Artículo de Investigación
Actividad citotóxica y leishmanicida in vitro del aceite esencial de manzanilla (Matricaria chamomilla)
In vitro leishmanicidal and cytotoxic activities of Matricaria chamomilla essential oil
Yesmit Karina Ríos R.1, Astrid Carolina Otero J.1, Diana Lorena Muñoz H.2, Mónica Echeverry R.2, Sara María Robledo R.2, Maira Alejandra Yepes C.3
1 Estudiante Programa de Bacteriología y Laboratorio Clínico. Universidad de Santander, UDES, Cúcuta. Contribución por igual con el artículo.
2 Universidad de Antioquia, Programa de Estudio y Control de Enfermedades Tropicales, PECET. Carrera 53 # 61-30, Teléfono: (4) 219 6502. Fax: (4) 219 6511. Medellín, Colombia. Correo electrónico: sara_robledo@pecet-colombia.org; srobledo@guajiros.udea.edu.co
3 Universidad de Santander, UDES, Cúcuta.
Recibido para evaluación: agosto 11 de 2008 Aceptado para publicación: noviembre 10 de 2008
RESUMEN
]]> Este estudio describe la evaluación de las actividades citotóxica y leishmanicida del aceite esencial de Matricaria chamomilla, una planta conocida como "manzanilla" a la que se le atribuye una variedad de usos en la medicina tradicional. La actividad del aceite esencial se evaluó in vitro contra amastigotes axénicos de L. (V) braziliensis, a concentraciones menores o iguales que 250µg/ml, y amastigotes intracelulares de L. (V) braziliensis y L. (V) panamensis, a concentraciones menores o iguales que 30µg/ml. Por su parte, la actividad citotóxica se evaluó contra células mamíferas de la línea promonocítica humana U-937, a concentraciones por debajo de 1,0 mg/ml. El aceite esencial de manzanilla mostró ser activo contra amastigotes intracelulares de L. (V) panamensis y L. (V) braziliensis (CE50 de 2,87 y 10,30µg /ml, respectivamente). Aunque el aceite esencial de manzanilla también mostró ser potencialmente tóxico para las células mamíferas (CL50 de 30,21µg /ml), esta toxicidad fue similar a la mostrada por la Anfotericina B (CL50 de 31,39µg /ml). El aceite esencial de manzanilla no mostró actividad contra las formas axénicas de L. (V) braziliensis, demostrando la importancia del metabolismo del compuesto en el interior de la célula para que se produzca el metabolito activo contra el parásito. Estos resultados aportan bases para sugerir que el aceite esencial de manzanilla tiene potencial para el desarrollo de medicamentos contra Leishmania, el cual debe ser validado en estudios futuros in vivo en modelos animales.Palabras clave: Matricaria chamomilla, actividad leishmanicida, citotoxicidad, manzanilla, productos naturales, L. (V) panamensis, L. (V) braziliensis.
ABSTRACT
This study describes the evaluation of cytotoxic and leishmanicidal activities for Matricaria chamomilla essential oil. M. chamomilla is a plant commonly named "manzanilla" that has many uses in traditional medicine. The activity of essential oil was evaluated in vitro against axenic amastigotes of L. (V) braziliensis at concentrations lower than or equal to 250µg/ml and intracellular amastigotes of L. (V) braziliensis and L. (V) panamensis at concentrations lower than or equal to 30µg/ml. On other hand, the cytotoxic activity was assessed against mammalian cells of the promonocytic human cell line U937 at concentrations below 1.0mg/ml. The essential oil of M. chamomilla showed activity against intracellular amastigotes of L. (V) panamensis and L. (V) braziliensis (EC50 of 2.87 and 10.30µg/ml, respectively). Although the essential oil of M. chamomilla also shown to be potentially toxic to mammalian cells (LC50 of 30.21µg ml) this toxicity was similar to that shown by Amphotericin B (LC50 of 31.39µg/ml). This essential oil showed no activity against axenic forms of L. (V) braziliensis suggesting the importance of the compound metabolism inside cells to produce the metabolite that would be active against parasites. These results suggest that the essential oil of M. chamomilla has potential for development of drugs anti- Leishmania that must be validated in future studies in vivo using animal models.
Key words:Matricaria chamomilla, leishmanicidal activity, citotoxicity, chamomile, natural products, L. (V) panamensis, L. (V) braziliensis.
INTRODUCCIÓN
La leishmaniasis es considerada un problema de salud pública en los países donde la enfermedad es endémica, incluido Colombia. La enfermedad es producida por al menos 20 especies de protozoos del género Leishmania y se manifiesta en tres formas clínicas principales que son: la leishmaniasis cutánea, la leishmaniasis mucocutánea y la leishmaniasis visceral. L. (V) braziliensis y L. (V) panamensis son dos de las especies más frecuentemente aisladas en Colombia causantes de las formas cutánea y mucocutánea de la enfermedad (1).
Para el tratamiento de la infección en cualquiera de las formas clínicas se utiliza el antimoniato de meglumina (Glucantime), una sal derivada de antimonio pentavalente (SbV) que, a pesar de presentar inconvenientes como toxicidad moderada, administración a altas dosis y esquemas prolongados, se continúa utilizando como medicamento de primera línea. Sin embargo, la diferente sensibilidad de las especies de Leishmania infectante y la aparición de resistencia en el parásito a los SbV inciden, además, en la respuesta clínica al tratamiento (2).
La pentamidina y la Anfotericina B son medicamentos de segunda línea y se emplean en pacientes que no responden al tratamiento con antimonio pentavalente. La pentamidina, por excretarse en forma prolongada, permite, a diferencia de los SbV, su administración en días alternos, pero tiene el inconveniente de ser más tóxica y más costosa que el SbV (3). Por su parte, la Anfotericina B es muy efectiva para cualquiera de las formas clínicas, pero debido a su toxicidad se requiere una administración intrahospitalaria. Aunque existe una formulación liposomal de Anfotericina B menos tóxica (4), su costo es mayor, lo que dificulta su consecución, especialmente en países en vías de desarrollo, donde la leishmaniasis es endémica y los gobiernos subsidian los tratamientos, como es el caso de Colombia.
La necesidad de encontrar medicamentos que superen las desventajas que ofrecen los que están disponibles en el mercado sustenta la búsqueda y el desarrollo de nuevos compuestos para el tratamiento de la enfermedad. Los productos naturales o compuestos derivados de ellos proporcionan una fuente valiosa de medicamentos gracias al contenido de numerosas moléculas con una variedad de actividades farmacológicas (5). La inmensa diversidad química y el amplio rango de actividades biológicas de las plantas han permitido el desarrollo de miles de drogas farmacológicas. Es así como en los últimos 25 años, de 1010 nuevas sustancias aprobadas para el manejo clínico de diferentes enfermedades, 490 (48,5%) son de origen natural (6).
]]> Miembros de la familia Asteraceae, los cuales han demostrado diferentes actividades biológicas, han sido utilizados para propósitos medicinales por diferentes comunidades en el mundo. Matricaria chamomilla (Asteraceae), conocida popularmente como "manzanilla", ha sido utilizada como planta medicinal desde hace siglos por sus propiedades relajantes, sedantes, antiespasmolíticas, antiinflamatorias, cicatrizantes, digestivas, entre otras (7 y 8). La planta ha demostrado, además, actividad antimicrobiana in vitro contra Pseudomona auriginosa, Candida albicans y Staphylococcus aureus (9). El extracto crudo hidroalcohólico de M. chamomilla es capaz de inhibir el crecimiento in vitro de promastigotes y amastigotes axénicos de L. (L) amazonensis en 98,1 y 92,7%, respectivamente (10). Las generalidades de M. chamomilla se resumen en la Tabla 1.
El aceite esencial de manzanilla es un ingrediente popular en tópicos de salud y de belleza por sus efectos calmante y antiinflamatorio sobre la piel (11). Debido al amplio uso del aceite esencial de manzanilla, en el presente estudio se evaluó el potencial citotóxico y contra Leishmania de este aceite. La actividad contra Leishmania se determinó in vitro contra amastigotes axénicos de L. (V) braziliensis y contra amastigotes intracelulares de L. (V) braziliensis y L. (V) panamensis. La actividad citotóxica se evaluó en células promonocíticas humanas U-937.
METODOLOGÍA
Aceite esencial de M. chamomilla
El aceite esencial de manzanilla se adquirió de Essential Wholesale (Clackamas, OR, USA). Para las evaluaciones de citotoxicidad y actividad contra Leishmania, el aceite esencial se solubilizó en Polivinilpirrolidona (PVP). Las diluciones del aceite solubilizado se hicieron en el medio de cultivo a emplear en los respectivos ensayos, es decir, RPMI 1640 o medio de Schneider, según el caso.
Evaluación in vitro de la citotoxicidad
La actividad citotóxica del aceite esencial de manzanilla se evaluó sobre la línea celular promonocítica humana U-937 (ATCC CRL 1593.2) siguiendo la metodología descrita previamente por Weniger y col, 2001 (12). Para ello, las células se cultivaron a una concentración de 100.000 células/ml en medio RPMI 1640 con 10% de suero bovino fetal (SBF), en platos de 96 pozos para cultivo celular. Se realizaron seis diluciones dobles seriadas del aceite esencial de manzanilla a partir de 1,0 mg/ml. De la misma manera, se hicieron diluciones de Anfotericina B a partir de 0.1 mg/ml. Este medicamento se usó como control de toxicidad. También se utilizaron células cultivadas en ausencia de los compuestos, pero mantenidas en las mismas condiciones, como control negativo del ensayo.
Las células en presencia de las diluciones de cada compuesto se incubaron a 37°C con 5% de CO2 durante 72 horas. Luego de las 72 horas de incubación, el efecto de los compuestos se determinó midiendo la actividad de la deshidrogenasa mitocondrial, adicionando 10µl/pozo de MTT (bromuro de 3-(5,4 dimetil tizol-2-I) -2-5 difenil tretrazolium) e incubando a 37°C durante 3 horas. Después de este tiempo se adicionaron 100µl/pozo de una solución al 50% de isopropanol y 10% de SDS, para solubilizar los cristales de Formazán. La producción de Formazán se midió a 570 nm en un lector de microplatos, 30 minutos después de la adición de la solución isopropanol-SDS.
]]> Cada concentración del compuesto (los medicamentos), así como del control sin compuesto se evaluó por triplicado en tres experimentos diferentes. Los resultados se expresaron como la Concentración letal 50 (CL50), que correspondió a la concentración a la cual ocurrió el 50% de muerte celular. La CL50 se calculó por el análisis Probit, un método paramétrico de regresión lineal que permite el análisis de la relación dosis-respuesta (13).Evaluación in vitro de la actividad contra Leishmania
El efecto del aceite esencial de manzanilla se evaluó sobre amastigotes axénicos de L. (V) braziliensis y sobre amastigotes intracelulares de L. (V) panamensis y L. (V) braziliensis.
Amastigotes axénicos. La actividad leishmanicida se evaluó en amastigotes axénicos de L. (V) braziliensis (M/HOM/87/UA301) mediante el método MTT. Los amastigotes axénicos se cultivaron a una concentración de 1.000.000 parásitos/ml en medio Schneider pH 5.4 con 20% de SBF, en platos de 96 pozos para cultivo celular. Se realizaron seis diluciones dobles seriadas del aceite esencial de manzanilla, a partir de 250µg/ml. De la misma manera, se hicieron diluciones de Anfotericina B a partir de una concentración de 0,25µg/ml, medicamento que se utilizó como control de efectividad en el ensayo. Parásitos cultivados en ausencia de los compuestos, pero mantenidos en las mismas condiciones, fueron utilizados como control negativo del ensayo.
Los parásitos cultivados en presencia de las diluciones del aceite esencial y de la Anfotericina B se incubaron a 32°C con 5% de CO2 durante 72 horas. Luego de las 72 horas de incubación, el efecto de los compuestos se determinó midiendo la actividad de la deshidrogenasa mitocondrial, adicionando 20µl/pozo de MTT e incubando a 32°C durante 4 horas. Después de este tiempo, se adicionaron 100µl/pozo de una solución al 50% de isopropanol y 10% de SDS, y la producción de Formazán se midió a 570 nm en un lector de microplatos, 30 minutos después de la adición de la solución isopropanol-SDS.
Cada concentración del compuesto (los medicamentos), así como el blanco, se evaluó al menos por duplicado en tres experimentos diferentes. Los resultados se expresaron como la Concentración Efectiva 50 (CE50), que corresponde a la concentración a la cual ocurre el 50% de muerte de los parásitos. La CE50 se calculó por el análisis Probit, como se describió previamente.
Sobre amastigotes intracelulares. La efectividad del aceite esencial de manzanilla se evaluó sobre amastigotes intracelulares de L. (V) braziliensis (MHOM/CO/87/UA/ UA301) por análisis al microscopio de placas teñidas con Giemsa y amastigotes intracelulares de L. (V) panamensis (M/HOM/88/UA140pirGFP), por citometría de flujo. Puesto que en las infecciones in vitro los índices de infección son dependientes de la proporción parásito:célula empleada, para cada una de estas especies de Leishmania se determinó la Concentración Infectiva 50 (CI50), al infectar 1x105 células/ml con diferentes proporciones de parásito:célula (1:1, 5:1, 10:1, 20:1, 40:1 y 80:1). La CI50 que corresponde a la proporción de parásitos con la cual ocurre el 50% de infección de las células fue calculada por el análisis Probit (13).
Para L. (V) braziliensis se siguió el protocolo descrito por Robledo y col (1999) (14) con algunas modificaciones. Se prepararon células U-937 a una concentración de 1x105 células/ml de medio RPMI 1640 y 100ng/ml de Forbol 12-miristato 13-acetato (PMA). En cada pozo de una placa para cultivo celular de 24 pozos se dispensó 1 ml de células y se incubaron a 37°C con 5% CO2. Luego de 48 horas de incubación, las células adheridas se infectaron con promastigotes en fase estacionaria de crecimiento (sexto día de crecimiento), en una proporción de 25 parásitos por cada célula, que corresponde a la CI50 calculada previamente para esta cepa de L. (V) braziliensis.
Las células en contacto con los parásitos se incubaron durante 2 horas a 34°C con 5% de CO2. Después de este tiempo, se realizaron dos lavados con solución tampón de fosfatos (PBS) para eliminar los parásitos libres, se adicionó un medio nuevo y se incubaron nuevamente durante 24 horas. Luego se reemplazó el medio por uno más fresco que contenía las diferentes concentraciones del aceite esencial de manzanilla. Las células infectadas se expusieron a cada concentración del aceite durante 72 horas y se lavaron tres veces con PBS. Para la tinción, las células se dejaron secar a temperatura ambiente, se fijaron con metanol y se colorearon con Giemsa. Después de lavar con agua destilada, los pozos se dejaron secar y las láminas adheridas al fondo se desprendieron y se depositaron en una lámina portaobjetos para proceder con la lectura al microscopio. Se contaron al menos 100 células (infectadas y no infectadas), registrando el número de amastigotes contenidos en cada una de las infectadas. Como control de infección del ensayo, se utilizaron células infectadas y cultivadas en ausencia de los compuestos, pero mantenidas en las mismas condiciones. Los resultados se expresaron como la CE50 calculada por el análisis Probit (13).
Para la evaluación con L. (V) panamensis se prepararon células U-937 a una concentración de 3x105 células/ml de medio RPMI 1640 y 100 ng/ml de Forbol-12-miristato Acetato (PMA). En cada pozo de una placa para cultivo celular de 24 pozos se dispensó 1 ml de la suspensión de células y se incubaron a 37°C con 5% CO2. Luego de 48 horas de incubación, las células adheridas se infectaron con promastigotes en fase estacionaria de crecimiento (cosechados al quinto día de crecimiento), en una proporción de 15 parásitos por cada célula, que corresponde a la CI50 determinada previamente para las infecciones con esta cepa de L. (V) panamensis.
]]> Las células con los parásitos se incubaron durante 2 horas con 5% de CO2 a 34°C. Luego de dos lavados con PBS para eliminar los parásitos libres, se adicionó un medio nuevo y las células se incubaron de nuevo. Después de 24 horas de incubación, se reemplazó el medio por uno más fresco que contenía las diferentes concentraciones del aceite esencial de manzanilla. Células infectadas y cultivadas en ausencia de compuestos sirvieron como control de infección. Las infectadas se expusieron a cada concentración del aceite durante 72 horas; posteriormente, se removieron cuidadosamente del fondo del plato utilizando el émbolo de una jeringa y se analizaron por citometría de flujo. Las células se tiñeron con 5µl de anticuerpo anti-CD33 (un antígeno de membrana específico para la línea monocítica/mieloide (15) marcado con ficoeritrina (PE). El porcentaje de células infectadas (eventos CD33+, GFP+) y la carga parasitaria se analizó por citometría de flujo en 10.000 eventos. Los datos se procesaron con el programa WinMDI (Joe Trotter, Purdue University, USA). La CE50 se calculó según la reducción de la carga parasitaria, al dividir la intensidad de fluorescencia (IF) obtenida con el aceite esencial por la IF obtenida en ausencia de compuestos. La Anfotericina B se utilizó como medicamento de control de efectividad para ambos ensayos. Cada concentración del aceite esencial y del medicamento, así como el control sin medicamento, se evaluó por triplicado en dos experimentos diferentes. Los resultados se expresaron como la CE50 calculada por el análisis Probit, como se describió previamente. El índice de selectividad (IS) se calculó dividiendo la actividad citotóxica por la actividad leishmanicida (IS = CL50 / CE50).RESULTADOS Y DISCUSIÓN
En este estudio se demuestra que el aceite esencial de M. chamomilla (manzanilla) tiene actividad in vitro contra L. (V) braziliensis y L. (V) panamensis, las dos especies más prevalentes responsables de la leishmaniasis cutánea y mucocutánea en Colombia. Las actividades leishmanicidas y citotóxicas se establecieron según rangos de concentraciones previamente establecidos en nuestro laboratorio (Tabla 2). La evaluación de la actividad del aceite esencial de manzanilla sobre estas especies de Leishmania permitió demostrar que el compuesto es muy activo contra amastigotes intracelulares, tanto de L. (V) panamensis, como de L. (V) braziliensis, siendo L. (V) panamensis ligeramente más sensible que L. (V) braziliensis al aceite esencial de manzanilla, pero también a la Anfotericina B (Tabla 3). Si bien las diferencias pueden explicarse mediante el método de evaluación de la sensibilidad utilizado, es decir, citometría de flujo y microscopía, siendo la citometría de flujo un método automatizado y la microscopia un método de evaluación que está sujeto a la experiencia del evaluador, consideramos que las diferencias en sensibilidad se debe a diferencias inherentes al parásito, ya que cuando existen diferencias en sensibilidades in vitro éstas se han observado previamente aun entre cepas de una misma especie de Leishmania (14). Si tenemos en cuenta que un compuesto es muy activo cuando presenta CE50 cercanas o inferiores a 10µg/ml, las CE50 observadas de 2,87 y 10,30 µg/ml para L. (V) panamensis y L. (V) braziliensis, respectivamente, sugieren que el aceite esencial es muy activo contra estas especies de Leishmania. Esta mayor sensibilidad no es significativa, toda vez que la actividad se conserva en el mismo rango de sensibilidad esperado para compuestos activos (0-10µg/ml) (Tabla 2). Dada la cantidad de componentes constituyentes del aceite esencial de M. chamomilla (Tabla 1), cada uno de ellos con propiedades biológicas distintas, se hace necesario realizar estudios de actividad contra Leishmania con los componentes aislados para poder atribuir esta actividad a un componente en particular.
Resultados contrarios se obtuvieron cuando se evaluó la actividad del aceite esencial en la forma axénica de amastigotes de L. (V) braziliensis. En esta evaluación se encontró que el aceite esencial de manzanilla no es activo contra la forma axénica de amastigotes de L. (V) braziliensis con una CE50 de 230,24 µg/ml (Tabla 3). El hecho que el aceite esencial tenga actividad contra la forma intracelular, pero no contra la extracelular del parásito, sugiere que el compuesto, al ser liposoluble, sea internalizado por la célula y metabolizado por la misma, y que probablemente son los productos derivados de este metabolismo intracelular los responsables de la actividad del aceite esencial, haciéndolo más efectivo sobre la forma intracelular del parásito que sobre la axénica. Esta situación se observa en medicamentos como los antimoniales pentavalentes, los cuales son reducidos a antimoniales trivalentes en el interior del macrófago para que puedan ejercer su efecto leishmanicida (16 y 17). Sin embargo, debido a que no se dispone de información acerca del metabolismo celular de los distintos componentes del aceite esencial de M. chamomilla, es necesario realizar estudios futuros con el fin de determinar lo que sucede con el aceite luego de su ingreso en la célula.
El aceite esencial de manzanilla, por su parte, tuvo una actividad citotóxica similar a la mostrada por la Anfotericina B (CL50 de 30,21 y 31,39 µg/ml para el aceite esencial y la Anfotericina B, respectivamente). Teniendo en cuenta que CL50 inferiores a 100µg/ ml se consideran como potencial tóxico (Tabla 2), la CL50 obtenida para el aceite de manzanilla sugiere que este compuesto, al igual que la Anfotericina B, es tóxico para las células. La toxicidad mostrada por el aceite esencial de manzanilla posiblemente se debe a la presencia de fenoles, aldehídos y alcoholes como compuestos constituyentes importantes que pueden alterar la estructura celular (18 y 19).
El índice de selectividad (IS) del aceite esencial de manzanilla fue de 2,93 y 10,52 sobre amastigotes intracelulares de L. (V) braziliensis y L (V) panamensis, respectivamente, mientras que el índice de selectividad para amastigotes axénicos de L. (V) braziliensis fue menor a 1,0 (IS=0,14). (Tabla 4). El índice de selectividad observado para el aceite esencial de manzanilla indica que la actividad contra Leishmania del aceite sobre ambas especies es mayor que la actividad citotóxica observada sobre células U937. Si tenemos en cuenta que un IS > 10 es indicativo de actividad selectiva sobre el agente infeccioso (Tabla 2), nuestros resultados sugieren entonces que el aceite esencial de manzanilla tiene potencial como compuesto leishmanicida. Aunque el aceite esencial mostró ser potencialmente toxico para las células mamíferas con una CL50 de 30,21 µg/ml, la buena actividad contra Leishmania mostrada contra la forma intracelular del parásito sugiere que el compuesto tiene potencial como molécula candidata a medicamento. Sin embargo, este potencial debe ser validado en estudios in vivo, ya que existen mecanismos que pueden disminuir considerablemente la toxicidad del compuesto, como la manipulación de las moléculas activas, ya sea con liposomas o polímeros que permitan la reducción de la toxicidad celular. Un ejemplo de esto es la fórmula liposomal de la Anfotericina B, que por estar recubierta por una monocapa de naturaleza lipídica no sólo facilita la entrada del medicamento en la célula, sino que evita el daño que produciría la nfotericina libre al unirse a la membrana celular (20).
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En conclusión, los resultados del presente estudio aportan bases para sugerir que el aceite esencial de manzanilla posee potencial para el desarrollo de medicamentos contra Leishmania, el cual debe ser validado en estudios futuros in vivo con modelos animales. Estos resultados también sustentan el potencial de la medicina tradicional basada en plantas y otros productos naturales como fuente importante para el descubrimiento de nuevos fármacos que puedan utilizarse para el tratamiento de la leishmaniasis.
AGRADECIMIENTOS
Este trabajo fue financiado por COLCIENCIAS (Código No. 1101-00018-9999, 2006).
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