de metabolitos secundarios normalmente encontrados en esta familia.
AGRADECIMIENTOS
Este trabajo fue financiado por las siguiente entidades: Instituto Colombiano para el Desarrollo de la Ciencia y la Tecnología Francisco José de Caldas - COLCIENCIAS, European Economical Community y el Departamento de Química de la Universidad Nacional de Colombia. Deseamos expresar nuestra gratitud al profesor Manuel Elkin Patarroyo por sus valiosos aportes a este trabajo, así como a los grupos funcionales de investigación de la Fundación Instituto de Inmunología de Colombia, FIDIC.
REFERENCIAS
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