Palabras clave:Control biologico Conidiacion Hongo entomopatogeno

Sumrnary. The effect of the entomopathogenic fungus Beauveria bassiana (strain UdeA₁₃) was evaluated on fifth instar nymphs of Rhodnius prolixus under laboratory conditions. The strain was isolated from fi. pallesceris in the region of San Onofre (Sucre) and cultivated on Sabouraud Dextrosa Agar (SDA). The insect colonies were propagated and reared under controlled conditions of ternperature (25 27°C) and relative humidity (80%) in darkness for growth and reproduction. The insects were feed weekly for 1 h with hen’s blood (Gallus gaitas). The treatments consisted of conidial suspensions of the entomopathogenic fungus B. bassiana at concentrations of 3x10⁵, 1x10⁷, 3x10⁸ y 3x10⁹ conidia/ml which were sprayed on the insects using the Pulverization Tower emulator system Control insects were sprayed with an aqueous solution of Tween 80 (0,0l%). Effects were compared among fungus treatments and the controls Significative differences (P<0,01) were found among ah treatments regardless of whether the control group was included in the analysis The concentrations of 3x10⁶ y 3x10⁹ conidia/ml produced 90 to 100% of mortality between 7 and 9 days after treatment. The results of this research indicate that fi bassiana (UdeA13) can be considered as a possible agent for the biological control of the vector R. prolixus.

Introduccion

Rhodnius prolixus (Stahl) es un insecto hematofago vector del protozoario flagelado Trypanosoma cruzi, causante de la enfermedad de Chagas, una parasitosis cronica que constituye un grave problema de salud pública en Latinoamérica (Botero y Restrepo 1998; Días y Schofield 1999; Lecuona et al. 2001).

En Colombia, la enfermedad de Chagas constituye una de las mayores causas de incapacidad en la poblacion economicamente activa afecta el 7% de la poblacion y cerca del 23% se encuentra en riesgo de adquirir la infeccion (Guhl y Nicholls 2001) Se calcula que debido a esta enfermedad en el país se pueden estar perdiendo alrededor de 150 millones de dólares anuales (Schofield 1997) La transmision vectorial el medio más importante para adquirir la infección, se da principalmente por insectos de los géneros Rhodnius y Triatoma. La especie R. prolixus es la más importante debido a su carácter domiciliar, capacidad vectorial amplia distribucion en el pais y a que se encuentra adaptada a ambientes silvestres y peridomesticos Tambien es un vector importante en Centroamerica y parte de Sudamerica (Lent y Wygodzinsky 1979 Moreno 1997 Ministerio de Salud 1998, Calle 2000; Guhl y Nicholls 2001; OMS 2002).

El insecto posee cinco estadios ninfales, todos hematófagos estrictos, Estudios realizados en laboratorio, basados en el índice de excreción de todos los estadios, mostraron que el quinto es el vector más eficiente del parasito seguido por hembras adultas y ninfas de cuarto estadio (Miwako y Edmanb 2001). Las poblaciones de insectos domiciliados tienden a ser genéticamente homogéneas, lo que sugiere que la respuesta a los diferentes métodos de control es la misma para todos los insectos (Moreno 1997; Días y Schofield 1999; Schofield 2000).

Organismos corno ácaros, nemátodos, microhirnenópteros y hongos se han utilizado en pruebas de laboratorio con el fin de observar su efecto en el control de poblaciones de insectos plaga (Ferron et al. 1991; CIDEIM 1994; Uribe et al. 1997), El hongo entomopatógeno Beauveria bassiana (Bais.) Vuill ha sido considerado corno agente potencial en el control de triatomineos por su amplia distribución y diversidad de hospederos (Romaña 1992; Arroyave 1995; Luz et al. 1998b; Fargues y Luz 2000; Lecuona et al. 2001, Pineda et al. 2002, 2004).

Romaña y Fargues (1992) evaluaron la susceptibilidad de diferentes estadiós del insecto vector R. prolixus a la acción del hongo B, bassiana, encontrando excelentes resultados y considerándolo como un agente promisorio en el control biológico. Fargues y Luz (1998) demostraron el potencial epizoótico de B. bassiana para el control de R. prollxus considerando los factores abióticos que afectaban la conidiación sobre los insectos, obteniendo que la humedad relativa era el factor más importante. Pineda et al. (2002) probaron la susceptibilidad de R. ecuadoriensia (Lent y León) a la acción de la cepa B. bassiana UdeA₁₃ obteniendo altas tasas de mortalidad en estos insectos. Por esta razón en este estudio se consideró que el hongo B. bassiana UdeA₁₃ tiene un efecto significativo a diferentes concentraciones en la disminución de la supervivencia de R.prolixus de V estado de desarrollo y en la conidiación del hongo sobre los cadáveres.

EI objetivo de este trabajo consistió en evaluar la acción del hongo B. bassiana UdeA₁₃ sobre ninfas de quinto estado de desarrollo de R. prolixus bajo condiciones de laboratorio.

Materiales y Métodos

Orinen de los insectos

Hongo Entomopatógeno

La cepa del hongo B. bassíana UdeA₁₃ utillizada en este estudio fue aislada de Rhodnius pallescens Barber infectado naturalmente. en la región de San Onofre, Sucre. Fue repicada en Agar Sabouraud Dextrosa (Oxoid Ltda., Basinastoke, Hampshire) cada 15 días a partir de insectos conidiados, e incubada a temperatura ambiente (25-27°C) en el laboratorio de Micología. Instituto de Biología, Universidad de Antioquia.

Bíoensayo

Se preparó una suspensión conidial del hongo B. bassiana por raspado de la superficie del cultivo con ulla barra de vidrio estéril y 100 ml de solución acuosa estéril de Tween 80 (0,01%) (Sigma. St. Louis, MO, USA). La concentración fue determinada mediante el conteo de conidios en la cámara de Neubauer (boeco-Germany). Para el bioensayo se probaron cuatro concentraciones de la cepa B. bassiana 3x10⁵, 1x10⁷, 3x10⁸ y .3x10⁹ conidios/ml. Se realizaron cuatro repeticiones con cada una de ellas y como testigo se utilizó una solución acuosa de Tween 80 (0,01%). Las dosis elegidas fueron seleccionadas con base en los resultados de estudios previos realizados por Romaña (1992), Fargues y Luz (2000) y Pineda et al. (2002).

Se probaron las diferentes concentraciories del hongo B. bassiana, asperjando 30 ml de las suspensiones conidiales sobre lotes de 20 insectos, siguiendo la metodología descrita para la utilización de la torre de pulverización (Burgerjon 1956). La presión de aire se ajustó a 6 lbs para todos los experimentos. Los lotes de insectos se mantuvieron en cristalizadores plásticos y se incubaron en cámara climatizada a una temperatura 27°C y a una humedad relativa de 80% (Pineda el al. 2002).

Supervivencia de los insectos

El análisis de supervivencia, tiempo letal y tiempo de conidiación se realizaron teniendo en cuenta la prueba generalizada de Gehan y el test de Kaplan Meier (Lee 1980) con un alpha de 0,01 obtenido mediante la corrección de Bonferroni. Se utilizó el programa Statistica 98 Statsoft Inc.,. TuIsa, USA.

Conidiación

Los bioensayos se observaron diariamente durante 25 días y los insectos muertos se retiraron, se colocaron en una cámara húmeda (caja de Petri con papel de filtro Wattman más agua destilada estéril). Se registró el tiempo de aparición y conidiación del hongo sobre los insectos para cada una de las dosis asperjadas. Los insectos conidiados se colorearon con azul de lactofenol, en placas, para observar las diferen les estructuras morfológicas del hongo y verificar su identidad (Pineda et al. 2002).

De los 320 insectos sometidos a la acción del hongo entomopatógeno a diferentes concentraciones, 219 (68,44%) murieron y presentaron micelio y conidiación de B. bassiana. EI resto de los insectos, 101 (31,56%), no murieron y mudaron hacia el estado adulto. Los testigos (100%) sobrevivieron durante todo el tiempo del ensayo (25 días); el TL₅₀ varió entre 5 y 25 días (Tabla 1). La concentración de 3x10⁹ conidios/ml produjo una mortalidad del 100% de R. prolixus al noveno día con un tiempo letal medio de 5 días en comparación con la concentración de 3x105 conidios! ml que eliminó menos del 50% en el mismo tiempo. Esto permitió observar diferencias en las curvas de supervivencia según la concentración (Fig. 1).

Los análisis estadísticos mostraron diferencias significativas en mortalidad cuando se compararon los 4 tratamientos entre sí y el testigo. Las dosis 3x10⁸ y 3x10⁹ conidios! ml no presentaron diferencias significativas entre sí (Z=-l,83, P= 0,067) (Tabla 2).

Los 219 R. prolixu.s que murieron, presentaron conidiación del hongo a partir del sexto día de su inoculación con las suspensiones conidiales. Se observó que a medida que aumenta la concentración se incrementa el porcentaje de insectos invadidos (Fig. 2).

Las concentraciones 3x10⁵, 1x10⁷, 3x10⁸ y 3x10⁹ conidios/ml presentaron diferencias significativas de conidiación (X²=302, 63, P<0,00001), siendo mayor el número de insectos invadidos (100%) en la concentración 3x10⁹ conidios/ml. Las concentraciones 3x10⁹ y 3x10⁸ conidios/ml no presentaron diferencias significativas entre sí (Z=-1.83, I’=’0,067) con tiempos medios de conidiación de 6 y 7 días, respectivamente (Tablas 2 y 3).

La cepa B. bassiana UdeA₁₃ utilizada en los ensayos causó una mortalidad alta en las ninfas de quinto estado de R. proflxus y presentó conidiación visible en los cadáveres.

La supervivencia de las ninfas de quinto estado de desarrollo de R. prolixus disminuyó a medida que se aumenta la concentración del inóculo del hongo B. bassiana UdeA₁₃, resultados que concuerdan con trabajos realizados con hongos entomopa tógenos sobre insectos plaga de importancia económica y algunos triatominos (Luz et al. 1998a; Lecuona et al. 2001; Gutiérrez 2003). Sin embargo, es importante resaltar que Pineda et al. (2002) mostraron que el hongo B. bassiaria UdeA₁₃ sobre R. ecuadoriensis de quinto estadio, bajo condiciones de humedad (80%) y temperatura (26±2°C) similares a las del presente estudio, produjo una mortalidad del 100% de insectos en las concentraciones de 3x10⁵, 3x10⁷ y 3x10⁸ conidios/ml. Estas diferencias en la mortalidad de los insectos demuestran que especies de insectos relacionadas presentan grados de susceptibilidad diferentes a una misma cepa, como se menciona también en investigaciones realizadas por Arroyave (1995) y Luz et al. (1998b).

En estudios similares realizados por Romaña (1992), Luz y Fargues (1999), y Lecuona et al. (2001) con B. ba.ssiana, el tiempo letal medio varió para Rhodnius prolixus y Triatoma infestans (K1ug) entre 5,5 a 9,9 y 6,6 a 7,3 días, respectivamente. El tiempo letal medio varió dependiendo del estado ninfal y de las concentraciones del hongo. En la presente investigación los rangos variaron entre 5 y 11 días para todas las concentraciones, resultados que concuerdan con los estudios previos.

La conidiación se presentó de manera similar con todas las concentraciones de B. bassiana, iniciándose el día 1 después de haberse llevado los insectos a cámara húmeda, evolucionando de manera progresiva cada día hasta cubrir todo el cuerpo del insecto. La invasión se presentó principalmente en las áreas intersegmentales al igual que lo mencionan Tanada y Kaya (1993); iniciándose en las patas, proboscis, escutelo y finalmente en el tejido blando del abdomen, alcanzando el mayor grado de conidiación al día 5 (fig. 3).

Existen pocas publicaciones relacionadas con cepas de hongos entomopatógenos aislados naturalmente de vectores triatominos en el campo. Parameswaran y Sanharan (1979) aislaron B. bassiana de Linshcosteus sp. (Luz et al. 2003) y Calle (2000) de R. pallescens. La ocurrencia natural de estos microorganismos es relevante para entender las relaciones del hongo con su hospedero en zonas infestadas y así poder seleccionar las cepas más patógenas y eficientes en el control de los triatominos.

Conclusiones

- Las ninfas de quinto estado de desarrollo de R. prolixus presentaron susceptibilidad al hongo B. bassiana (UdeA₁₃), por lo cual se podría considerar como un buen agente de control para dicho vector.

- El tiempo letal medio varió de acuerdo con las concentraciones de B. bassiana utilizadas mostrando que a medida que aumenta la concentración se presenta mayor mortalidad en menor tiempo.

Agradecimientos

Los autores agradecen a los profesores Abel Díaz, por la ayuda en el análisis estadístico, Fabio Pineda G., Jaime Calle O., Ana Isabel Gutiérrez G., Beatriz Cardona Y., Inés Elena Giraldo M. y Nadya Cardona B. por su apoyo técnico y logístico en la investigación. A la Corporación de Patologías Tropicales, al Instituto de Biología y al CODI de la Universidad de Antioquia por la financiación y el apoyo en esta investigación.

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Recibido: Nov. 9/2003 Aceptado: May. 11 / 2004