Introducción

El control biológico de los organismos que afectan la producción agrícola mundial ha tenido en los últimos años gran auge a causa de la nueva orientación ecológica y sustentable de la agricultura (Orr y Charles 1998). De esta forma, herramientas como los insecticidas de origen microbiano han sido involucradas como un elemento valioso dentro de los programas de manejo integrado de plagas (MIP) en diferentes cultivos (Lecuona 1996). Las bacterias son uno de los grupos más estudiados como agentes de control de plagas a nivel mundial, siendo Bacillus thuringiensis Berlier (B. t.) la más representativa (Lecuona 1996). Los productos desarrollados a base de B. t. representan entre el 80-90% del mercado internacional de bioplaguicidas (Van Frankenhuyzen 1993).

La mayoría de estudios con B. t, se enfocan al control de plagas del orden Lepidoptera; sin embargo, también se han desarrollado trabajos con insectos del orden Coleóptera y Díptera, lo cual ha ampliado las perspectivas de investigación y explotación comercial de esta bacteria (Keller y Langenbrunch 1993). A este respecto, dentro de los logros tecnológicos a nivel industrial se destacan productos desarrollados por multinacionales con la variedad de B. t. tenebrionis con actividad reconocida en insectos del orden Coleóptera y plantas transgénicas modificadas con genes de B. t. que expresan proteínas con actividad tóxica hacia coleópteros plaga (McPherson et ai. 1988).

Los modelos para el estudio del mecanismo de acción de B. t. han sido desarrollados utilizando diversas metodologías, principalmente estudios in u/tro, para determinar cada uno de los pasos que siguen las proteínas del cristal desde su ingestión hasta causar la muerte del insecto. Se han desarrollado estrategias como el empleo de intestinos aislados de insectos, que permite un sistema modelo para investigar la bioquímica del proceso de intoxicación en más detalle, separándolo de las complejidades presentes en el insecto intacto (Bravo eí al. 1992a,b). De otra parte, se han generado líneas celulares de insectos (principalmente lepidópteros) lo cual permite identificar los efectos moleculares primarios importantes para la toxicidad de las proteínas de 6. t. como unión a las proteínas receptoras y respuestas citotóxicas; así mismo, se han empleado vesículas obtenidas a partir de las microvellosidades de las células epiteliales del intestino del insecto, que corresponden a las membranas plasmáticas de las microvellosidades del lumen conocidas como BBMV, para estudios electro y quimicofísicos como transporte de iones y unión de las toxinas a las proteínas receptoras (Schwab y Culver 1990).

A pesar de que existen algunos inconvenientes en el uso de modelos in vitro, relacionados con modificaciones de las condiciones reales en las que actúan las 8 endotoxinas de Bt, dichas metodologías son herramientas importantes para un acercamiento al mecanismo de acción de tales proteínas, y específicamente el uso de las BBMV, se ha constituido en una de las técnicas más empleadas para estudios de unión toxina-receptor (Schnepf et ai. 1998).

En Colombia existe un número importante de plagas agrícolas del orden Coleóptera de impacto económico (Vélez 1997). Dentro de éstas, el gusano blanco de la papa Premnotrypes vorax Hustache, es una de las dos plagas más limitantes para este cultivo en el país. Dicho insecto ha permanecido como plaga principal de la papa desde hace más de 50 años cuando apareció en el departamento de Nariño y puede causar pérdidas en la producción de papa hasta de un 90% (Vélez 1997). Se encuentra distribuido en las principales zonas productoras de papa de los departamentos de Cundinamarca, Boyacá, Cauca, Caldas y Antioquia y su control se realiza empleando principalmente insecticidas altamente tóxicos (Rivera y Pinto 2001).

En Colombia se hace necesario realizar investigaciones que permitan desarrollar estrategias que se articulen en sistemas de manejo integrado para el control de esta plaga, minimizando el empleo de productos químicos que generan riesgo para la salud de productores y consumidores, teniendo en cuenta que este tubérculo es uno de los productos de mayor consumo en el país (Pinzón 1993). La implementación de estrategias de control biológico de plagas, como los entomopatógenos tipo B, thuringiensis, implica la realización de investigaciones básicas respecto de su mecanismo de acción para determinar la potencialidad de su empleo. Para el caso del gusano blanco de la papa esto también es válido.

De acuerdo con lo anterior el presente trabajo tuvo como objetivo determinar, mediante una metodología de ensayo in vitro, si existía unión de proteínas Cry de B. thuringiensis, referenciadas como tóxicas para coleópteros, con vesículas del tracto digestivo del gusano blanco de la papa para determinar de forma preliminar el potencial de algunas de estas proteínas para ser utilizadas en el desarrollo futuro de productos tecnológicos que puedan constituirse en nuevas herramientas dentro de un programa de manejo integrado del gusano blanco de la papa en Colombia.

Materiales y Métodos

Las proteínas Cry evaluadas se obtuvieron de cepas patrón de B. thuringiensis del Instituto de Biotecnología de la Universidad nacional de Colombia. Las características de las proteínas de las cepas evaluadas se presentan en la tabla 1.

Las cepas se cultivaron en medio agar Luria Bertani a 37°C por 10-15 días, hasta alcanzar un porcentaje de esporulación superior al 90%. La biomasa se recolectó y lavó con agua destilada-desionizada estéril y subsecuentes centrifugaciones a 4°C, 8.000 rpm por 10 minutos para eliminar residuos del medio de cultivo. El material obtenido fue posteriormente liofllizado durante 12 h y almacenado hasta su uso.

Se realizó purificación de las proteínas mediante solubilización de los cristales en solución buffer de carbonato de sodio pHIO (Na2CO3 100 mN, PMFS 100 mN, DTT 2 mN, EDTA 1 mN) por 2 h a 37°C, centrifugación a 10.000 rpm por 15 minutos y nitrado del sobrenadante con membrana de 0,22 mN. Se hizo análisis microscópico para corroborar la ausencia de esporas en las muestras.

El fragmento tóxico de las proteínas fue obtenido con procesamiento de las mismas por la enzima Tripsina (Tipo II de páncreas porcino), mediante la observación previa de la cinética del procesamiento para cada una de ellas, la cual se realizó con exposiciones continuas y a diferentes tiempos de las proteínas a la enzima (Bollag y Edelstein 1991). Se empleó una proporción enzima: protoxina que osciló entre 2:1 y 10:1 con incubación por 12 h a 37°C. Se corroboró el procesamiento de las proteínas mediante electroforesis en gel de poliacrilamida (SDS-PAQE). La toxina en forma soluble fue dializada posteriormente en buffer borato pH 8,6 durante una noche.

Las toxinas de B. thuringiensis a evaluar fueron marcadas siguiendo el protocolo de Denolf et ai. (1993a), con algunas modificaciones. Se realizó mareaje de las toxinas con biotina empleando un kit para mareaje de proteínas (ECL Protein Biotinilation Module, Amersham). El mareaje se realizó en proporción de 20 µl de biotina por cada 0,6 mg/ml de toxina. Se agitó la mezcla y se dejó en incubación a temperatura ambiente por 1 hora. Se realizó filtrado en columna Sephadex Q25 eluyendo la muestra con solución buffer de fosfatos pH 7,4 y recolectando alícuotas de 500 µl. Se comprobó el mareaje de la toxina mediante una prueba de dot-blot, empleando conjugado de Streptavidina-peroxidasa y revelando con solución de diaminobencidina. Así mismo se corroboró la integridad de la proteína durante el mareaje, mediante SDS-PAQE al 9%.

Purificación de vesículas

La preparación de las vesículas de las microvellosidades de células epiteliales del tracto digestivo de P. vorax (BBMVs) se realizó con la metodología estandarizada por Martínez y Cerón (2003) quienes tomaron como base las metodologías desarrolladas por Wolfersberger et al. (1987) y Macintosh et al. (1994).

El método de purificación se inicia con el macerado de 300 larvas de último instar del insecto en solución buffer MET pH 7,5 (Manitol 300 mN, Tris 17 mN, EGTA 5 mN, DTT 2 mN, PMFS 0.5 mN, Hepes 10 mN, EDTA 1 mN, SBT y neomicina sulfato 1 µg/ml); el material obtenido se centrifuga a 3.500 rpm por 15 minutos y se filtra. Se adiciona solución buffer MET y se homogeniza a 2.000 rpm empleando un macerador de tejidos (Potter-Elvehjem Wheaton). El homogenizado se mezcla con MgCI2 24 mN y se deja en hielo 15 minutos. Se realiza una centrifugación a 4.500 rpm por 15 minutos y el sobrenadante se centrifuga a 16.000 rpm por 30 minutos. La pastilla obtenida se suspende en buffer MET y se repite el proceso descrito una vez más. La pastilla obtenida se suspende en buffer MET, se cuantifica la proteína total presente empleando el método de Bradford (Bollag y Edelstein 1991) y se determina la presencia de las vesículas en el purificado mediante SDS-PAGE en gel al 9% y microscopía electrónica de transmisión. El material restante se almacena en nevera a -70°C.

La unión de la toxina con las BBMV del insecto se evaluó mediante la metodología de Denolf eí al (1993a), modificada. Se descongeló lentamente una alícuota de vesículas y se centrifugó a 13.000 rpm por 40 minutos. La pastilla se resuspendió en buffer PBS con BSA al 0,1%. Las vesículas se mezclaron con una cantidad adecuada de toxina marcada y se incubó por 1 h a temperatura ambiente. Se realizó centrifugación a 13.000 rpm por 40 minutos y se lavó el pellet con el buffer ya descrito. Se centrifugó nuevamente y se resuspendió la pastilla en buffer de carga para realizar posteriormente una electroforesis. Una vez separadas las proteínas se procedió a su transferencia a membrana de nitrocelulosa e incubación de la misma toda la noche en solución buffer de bloqueo pH 7,5 (Acido maleico 100 mN, NaCl 150 mN, reactivo de bloqueo 1%). Los geles obtenidos en la electroforesis se colorearon con azul de Coomasie para corroborar el proceso de transferencia. La membrana bloqueada se lavó, se incubó por 1 h con el conjugado de streptavidina-peroxidasa 1:1000 en PBS y se reveló con diaminobencidina. Cada ensayo se realizó por triplicado para corroborar los resultados obtenidos. Se emplearon como muestras control, la toxina marcada sola y las vesículas solas procesadas de .la misma forma que las muestras problema. En todos los ensayos de unión de vesículas con proteínas biotiniladas se empleó una concentración de purificado de vesículas de 1 mg/ml.

Análisis de proteínas por blotting

Las proteínas de Bt, que presentaron unión a las vesículas de P. vorax en los ensayos iniciales se analizaron con la técnica de blotting (Aranda et al. 1996), con el fin de identificar posibles proteínas receptoras de proteínas Cry presentes en purificado de BBMV.

Las proteínas del purificado de BBMV se separaron mediante electroforesis en gel de poliacrilamida al 9%. Se realizó transferencia de las proteínas a membrana de nitrocelulosa durante 30 min a 20 V. La membrana obtenida se incubó toda la noche en solución buffer TBS (Tris HC1 10 mN, NaCl 150 mN, pH 7,6) y luego se bloquearon los sitios de unión no específica incubándola en buffer TBS + tween 20 0,5% + BSA 3%. Posteriormente, se incubó la membrana por 3 h con la proteína marcada y luego se realizó el revelado incubando inicialmente con el conjugado streptavidina peroxidasa y luego con diaminobencidina en buffer TBS.

Bioensayos

Los bioensayos se realizaron empleando cubos de tubérculos de papa de 0,25 cm3, a los cuales se les aplicaron superficialmente las proteínas de B. thuringiensis ya fueran suspendidas o solubilizadas (Martínez y Cerón 2002). Los cubos de papa se dejaron secar al ambiente y posteriormente se colocaron en placas para cultivo de células de 24 pozos, poniendo un cubo por pozo. Se infestó cada cubo de papa con una larva de primer instar de P. vorax, obtenidas de una colonia del insecto mantenida en condiciones de laboratorio (18°C en promedio). Las placas se sellaron, taparon y se almacenaron por 7 días hasta la lectura del ensayo. En los bioensayos se empleó la proteína en forma suspendida (cristales), soluble y procesada enzimáticamente, para observar si existía algún efecto del procesamiento sobre la toxicidad de la misma (García et al. 2000; Koller eí al.; 1992; Lambert et a/.1992). Las proteínas empleadas en forma soluble fueron solubilizadas en dos condiciones diferentes, acida (pH 4,1) y alcalina (pH 10,0). Para la solubilización a pH 4,1 se empleó una solución buffer universal. Para la solubilización a pH alcalino se empleó una solución buffer de carbonato de sodio. La solubilización se llevó a cabo para ambos tipos de buffer a 37°C, durante 3 h en agitación constante. Una vez solubilizado el material, se centrifugó a 10.000 rpm durante 15 min. El sobrenadante obtenido, que corresponde a la proteína soluble, se dividió en alícuotas y se almacenó a 0°C.

En los bioensayos se empleó una dosis de 10 µg de proteína/cm² de dieta. Se utilizó en los ensayos con proteína suspendida un testigo absoluto con el agua destilada empleada en los tratamientos y en los bioensayos con proteína solubilizada testigos relativos con las soluciones buffer empleadas en la solubilización de las proteínas.

El diseño experimental utilizado en todos los bioensayos fue completamente al azar (Martínez y Martínez 1997) con tres repeticiones por tratamiento, empleando 24 larvas por repetición. Los ensayos se hicieron por triplicado en días diferentes. La variable respuesta fue el número de larvas muertas por tratamiento.

Resultadosy Discusión

El mecanismo de acción de B.thuringiensis conlleva varios pasos entre los cuales la unión proteína receptor se considera como uno de los más cruciales para que se ejerza el efecto tóxico sobre un insecto blanco determinado. La unión de proteínas de B. t. se presenta de manera general con proteínas receptoras presentes en purificados de BBMVs del tracto digestivo de diferentes insectos, como ha sido ampliamente registrado en la literatura internacional (Hofmann et al. 1988; Van Rie et al. 1989, 1990; Estada y Ferre 1994; Bravo et al. 1992a,b; Denolf et al. 1993b; Sakai et al. 2000).

En el presente trabajo se empleó, para las pruebas de unión, purificado de BBMVs obtenido de larvas de gusano blanco de la papa en el cual la presencia de BBMVs se corroboró mediante microscopía electrónica de transmisión como se observa en la figura 1.

En los ensayos con la proteína Cry3Aa se observó la unión de dicha proteína con las proteínas presentes en el purificado de vesículas de P. vorax. Como se aprecia en la figura 2 se presentó una banda en la línea 3 correspondiente a la muestra de la proteína Cry3Aa biotinilada mezclada con las vesículas del insecto blanco, lo cual indicó que hubo unión entre éstas. Así mismo, se observó la presencia de las bandas esperadas en la línea 1 que contiene la muestra de proteína marcada sola y la no presencia de bandas en la línea 2 que contiene sólo muestra de BBMV. Estas dos últimas muestras mencionadas se emplearon como controles positivo y negativo, respectivamente.

En ensayos similares a los desarrollados en el presente trabajo, García eí al. (2000), empleando la proteína Cry3A y vesículas de Leptinotarsa decemlineata (Say) y Tenebrio molitor (Linné) observaron una unión específica de dicha proteína con las proteínas receptoras del tracto digestivo de ambos insectos en forma similar a la unión observada con las vesículas de P. vorax. De igual forma también se ha detectado unión de la proteína CrySAa marcada con yodo radiactivo con vesículas de Diabrotica undecimpunctata howardi Barber (Slaney et al. 1992).

Las proteínas Cry3Bb y Cry3Ca, en forma similar a la proteína Cry3Aa, se unieron a las proteínas de las vesículas de P. vorax (Fig. 3, líneas 4 y 5). Igualmente se observaron las bandas correspondientes a las proteínas solas biotiniladas, en las líneas 1 y 2. Do se vieron bandas en la línea 3 correspondiente a la muestra de purificado de vesículas.

En el caso de las proteínas Cry3Ba y Cry7Aa no se evidenció unión a las vesículas de P. vorax (Fig. 4), Se observaron las bandas de las dos proteínas marcadas Cry3Ba y Cry7Aa (líneas 1 y 2, respectivamente), no se vieron bandas en la línea 3 correspondiente a las vesículas solas, como se esperaba. Por otro lado, tampoco se detectaron bandas en las líneas 4 y 5, correspondientes a las vesículas mezcladas con las proteínas CrySBa y Cry7Aa, respectivamente.

En la literatura no se mencionan ensayos de unión de las proteínas Cry3Ba, Cry3Bb, Cry3Ca o Cry7Aa a vesículas de insectos, por lo tanto los resultados obtenidos son el primer registro que explora la unión de dichas proteínas con el intestino de un insecto del orden Coleóptera. De acuerdo con esto se hacen relevantes los dos tipos de comportamientos de unión observados entre las vesículas de P. vorax y las proteínas Cry evaluadas; por un lado, la unión con las proteínas Cry3Aa, 3Bb y Cry3Ca y por otro lado, la no unión con las proteínas Cry3Ba y Cry7Aa.

Los dos comportamientos mencionados pueden deberse a una conformación distinta de la estructura de las proteínas, específicamente dominios II y III, involucrados en el reconocimiento y unión a los receptores del intestino de los insectos, que las hace expresar diferente afinidad a las vesículas de P. vorax. Vale la pena resaltar los comportamientos de unión de las proteínas Cry3Ba y Cry3Bb, que aunque son proteínas con una alta homología según el esquema de clasificación actual, presentan diferente afinidad por las vesículas del insecto blanco, lo cual concuerda con la alta especificidad de las proteínas de B. t. por un insecto blanco dado.

En vista de los diferentes comportamientos de unión de las proteínas, se seleccionaron las proteínas Cry3Aa, Cry3Bb y Cry3Ca para el análisis por blotting, las cuales fueron las únicas que se unieron al purificado de las BBMV de P.vorax.

Análisis de proteínas por blotting

Las proteínas CrySAa, CrySBb y CrySCa que presentaron unión con las vesículas de P. vorax, se sometieron a análisis por blotting. Los resultados obtenidos en dicho análisis se observan en la figura 5 en donde las líneas 1, 2 y 3 corresponden a las proteínas Cry3Aa, Cry3Bb y CrySCa, respectivamente.

Las tres proteínas evaluadas presentaron un patrón similar de unión a las proteínas del purificado de BBMV del insecto blanco; sin embargo, se observó que las tres proteínas se unieron en mayor proporción a dos proteínas de aproximadamente 97 y 70 KDa. De acuerdo con esto, dichas proteínas pueden constituirse en dos posibles proteínas receptoras de las proteínas Cry mencionadas. En la literatura no son muchos los registros de proteínas receptoras en insectos. Empleando la misma metodología de análisis de proteínas por blotting, Qarczynski et al. (1991) identificaron en BBMV de Manduca sexta (Linné) una proteína de 120 KDa, que posteriormente se identificó como un posible receptor para la proteína CrylAc (Chambers et al. 2000) y una proteína de 210 KDa como receptora de la proteína CrylAb. Para la proteína CrylAc en Spodoptera fhigiperda J.E. Smith ellos encontraron una posible proteína receptora de 148 KDa y en Heliothis virescens (Fabricius) y Heliothis zea (Boddie) encontraron varias posibles proteínas receptoras de 155, 120, 103, 90 y 63 KDa. Así mismo se han descrito proteínas receptoras con función aminopeptidasa en íí. virescens, Limantria dispar (Linné) y Plutella xylostella (Linné) (Aranda 1996).

En insectos del orden Coleóptera, Belfiore et al. (1994) registraron por primera vez una proteína receptora de 144 KDa, presente en el intestino de T.molitor, a la cual se une la proteína Cry3A.

De acuerdo con lo anterior, el presente sería el primer registro que se hace de posibles proteínas receptoras de las proteínas Cry3Aa, Cry3Bb y Cry3Ca de Bt en el intestino de P. vorax, las cuales merecerían una caracterización posterior más detallada.

Analizando la actividad tóxica obtenida con las proteínas evaluadas y las características de unión a las vesículas del insecto blanco, se observó un aspecto interesante: aunque las proteínas Cry3Aa, Cry3Bb y Cry3Ca se unieron a las vesículas de P. vorax, estas proteínas no presentaron efecto tóxico sobre las larvas de primer instar empleadas en los bioensayos (Tabla 2). Los resultados obtenidos concuerdan con lo señalado por Slaney eí ai. (1992), quienes encontraron una actividad tóxica baja (9% mortalidad) de la proteína Cry3Aa en larvas de D. undecimpunctata a pesar de que observaron unión de dicha proteína con las BBMV de este insecto. Ellos atribuyen este comportamiento a una afinidad reducida de la proteína por los sitios de unión en la membrana intestinal del insecto y a un cambio muy leve en la permeabilidad de la misma. Lo anterior puede también ser válido para explicar la poca actividad tóxica de las proteínas Cry3Aa y Cry3Ca obtenidas en los bioensayos con P. vorax, aunque se trate de un insecto diferente.

Por lo tanto, los resultados obtenidos muestran que, independientemente de su comportamiento de unión, ninguna de las proteínas evaluadas tuvo un efecto tóxico marcado sobre larvas de primer instar de P. vorax. Estos resultados concuerdan con el planteamiento que a pesar que el proceso de unión entre las proteínas y los receptores se dé, la capacidad de causar la muerte del insecto estará determinada por una unión específica saturable y la consiguiente inserción de la toxina en la membrana intestinal del insecto para la formación del poro (Aranda eí ai. 1996). Lo anterior permitiría plantear que la unión establecida entre las proteínas Cry evaluadas y las proteínas receptoras del purificado de las BBMV fue de carácter no específico y reversible, lo cual no permitió que se realizara la inserción del dominio I en la membrana intestinal de P. vorax y la consiguiente formación del poro.

Otra posible explicación para los resultados observados radicaría en que a pesar de que hubo unión entre las proteínas tóxicas Cry3Aa, Cry3Bb y CrySCa y los receptores del intestino de P. vorax, en condiciones in uitro, otros factores como la presencia de proteasas en el intestino de los insectos capaces de degradar las proteínas Cry haciéndolas no tóxicas, estarían influyendo en la inactividad de dichas proteínas en los ensayos in vivo. Este fenómeno fue descrito por Losevaa et al. (2001) quienes realizaron un estudio del efecto de los cambios en la actividad de proteasas en el intestino del escarabajo de la papa Leptinotarsa decemlineata sobre la proteína Cry3Aa y hallaron que la resistencia de este insecto a dicha proteína se correlacionaba con alteraciones especificas en la actividad de proteasas en el tracto digestivo y una reducción en la unión de las toxinas.

Por otro lado, de acuerdo con ensayos sobre formación de poro con la proteína Cry3Aa en membranas de coleópteros, los cuales han determinado que el pH y la activación de la toxina tienen un papel crítico en este fenómeno (García et al. 2000) y después de haber realizado bioensayos con las proteínas Cry en diferentes presentaciones (suspendidas, solubles y tripsinadas) sin obtener actividades tóxicas significativas, se elimina la posibilidad que este tipo de factores hubieran podido interferir en la toxicidad de las mismas.

Conclusiones

• Las proteínas de B. thitringiensis Cry3Ba y Cry7Aa no presentaron actividad tóxica hacia larvas de primer instar de P.vorax, esto se debió a que el insecto no tiene en su epitelio intestinal proteínas receptoras para dichas proteínas Cry.

• Las proteínas de B. thuringiensis Cry3Aa, Cry3Bb y Cry3Ca no mostraron actividad tóxica hacia larvas de primer instar de P. vorax, a pesar de que se observó la existencia de proteínas receptoras para ellas en el purificado de las BBMV del insecto. Esto es atribuible a dos factores: unión vesículas-proteínas de carácter reversible, sin lograrse la internalización de la toxina en la membrana epitelial del tracto digestivo del insecto o presencia de proteasas en el tracto digestivo de P vorax que degradan las toxinas haciéndolas inactivas.

• La evaluación de las proteínas de B. thuringiensis por blotting permitió identificar dos posibles proteínas receptoras para las proteínas Cry3Aa, Cry3Bb y Cry3Ca en las células epiteliales del intestino de P. vorax, siendo este el primer registro que se hace para un insecto coleóptero endémico de la región andina.

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Recibido: Mar. O4 / 2003 • Aceptado: May 30/2003