Introducción

Uno de los factores más limitantes en la producción del maíz en Colombia lo constituyen los insectos plaga entre los que se destaca el gusano cogollero del maíz, Spodoptera frugiperda J. E. Smith, el cual puede ocasionar daños directos o indirectos al cultivo pues actúa como trozador, comedor de follaje y comedor de estructuras (mazorcas). Este insecto está distribuido por todo el continente americano y puede encontrarse desde el nivel del mar hasta los 2.600 msnm. Sin embargo, el uso indiscriminado de algunos insecticidas químicos de amplio espectro para el control de esta plaga, tales como el endosulfan, carbofuran, metamidofos y clorpirifos (fosforados, piretroides y carbamatos), ha favorecido la selección de genes resistentes a estos insecticidas, además de ocasionar efectos negativos sobre la fauna benéfica y de interferir con el equilibrio biológico (García et al. 2002).

Según estadísticas del Ministerio de Agricultura (1996), el área sembrada con maíz en Colombia asciende a 79.351 ha con un rendimiento promedio de 3.243 kg/ha y con un gasto en insecticidas para el control de esta plaga de $ 4,2 millones de dólares por año aproximadamente, lo cual incide considerablemente en los costos de producción.

Una alternativa promisoria para el control de esta plaga es la utilización de hongos entomopatógenos como Metarhizíum anisopliae, Beauueria bassíana y Nomuraea rileyi. Su uso presenta varias ventajas frente a los insecticidas químicos, ya que su espectro de acción biológica es menor, disminuyendo el efecto sobre los insectos benéficos o no blanco, además es posible su producción sobre sustratos económicos y su aplicación en campo no representa riesgo lexicológico para otros seres vivos como aves, peces y mamíferos. En trabajos preliminares desarrollados en el C.l. Palmira de Corpoica con hongos entomopatógenos y productos no convencionales, se obtuvo en campo un 90% de control de larvas de S. frugiperda mediante el uso de una cepa seleccionada del hongo N. rileyi (García et al. 2002).

Considerando la importancia de este insecto, los resultados de control obtenidos mediante el uso de entomopatógenos y aprovechando la experiencia del Laboratorio de Control Biológico de Corpoica, se hace necesario desarrollar estudios encaminados al aislamiento y selección de cepas de hongos entomopatógenos, con actividad biocontroladora alta de la plaga con miras a desarrolar preformulados que sean seguros, eficaces y confiables. Por las razones anteriores, los objetivos del presente trabajo fueron aislar y seleccionar aislamientos nativos de nomuraea rileyi con actividad biocontroladora alta contra S. frugiperda; así como determinar las concentraciones y dosis letales de los aislamientos seleccionados.

Aislamiento, selección y evaluación de N. rileyi. Se llevó a cabo una recolección de insectos con síntomas de infección en cuatro, lotes sembrados con maíz en la zona del piedemonte llanero (Villavicencio, Meta) y en cuatro lotes en la zona de la altillanura (Puerto Qaitán, Meta). Para el piedemonte llanero se realizó el muestreo en tres lotes cultivados con maíz del Centro de Investigaciones "La Libertad" de Corpoica; el otro cultivo en donde se realizaron colectas correspondió a un lote comercial ubicado en la vereda de Pompeya Baja. En la altillanura, se hicieron muéstreos en dos de las fincas con las mayores áreas de cultivo de maíz: Panorama y Santana. En cada una de ellas se escogieron dos lotes, teniendo en cuenta su ubicación y nivel de daño. Las larvas muertas o enfermas, con sintomatología típica de infección por hongos o bacterias, se colectaron y se dispusieron individualmente en viales de vidrio. De esta manera, las muestras se transportaron al Laboratorio de Control Biológico del Centro de Investigaciones Tibaitatá de Corpoica, para su análisis.

A partir de las larvas recolectadas, se realizó el aislamiento de los hongos entomopatógenos potenciales en cajas de Petri con un medio de cultivo codificado como Agarharina de soya (Agar-Soya). Este medio estuvo constituido por salvado de trigo, fríjol soya triturado, extracto de levadura, sales minerales y agar. Luego, cada caja de Petri se incubó a 22°C bajo luz constante; las colonias características del hongo N. rileyi se purificaron y se conservaron en el medio Agar-Soya.

Con el fin de realizar la evaluación de la actividad biocontroladora de los diferentes aislamientos nativos de N.rileyi, se hizo una activación sobre larvas del insecto y se incubaron durante 12 días a 22°C en el medio de cultivo Agar-Soya. Posteriormente, con los conidios producidos por cada aislamiento se obtuvo una suspensión ajustada a una concentración de 1x10⁷ conidios.ml^-1. Se hizo la aplicación por medio de un aspersor manual a un volumen de 0,4 mi por el haz y 0,4 mi por el envés de hojas de higuerilla (Ricinus communis) previamente sometidas a desinfección en hipoclorito de sodio al 0,5% y luego tres enjuagues con agua destilada estéril por 5 minutos cada uno; posteriormente, cada hoja se infestó con dos larvas de segundo instar del insecto. Se seleccionó, como cepa de referencia, un aislamiento de N. rileyi procedente del Centro de Investigaciones Palmira de Corpoica (Valle del Cauca), por haber presentado en estudios previos la actividad bioinsecticida más alta obteniéndose un porcentaje acumulado superior al 90%, al ser probada en campo (García et al. 2002).

El bioensayo se realizó bajo condiciones controladas de 20°C ± 0,2°C de temperatura y 65% de humedad relativa; se utilizó un diseño completamente aleatorio, donde la unidad experimental consistió en 2 larvas/hoja para un total de 20 repeticiones y cuarenta individuos por tratamiento. A su vez, se utilizaron testigos tratados (hojas desinfectadas, asperjadas con Tween 80 al 0,1% e infestadas con larvas) y testigos larva (hojas desinfectadas, no tratadas con el hongo e infestadas con larvas).

Las lecturas del bioensayo se realizaron cada 24 h, registrando el porcentaje de mortalidad diaria y determinando el tiempo al cual muere el 50 - 90% de la población (TL₅₀, TL₉₀) para cada aislamiento. Las larvas muertas -diariamente se colocaron en cámaras húmedas para evidenciar si la muerte fue provocada por la infección del hongo evaluado. Los datos de mortalidad se corrigieron mediante la fórmula de Schneider - Orelli (Ciba Geygi 1973), obteniéndose el porcentaje de eficacia. Posteriormente, se sometieron a un análisis de varianza y la prueba de comparación de medias por Tukey (α=0,05).

Determinación de las concentraciones y dosis letales de los aislamientos seleccionados. Posteriormente, se seleccionaron los aislamientos de este hongo que cumplieron con los criterios de actividad biocontroladora alta sobre larvas del insecto, tiempos letales TL₅₀ y TL₉₀ menores y un crecimiento y esporulación óptimas en el medio de cultivo. A estos aislamientos seleccionados se les determinó la concentración letal media y noventa (CL50 y CL90) y al mejor de ellos se le determinó la dosis letal media y noventa (DL₅₀ y DL₉₀).

Las condiciones metodológicas y el diseño experimental de los bioensayos para la determinación de las concentraciones letales, fueron las mismas descritas anteriormente; para ello se evaluaron cinco concentraciones correspondientes a 1x10³, 1x10⁴, 1x10⁵, 1x10⁶ y 1x10⁷ conidios.ml^-1. Los datos obtenidos en el experimento se analizaron mediante el programa estadístico Probit.

Para determinar la DL₅₀ y DL₉₀ del mejor aislamiento de N. rileyi seleccionado, se hizo una aplicación tópica de 5 µl con dosis de 5, 50, 500, 5.000 y 50.000 conidios/larva (las suspensiones de conidios se realizaron en solución de TWeen 80 al 0,5%). La aplicación se hizo sobre el dorso torácico de larvas de segundo instar. El diseño experimental para este bioensayo fue igual al descrito anteriormente. De igual forma, los datos obtenidos se analizaron mediante el programa estadístico Probit.

Resultadosy Discusión

A partir de muestras analizadas correspondientes a larvas muertas de S. frugiperda procedentes del departamento del Meta, se obtuvieron diez (10) aislamientos nativos de n. rileyi, los cuales presentaron morfología típica tanto microscópica como macroscópica del hongo, con algunas diferencias ligeras en cuanto a la tonalidad en el color de la esporulación. Estos diez aislamientos, se purificaron mediante repiques sucesivos en el medio de cultivo específico, para su posterior conservación en cuarto frío a 4°C (Tabla 1).

El número limitado de aislamientos nativos obtenidos de Nomuraea rileyi (10), con respecto a la alta cantidad de muestras recolectadas (37), pudo haberse debido a la dificultad en purificar este hongo y a las exigencias nutricionales requeridas para su crecimiento y esporulación; ya que las muestras biológicas traídas de campo presentaron en su superficie muchos microorganismos saprofitos como hongos y bacterias, que interfirieron con el aislamiento y purificación de éste, debido a su crecimiento rápido en los medios, en comparación con los inocules de N. rileyi, que presentan un crecimiento más lento, lo cual conllevó a una competencia entre estos microorganismos por espacio y por nutrientes en el medio de cultivo.

Si bien es cierto que en la literatura existen medios recomendados para el crecimiento de hongos del género Nomuraea, éstos no son los más eficientes para el aislamiento, crecimiento y esporulación del hongo, debido a que no son selectivos y muchos carecen de los requerimientos nutricionales específicos para la total esporulación del hongo. Por tal razón fue necesario mejorar el medio de cultivo semiselectivo descrito por Vimala (1994), que permitiera inicialmente realizar el aislamiento adecuado del hongo a partir de las muestras recolectadas.

El criterio para haber utilizado en todos los ensayos biológicos larvas de segundo instar del insecto, fue motivado porque los primeros estadios de lepidópteros (primer y segundo instar) son más susceptibles de controlar en campo que instares avanzados. Además, en ensayos previos de estandarización para comparar la patogenicidad de un aislamiento de Nomuraea utilizando diferentes instares larvales de S. frugiperda, se aplicó una concentración de 1x10⁷ conidios.ml^-1 sobre hojas de higuerilla, las cuales se infestaron independientemente con larvas de segundo y de cuarto instar del insecto, obteniéndose porcentajes de mortalidad del 100 y del 80%, respectivamente. Resultados similares fueron obtenidos por Bustillo y Posada (1986), quienes evaluaron la patogenicidad de un aislamiento de Nomuraea rileyi sobre larvas de tercer instar de S. frugiperda, encontrando que éstas fueron muy susceptibles al hongo, con un mortalidad de 83,7%. De otro lado. Muñera et al. (1999) determinaron que larvas de primer instar de Erinnyis ello (Lepidoptera: Sphingidae) fueron más susceptibles a la patogenicidad de un aislamiento de B. bassiana obteniéndose el 87,5% de mortalidad, a diferencia del 27,5% de mortalidad obtenido cuando se utilizaron larvas de quinto instar del insecto.

Este comportamiento podría atribuirse a diferentes mecanismos de defensa presentes en los estadios larvales de los insectos; según Watanabe (1987) éstos pueden ser de índole cuticular cuando se lleva a cabo la penetración de los hongos, también factores en la hemolinfa contra el crecimiento del patógeno y la resistencia por parte del insecto a los metabolitos tóxicos producidos por los hongos. Por otra parte, lanada y Kaya (1993) afirman que la composición de los aminoácidos de la superficie del integumento de las larvas, varía según el estadio larval en que se encuentren las larvas y el tiempo antes de la muda; lo anterior podría explicar, la mayor susceptibilidad del segundo instar de S. frugiperda a N. rileyi al suponer que la composición de su integumento en un momento dado, permitió la efectiva penetración y por lo tanto una mayor mortalidad que la obtenida con el cuarto instar del insecto.

De otra parte, con el fin de simular las aplicaciones en campo, las suspensiones de conidios de los diferentes aislamientos se asperjaron sobre hojas de higuerilla (utilizadas como alimento) y no sobre las lar-vas del insecto; ya que si las aspersiones se realizaban sobre las hojas y sobre los insectos, se estaría propiciando la patogenicidad de los microorganismos en los insectos bajo condiciones obligadas, lo que conllevaría a obtener falsos positivos. Además, autores como Muñera et al. (1999), en ensayos realizados en laboratorio, cuando compararon dos métodos de inoculación de conidios de un aislamiento de Beauveria bassiana contra larvas de Erinnys ello, aspersión directa sobre las larvas contra aspersión sobre el sustrato de alimentación, no encontraron diferencias significativas en los porcentajes de mortalidad.

Al cabo de los 10 días de haber hecho la aplicación, el aislamiento que ocasionó la actividad biocontroladora mayor (100%) fue el codificado como Nm-07 procedente de la finca Panorama (Puerto Qaitán, Meta), esta actividad fue seguida por la producida por el aislamiento Nm-06-4 (proveniente de Puerto Qaitán -Meta) con el 95% de mortalidad, y por los aislamientos Nm-016 y Nm-10 (provenientes de Villavicencio Meta) con una mortalidad del 95%. Las actividades biocontroladoras de estos cuatro aislamientos no fueron significativamente diferentes entre sí, ni diferentes con la actividad obtenida con la cepa de referencia de riomuraea rileyi Nm-004, procedente de Palmira, con la cual se obtuvo también el 100% de mortalidad (Tabla 2).

Así mismo, estos aislamientos produjeron una esporulación polvosa en el medio de cultivo, lo que permitió la fácil recolección y manipulación de los conidios del medio, a diferencia de la cepa de referencia que, en el medio de cultivo, presentó una esporulación algodonosa (con presencia de micelio) lo que dificultó la recolección de los conidios.

Determinación de las concentraciones y dosis letales de los aislamientos seleccionados. Para la determinación de las concentraciones letales de los aislamientos seleccionados, se evaluaron cinco concentraciones: IxlO3, 1x10⁴, 1x10⁵, 1x10⁶ y 1x10⁷ conidios.ml^-1. Las lecturas de los tratamientos se realizaron diariamente hasta los 15 días después de aplicación.

El análisis estadístico Probit determinó para el aislamiento Nm-07 una concentración letal media (CL₅₀) de 9,8 x 10= conidios.ml^-1 y una concentración letal noventa (CL₉₀) de 2.2x10⁵ conidios ml^-1

Los valores de CL₅₀ y CL₉₀, obtenidos en este estudio, sugieren que la cepa seleccionada es virulenta y altamente promisoria para el control de larvas de S. frugiperda en campo, si se comparan estos resultados con los de autores como Vimala (1994) y Qonzáles et al. (1996), quienes mencionaron que aislamientos de n. rileyi evaluados sobre larvas de segundo instar de S. littura, tuvieron un rango de CL^₅₀que varió entre 9,3 x 10⁶ y 1x10⁸ conidios.ml^-1.

Al determinarse la DL₅₀ y DL ₉₀ se observó que los porcentajes de mortalidad menores se obtuvieron cuando se aplicaron las dosis de cinco y cincuenta conidios sobre cada larva, con estas dosis letales sólo hasta el noveno día se presentó mortalidad en las larvas, la cual fue de 2,5 y 20% respectivamente; y se incrementaron hasta obtenerse el 22,5 y el 50% de mortalidad respectivamente, al cabo de los quince días de realizado el ensayo.

De otra parte, los porcentajes de mortalidad mayores se obtuvieron cuando se aplicaron las dosis de 500, 5.000 y 50.000 conidios/larva. Con estas tres dosis a partir del quinto día se obtuvo el 5% de mortalidad, y se incrementó en un 22,5, 32,5 y 60%, respectivamente, al cabo de los siete días post aplicación. A los quince días de realizado el ensayo, se obtuvo una mortalidad acumulada del 85% con la dosis de 500 conidios/larva; de 92,5% de mortalidad con la dosis de 5.000 conidios/larva y de 95% de mortalidad con la dosis de 50.000 conidios/larva. Estos resultados demuestran que con las dosis más altas de 5.000 y 50.000 conidios/larva se obtuvo una mortalidad similar en larvas del insecto correspondientes al 92,5 y 95%, respectivamente (Fig. 1).

En la determinación de las dosis letales cincuenta y noventa del aislamiento Nm07 de N. rileyi, se estableció una DL₅₀ de 44 conidios/larva necesarios para matar el 50% de la población y una DL₉₀ de 3.380 conidios/larva necesarios para matar el 90% de las larvas utilizadas. Estos resultados indicarían que para controlar la población de la plaga en campo se necesitaría aplicar concentraciones bajas del hongo; lo que significaría un ahorro de tiempo y dinero en las etapas de producción masiva y formulación, necesarias para el desarrollo de un bioplaguicida.

• Las mayores actividades biocontroladoras se obtuvieron con cuatro aislamientos de n. rileyi (Nm 01-06, Nm-10, Nm 06-04 y Nm-07) ocasionando mortalidades entre 94,73 y 100%.

• Con el aislamiento Nm-07 se obtuvieron los menores valores de concentración y dosis letal.

• Teniendo en cuenta su virulencia alta y la mortalidad causada bajo condiciones de laboratorio sobre larvas de S. frugiperda, el aislamiento Nm-07 de n. rileyi fue seleccionado como el más promisorio para hacer estudios de formulación y la posterior evaluación bajo condiciones de campo.

Literatura citada

BUSTILLO, A.; POSADA, F. 1986. Patogenicidad de un aislamiento de Nomuraea rileyi sobre larvas del cogollero del maíz Spodopíera frugiperda. Revista Colombiana de Entomología 12 (1): 5-15.        [ Links ]

CIBA GEYOI. 1973. Manual de ensayos de campo. 215 p.        [ Links ]

GARCÍA, F.; MOSQUERA, M.; VARGAS, C.; ROJAS, L. 2002. Control biológico, microbiológico y físico de Spodopíera frugiperda (Lepidoptera: Noctuidae), plaga del maíz y otros cultivos en Colombia. Revista Colombiana de Entomología 28 (1): 53-60.        [ Links ]

GONZÁLES, H.; CARBALLO, M.; BLANCO, H.1996. Efecto de cepas de Beauveriabassiana (Bals.) Vuill sobre la mortalidadde Ecdytolopha torticornis (Meyrick) (Lep:Tortricidae) en macadamia. http://www.catie_ac.cv/-cicmip/rev40hgonz40.        [ Links ]

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MUÑERA, D.; DE LOS RÍOS J.; BELLOTTI, A. 1999. Patogenicidad sobre Erinnys ello (Lepidoptera: Sphingidae) en condiciones de laboratorio por hongos entorno patógenos recolectados en cultivos comerciales de yuca, Manihot escalenta en el Valle del Cauca, Colombia. Revista Colombiana de Entomólogo 25 (3-4). 161-167.        [ Links ]

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VIMALA, P. 1994. Conidia production of the entomopathogenic fungus Nomureae rileyi and its evaluation for control of Spodoptera litura (Fab.) on Ricinus communis. Journal of Invertebrate Pathology 63: 145-150.         [ Links ]

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Recibido: Abr. 22/2003 • Aceptado: Ago. 07/ 2003