INVESTIGACIÓN ORIGINAL

LAS PROTEÍNAS β3 Y PDI AISLADAS DE PLAQUETAS HUMANAS SE UNEN CON EL ROTAVIRUS ECwt IN VITRO

β3 and PDI proteins isolated from human platelets bind with ECwt rotavirus in vitro

Diana Mayorga¹, Linda Rubio¹ Carlos A Guerrero-Fonseca², Orlando Acosta-Losada³

Antecedentes. En la actualidad, no se dispone de integrina β3 de manera comercial y la PDI comercial tiene costos muy altos, lo cual dificulta el acceso a estas dos proteínas para realizar estudios conducentes a establecer si β3 y PDI interactúan con cepas de rotavirus silvestres. Objetivo. Explorar una metodología que permitiese aislar las proteínas β3 y PDI a partir de plaquetas humanas para generar anticuerpos policlonales en conejo contra la integrina β3 y evaluar la interacción entre las proteínas PDI y β3 con el rotavirus ECwt.

Material y métodos. Mediante la técnica de electroforesis preparativa en condiciones reductoras, se separaron las proteínas de un lisado de plaquetas humanas y posteriormente se electroeluyeron. Mediante las técnicas de coinmunoprecipitación, "Western blotting" y ELISA de captura se analizó la interacción del rotavirus ECwt con las proteínas β3, y PDI.

Conclusión. Se logró purificar parcialmente a partir de plaquetas humanas, utilizando electroforesis preparativa, cantidades relativamente altas de proteína β3 y PDI. El aislamiento de estas proteínas nos permitió generar un anticuerpo policlonal contra β3 y establecer que β3 y PDI se unen in vitro, luego de incubar las proteínas aisladas con el rotavirus ECwt, e in vivo, después de incubar el rotavirus con las vellosidades aisladas del intestino delgado de ratón lactante de la cepa ICR.

Palabras clave: proteínas, plaquetas, rotavirus, electroforesis.

Mayorga D, Rubio L, Guerrero-Fonseca CA, Acosta- Losada O. Las proteínas β3 y PDI aisladas de plaquetas humanas se unen con el rotavirus ECwt in vitro. rev.fac.med. 2010; 58: 115-127.

Summary

Background. Commercial integrin β3 is currently not available and commercial PDI is too expensive, which is making access difficult to these proteins needed for conducting experiments aimed at the establishment of possible interactions between integrin β3 and PDI and wild type rotavirus strains.

Objective. To explore a methodology allowing isolation of proteins β3 and PDI from human platelets to be used as antigens in the generation of rabbit polyclonal antibodies useful in the assessment of interactions between these proteins and rotavirus ECwt.

Materials and methods. Proteins β3 and PDI from human platelet lysates were separated using preparative electrophoresis under reducing conditions and then eluted. Interactions of these proteins with rotavirus ECwt were analyzed using co-immunoprecipitation, Western blotting and capture ELISA.

Results. Proteins from human platelet lysates were separated by preparative electrophoresis under reducing conditions. The identification of proteins β3 and PDI present in a gel slice was performed through their reaction with commercial antibodies in a Western blotting analysis. Protein purity was established after electroelution from a gel slice. Polyclonal antibodies against protein β3 were generated in rabbit. Incubation of eluted proteins β3 and PDI with rotavirus ECwt showed in co-immunoprecipitation and ELISA assays that these proteins bound virus in vitro. The same binding was showed to occur when rotavirus was incubated with isolated small intestinal villi from suckling mice.

Conclusions. Relatively high amounts of proteins β3 and PDI were partially purified from human platelets by preparative electrophoresis. The isolation of these proteins allowed the generation of polyclonal antibodies against β3 in addition to the establishment of the in vitro interaction of proteins β3 and PDI with rotavirus ECwt. This interaction was also demonstrated in vivo after incubating the virus with isolated small intestinal villi from suckling mice.

Mayorga D, Rubio L, Guerrero-Fonseca CA, Acosta- Losada O. β3 and PDI proteins isolated from human platelets bind with ECwt rotavirus in vitro. rev.fac.med. 2010; 58: 115-127.

Los rotavirus constituyen la primera causa de gastroenteritis aguda en niños menores de cinco años, presentando la más alta frecuencia de hospitalizaciones entre los seis y los 24 meses de edad. La deshidratación ocasionada es la causa más significativa de muerte en los infantes de países en desarrollo, fluctuando la mortalidad a nivel mundial entre 454.000 y 705.000 (1, 2). Se considera que la infección es especifica de especie, dado que no se ha documentado la transmisión de rotavirus entre el hombre y animales; sin embargo, las cepas aisladas de humanos tienen una alta homología genética con las cepas aisladas de animales (3) y al co-infectar una célula con dos cepas distintas de rotavirus, la progenie viral resultante es una población de virus que contiene diferentes combinaciones de los diferentes segmentos genómicos parentales. Recientemente se introdujeron dos vacunas (RotaTeq, Rotarix) (2,4); sin embargo, el desarrollo de estas vacunas (virus vivos atenuados) ha suscitado algunos interrogantes sobre su costo, eficacia, seguridad (5) y riesgos de transmisión (6).

Los rotavirus pertenecen a la familia Reoviridae, carecen de cubierta lipídica (7,8) y contienen un genoma de dsRNA distribuido en 11 segmentos. Las proteínas estructurales (VP1-VP4, VP6 y Vp7) de la partícula viral se disponen en tres capas concéntricas (9-12). Las partículas virales con las tres capas proteicas concéntricas (TLPs) son infecciosas, mientras que aquellas no infecciosas poseen sólo dos capas (DLPs).

Se ha propuesto que el receptor funcional para rotavirus corresponde a un complejo de varias macromoléculas que incluye, entre otras, las integrinas avβ3 (13,14,15), a2b1 (16-20), axb2 (17,18) y la proteína de choque térmico HSC70 (14,21-24), presente en la superficie de células MA104. Recientemente, en un estudio realizado en nuestro laboratorio (25) se encontró que la proteína disulfuro isomerasa (PDI) también participa en los mecanismo de entrada de los rotavirus a células MA104, sugiriendo la existencia de posibles vías alternativas para la entrada de los rotavirus a diferentes células hospederas. Por otra parte, las plaquetas humanas expresan las integrinas aVβ3 y la aIIbβ3 en una buena cantidad (80.000 copias aproximadamente) (26). De igual forma, la proteína chaperona PDI, también se encuentra en buena cantidad sobre la membrana de las plaquetas y está implicada en la agregación plaquetaria (27).

En el presente trabajo nos propusimos examinar si la alta concentración de las proteínas β3 y PDI en plaquetas facilita su aislamiento a través de las técnicas de electroforesis preparativa y electroelución, con el objeto de obtener antígeno para generar anticuerpos contra la integrina β3 y utilizar la proteína PDI para estudiar posibles interacciones con la partícula del rotavirus ECwt. Adicionalmente, analizamos la interacción del rotavirus ECwt con integrina β3 y PDI de las vellosidades aisladas del intestino delgado de ratón lactante ICR.

Material y métodos

Animales, virus, anticuerpos y plaquetas

Se utilizaron ratones lactantes de 10-12 días de la cepa ICR obtenidos del bioterio del Instituto Nacional de Salud (Bogotá, Colombia) que se sacrificaron mediante el método de dislocación cervical (28). El rotavirus empleado fue la cepa ECwt o EDIM tipo silvestre de ratón, donada por el Dr. M. Franco del Instituto de Genética de la Pontificia Universidad Javeriana (Bogotá, Colombia).

Se usaron anticuerpos (Ac) comerciales policlonales contra las proteínas β₃ (SC6627, Santa Cruz) y PDI (SC17222. Santa Cruz). Se utilizaron anticuerpos policlonales anti-β3 generados en nuestro laboratorio (conejos), utilizando un antígeno β3 aislado de plaquetas, y contra proteínas estructurales del rotavirus ECwt. Las plaquetas vencidas fueron donadas por el Hospital la Samaritana (Bogotá, Colombia). Las bolsas con plaquetas se mantuvieron congeladas a -70°C y se descongelaron solo para su uso.

Aproximadamente 8.7 x 10¹⁰ plaquetas suspendidas en plasma (50 ml) se lisaron con RIPA (150 mM NaCl, Nonident-40 1%, DOC 0.5%, SDS 0.1%, 50 mM Tris-HCl, pH 8) a 37 °C por 20 min. El precipitado de 2760 x g fue descartado y el sobrenadante sometido a precipitación con polietilenglicol 8000 al 10% en agitación suave toda la noche. El precipitado se colectó a 13800 x g por 30 min y se resuspendió en buffer de Laemmli (15 ml) en condiciones reductoras y desnaturalizantes (0.065 M Tris-HCl, pH 6.8; 2% (p/v) SDS; 5% (v/ v) 2 beta-mercaptoetanol; 2 mM EDTA; 10% (v/ v) glicerol y 0.1% azul de bromofenol, seguido de incubación en agua hirviendo por 3 min), alternativamente, el precipitado en el mismo buffer no fue incubado en agua hirviendo.

Electroforesis SDS-PAGE

El sistema SDS-PAGE fue como se describió previamente (29). Tanto el gel de concentración (5%) como de separación (10%) se suplementaron con 1mM EDTA. La electroforesis se condujo a 20 mA por lámina de gel (8 x 7 x 0.75 cm). Los geles se tiñeron con azul de Coomassie G-260 al 0.15%. Para propósitos analíticos se aplicaron muestras (1, 2, 4, 8, 16 µl) del lisado de plaquetas al gel de 12 bolsillos. Para fines preparativos se utilizó un gel de un solo bolsillo con un de espesor de 1.5 mm.

Western blotting (WB)

Las proteínas de un segmento (0.5 cm de ancho) del gel se transfirieron a una membrana de PVDF previamente activada con metanol por 15 segundos. La transferencia se hizo en condiciones semi-secas a 32mA durante 10 horas o a 300 mA por 2 horas, según lo recomendado por el fabricante (minicamara BIORAD). La membrana se bloqueó con leche descremada al 5%, se agregó anticuerpo primario contra β3 o PDI (0.2 µg/ml, Santa Cruz). Como anticuerpo secundario se utilizó un conjugado con peroxidasa (0.1 µg/ml, Santa Cruz). Se visualizó con Luminol (Santa Cruz) o con Amino-etilcarbazol (AEC) (0.25 mg/ml) en buffer de acetato de sodio 50 mM, pH 5.2 y peroxido de hidrógeno al 0.04%. Las posiciones de las bandas identificadas de β3 o PDI en el "blot" fueron utilizadas para determinar los sitios de corte en el gel preparativo. Los segmentos de gel (0.5 cm) cortados fueron conservados a -20°C hasta su electroelución.

Electroelución

Los segmentos de gel se electroeluyeron en buffer (25 mM Tris, 192 mM glicina y SDS 0.1%) a 300 V durante cinco horas, a temperatura no mayor a 50 °C dentro de la cámara. La muestra electroeluida se recolectó para semi-cuantificarse en SDS-PAGE comparando con bandas de albumina de concentración conocida.

Producción del anticuerpo policlonal anti-β3

La proteína β3 electroeluida fue sometida nuevamente a electroforesis en gel en condiciones desnaturalizantes. La banda del gel correspondiente a la integrina β3 fue cortada, macerada en PBS e inoculada (1mg) cada 15 días, tres veces, vía subcutánea, a un conejo Nueva Zelanda. Quince días después de la última aplicación, el conejo se sacrificó. La sangre se mantuvo a de 37°C, por 30 minutos y luego se dejó toda la noche a 4°C. El suero recuperado se mezcló con glicerol 1:1 (v/v), con azida de sodio al 0.02% y se almacenó a -20°C hasta su uso.

Para estabilizar los grupos sulfidrilo de la integrina β3 y de PDI, se empleo la técnica de Lane (1978). Las proteínas fueron mezcladas con 1/3 de 0.06 M (v/v) Tris-HCl, pH 8.8, SDS 2%, 2 mM EDTA, glicerol 10% y 1/50 (v/v) de 0.25 M ditiotreitol recién preparado. Las muestras fueron hervidas durante tres minutos, enfriadas y mezcladas con 1/20 (v/v) de iodoacetamida 0.25M y mantenidas a 50°C por 15 minutos. Las proteínas fueron analizadas en SDS-PAGE como se indicó arriba.

Análisis de la unión in vitro de las proteínas electroeluidas β3 y PDI con el virus ECwt

Se incubó el electroeluido de β3 o PDI con TLPs de la cepa rotaviral ECwt, preincubada con tripsina (1µg/ml) toda la noche a 4°C. A cada uno de los complejos β3-ECwt o PDI-ECwt, se le adicionó anticuerpo policlonal anti-ECwt, generado en conejo en el laboratorio y se incubó 1 h a 37°C en agitación suave. Luego se adicionó proteína A-Sefarosa (Sigma, 5µl/100 µl) al complejo virus-proteína-anticuerpo. El inmunoprecipitado se lavó con PBS y fue analizado en SDS-PAGE y "Western blotting". A la membrana se le adicionó anticuerpo anti-PDI (0.2 µg/ml, Santa cruz) y anti-β3 generados en nuestro laboratorio (1:1000). Como anticuerpo secundario se empleó un conjugado con peroxidasa (0.1 µg/ml, Santa Cruz) y se reveló con Luminol (Santa Cruz) o AEC.

La interacción de β3 o PDI con TLPs se examinó también con ELISA de captura. Como anticuerpo de captura se utilizó anti-ECwt generado en cobayo (1:250). Se bloqueó con leche descremada al 5% y see adicionó el complejo ECwt-β3 o ECwt-PDI, en diferentes concentraciones. Como anticuerpo primario se utilizó anti- PDI o anti-β3 y como anticuerpo secundario un conjugado con peroxidasa (0.3 µg/ml, Santa Cruz). Se reveló con peroxidasa en buffer de citrato, utilizando el sustrato (OPD). Se leyó a 492 nm.

Aislamiento de vellosidades intestinales

Para la extracción de las vellosidades del intestino delgado de ratón lactante, se siguió el protocolo estandarizado y desarrollado en nuestro laboratorio (29). Brevemente, se sacrificaron los animales por dislocación cervical, se retiró el intestino, se lavó con medio de cultivo, se corto en fragmentos de 5mm y se extrajeron las vellosidades con 5 ml de MEM con antibiótico/ antimicótico y 1.5 mM EDTA. Las células se mantuvieron a 4°C hasta realizar la infección con rotavirus.

Evaluación de la unión in vivo de las proteínas integrina β3 y PDI en vellosidades intestinales con el virus ECwt

Para determinar la unión del rotavirus ECwt a PDI y β3 de las vellosidades aisladas del intestino delgado, el rotavirus se incubó durante 45 minutos a 4°C con las vellosidades, luego se incubaron las vellosidades a 37°C durante 0, 30 y 60 min e inmediatamente fueron lisadas con buffer RIPA modificado (150 mM NaCl, Nonident- 40 1%, DOC 0.5%, 2 mM de DTT, 1% Tritón X-100, 50 mM Tris-HCl, pH 8) y se incubaron a 37°C durante 1 hora. Se co-inmunoprecipitó adicionando anticuerpo policlonal anti-ECwt, se incubó 1 h a 37°C y se continuó como se describió antes.

Resultados

Mediante la técnica de electroforesis en condiciones reductoras, se separaron las proteínas a partir de un lisado de plaquetas. Para identificar las bandas del gel preparativo correspondientes a PDI y β3, un segmento del gel se cortó y con este se realizo un "Western blotting" (WB). En la figura 1A se observa un segmento del gel preparativo representativo, donde se aprecian las bandas identificadas por tinción con azul de Coomassie y en el WB se puede identificar las bandas obtenidas con Acs específicos contra β3 y PDI, con un peso molecular aproximado de 90 y 55 kDa, respectivamente. Con esta técnica las bandas se cortaron del gel preparativo y se guardaron congeladas a -20°C hasta su electroelución.

Las bandas recuperadas de los diferentes geles preparativos se electroeluyeron y los diferentes electroeluidos se analizaron por electroforesis en condiciones desnaturalizantes y reductoras con el objeto de determinar su pureza

Otro método utilizado para analizar la contaminación de los electroeluidos fue realizar una alquilación de las proteínas siguiendo el método de Lane. Como se observa en la figura 1C, los electroeluidos denominados PDI y β3 continúan presentando tres bandas: una prominente, a la altura de 55 kDa en el electroeluido denominado PDI, y una a la altura de 90 kDa en el electroeluido denominado β3. Sin embargo, las tres bandas se observan en todos los electroeluidos analizados, aunque varía la intensidad de cada una de las bandas.

Las bandas proteínicas que difieren de las masas moleculares esperadas (para cada una de las proteínas extraídas) puede deberse a una posible contaminación de otras proteínas, para el caso de las bandas relacionadas con PDI, o una degradación de estas durante el proceso de electroelución, en el caso de las bandas relacionadas con β3. Para diferenciar estas dos posibilidades, se realizo un "Western blotting", utilizándose, como anticuerpo primario anti-PDI y anti-β3 comerciales (0.2 ug/ml, Santa Cruz).

Como se muestra en la figura 2, de las proteínas electroeluidas pertenecientes a PDI, en el WB figura 2-B puede visualizarse 2 bandas de un peso molecular alrededor de los 55 kDa. Mientras que en el caso de las bandas relacionadas con β3, se observa, una única banda la cual posee una masa molecular aproximada de 90 kDa.

Posteriormente, se quiso observar la diferencia que existe en el reconocimiento del anticuerpo anti-β3 generado en conejo (utilizando como antígeno la proteína electroeluida de un segmento del gel preparativo) y el anticuerpo anti-β3 de origen comercial (Santa cruz). Como se observa en la figura 3 , el anticuerpo comercial reconoce una sola banda, mientras que el generado en el laboratorio reconoce varias bandas, aunque principalmente reconoce la banda del mismo peso molecular que la observada con el anticuerpo comercial figura 3B.

Como se observa en la figura 4-A, carril 2, en el electroeluido procedente del segmento denominado (antígeno) Ag PDI, el anticuerpo anti- β3 detecta una banda a la altura de PDI; mientras que en la figura 4-B, carril 1, el electroeluido del segmento denominado Ag β3, el anticuerpo anti-PDI no detecta banda alguna a la altura de 90 kDa, pero si una banda de 55 kDa que corresponde a PDI. Esto sugiere que el electroeluido denominado Ag β3 está contaminado con la proteína PDI. Igualmente sugiere que la fracción denominada Ag PDI no está contaminada con la proteína β3, por lo menos de manera evidente con esta técnica.

Las proteínas electroeluidas PDI y β3 se unen in vitro con el virus ECwt Para poder determinar si existe una unión de las proteínas electroeluidas β3 o PDI, con el rotavirus ECwt, se realizaron dos pruebas inmunoenzimaticas: inmunoprecipitacion y ELISA.

Para la inmunoprecipitacion se incubó PDI y/o β3 con TLPs de la cepa rotaviral ECwt (la cual se encontraba activada con tripsina) y luego se co-inmunoprecipitó con anticuerpo anti-rotavirus. Como se observa en la figura 5-A, el rotavirus ECwt co-inmunoprecipita con β3 y PDI, sugiriendo que estas proteínas se unen con el rotavirus en un sistema in vitro. Sin embargo en el carril 1 se observa una banda a la altura de 55 kDa que puede corresponder a PDI. Lo anterior es explicable si se tiene en cuenta que el electroeluido denominado β3 está contaminado con la proteína PDI. En la figura 5-B se mezclaron las dos proteínas con ECwt y se repitió el experimento. Esta figura muestra que el rotavirus se une con las proteínas cuando se encuentran "solas" o cuando se encuentran mezcladas.

Para determinar si el virus ECwt se une in vivo a las proteínas PDI y β3, el rotavirus se incubó durante 30 y 60 minutos a 37°C con vellosidades aisladas de intestino de ratones lactantes ICR. Transcurridos estos tiempos las células se lisaron con RIPA, después se co-inmunoprecipitó utilizando un anticuerpo anti-ECwt, luego proteína A-Sefarosa y se realizó un "Western blotting".

En la figura 7 se observan dos bandas de aproximadamente 90 y 55 kDa en los carriles que relacionan la coinmunoprecipitación luego de incubar las vellosidades con el virus durante 30 o 60 min, sugiriendo que el rotavirus ECwt se une in vivo a PDI y β3.

Para aislar y purificar β3 y PDI a partir de plaquetas, examinamos las condiciones de corrido por electroforesis SDS-PAGE, específicamente el grado de separación del componente proteico de las plaquetas. Como se puede observar en la figura 1, no hay una buena separación de proteínas de las plaquetas cuando se corren en condiciones reductoras sin hervir la muestra o reductoras hirviendo la muestra. Esto se puede deber a que las plaquetas tienen alto componente de azucares en las glicoproteínas necesarias para la adherencia en la formación del trombo.

Se conoce que las proteínas altamente glicosiladas muestran un patrón de corrido en forma de barrido o presentan diferentes pesos moleculares en diferentes corridos electroforéticos. Estos cambios se presentan porque la proteína pierde azúcares en el proceso de extracción, tiene diferente grado de glicosilación o se asocia de manera diversa entre las moléculas. Igualmente, el patrón de corrido puede alterarse cuando las proteínas presentan grupos sulfidrilo, a pesar de usar agentes reductores como el 2-beta-mercaptoetanol, dado que estas pueden reasociarse durante el corrido electroforético o no reducir todos los puentes de disulfuro. Este fenómeno puede presentarse aún cuando la muestra se hierve, en presencia de SDS y 2-beta-mercaptoetanol. β3 es una proteína altamente glicosilada e igualmente PDI y β3 son proteínas con una relativa abundancia de puentes disulfuro.

Lo anterior determina que las proteínas con estas características bioquímicas, cuando se aíslan a partir de electroforesis preparativa su pureza no sea buena y en términos generales sea más bien una purificación parcial. Dicha purificación parcial se evidencia en la figura 1, donde se analiza el electroeluido luego de alquilarlo. Esta técnica permite reducir permanentemente el azufre de los grupos tiol, al modificarlo de manera covalente. Esta contaminación también se evidencia en las figuraS 2-3-4 que muestran diferencia en el patrón de bandas de β3 reconocidas por los anticuerpos comerciales y el generado en el laboratorio a partir de la proteína β3 aislada en nuestro trabajo. Igualmente, se evidencia que el electroeluido denominado β3 está contaminado con PDI, aunque PDI, aparentemente, no está contaminada con β3, pero sí con otras proteínas como se observa en la figura 4.

Sin embargo, aislar proteínas por electroforesis preparativa permite obtener cantidades relativamente altas de proteína y de fácil separación, como se puede observar en las figuraS 2 Y 3, que muestra que los segmentos identificados, cortados del gel preparativo y electroeluidos contienen las proteínas β3 y PDI dado que éstas fueron identificadas por los anticuerpos comerciales El aislamiento de estas proteínas nos permitió establecer que β3 y PDI se unen in vitro con el rotavirus silvestre de ratón ECwt. Esta conclusión la obtenemos de la figura 5, dado que al incubar las dos proteínas de manera individual o como mezcla con el rotavirus se coinmunoprecipitan con el rotavirus. Esta unión se corrobora en la técnica de ELISA de captura luego de incubar las proteínas con el rotavirus y adicionar el complejo al anticuerpo adherido a la placa figura 6 . Otra técnica empleada para confirmar que hay unión entre el rotavirus y las proteínas β3 y PDI fue la co-inmunoprecipitación de β3 y PDI luego de incubar el rotavirus con las vellosidades aisladas del intestino delgado de ratón lactante de la cepa ICR. Esta unión in vivo figura 7 , confirma lo observado en la figura 5-6, descartando que dicho fenómeno sea un artefacto, en especial por la función de chaperona de PDI. La unión in vivo de PDI y β3 a la partícula rotaviral fortalece el modelo de ingreso de rotavirus a la célula hospedera que involucra la proteína VP7 de rotavirus y la integrina avβ3, así como la implicación de la PDI en el proceso de entrada del rotavirus a la célula (25).

Conclusión

El presente trabajo contribuye originalmente al aislamiento y purificación de cantidades adecuadas de las proteínas PDI y β3, útiles en el estudio de las interacciones del rotavirus con las moléculas de superficie de la célula hospedera. En forma particular, la interacción de PDI y β3 con las proteínas estructurales del rotavirus sugiere la participación de reacciones de óxidoreducción que actuarían sobre los enlaces de disulfuro con la consecuente inducción de cambios conformacionales en las proteínas virales. Disponer de cantidades apreciables de las proteínas facilitaría enormemente los estudios básicos de los mecanismos de entrada del rotavirus y la posibilidad de la interferencia terapéutica experimental de este proceso de entrada.

Agradecimientos

El soporte financiero para realizar este proyecto fue otorgado por la División de Investigación Bogotá (DIB) código 9082 Universidad Nacional de Colombia.

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