LUIS M. CONSTANTINO¹, LUCIO NAVARRO², ALEJANDRO BERRIO³, FLOR E. ACEVEDO⁴, DAVID RUBIO⁵ y PABLO BENAVIDES⁶

¹ M.Sc., Investigador Cientifico I, Entomología, Cenicafé, Chinchiná, Caldas. luismiguel.constantino@cafedecolombia.com.

² Biólogo, Investigador Cientifico I, Entomología, Cenicafé, Chinchiná, Caldas. lucionavarro@cafedecolombia.com.

³ Biólogo, Entomología, Cenicafé, Chinchiná, Caldas. alejandro. berrio@cafedecolombia.com.

⁴ I. A. Entomología, Cenicafé, Chinchiná, Caldas. floredith.acevedo@cafedecolombia.com. ⁵ M.Sc., Mejoramiento Genético, Cenicafé, Chinchiná, Caldas. david.rubio@cafedecolombia.com.

⁶ Ph.D., Investigador Científico II, Coord Disciplina de Entomología, Cenicafé, Chinchiná, Caldas. pablo.benavides@cafedecolombia.com

Recibido: 19-sep-2010 - Aceptado: 19-sep-2011

La Broca del Café Hypothenemus hampei (Ferrari, 1867) y la Falsa Broca H. obscurus (Fabricius, 1801) son dos especies que se han reportado en el cultivo del café. La primera es la plaga más devastadora del cultivo a nivel mundial, se alimenta y reproduce del endospermo del fruto, causando su deterioro comercial y reduciendo su calidad en taza; es una especie de hábitos monófagos, exclusiva del género Coffea y es de origen africano (Bustillo 2006). Por otro lado H. obscurus es una especie polífaga, de origen neotropical, se alimenta del mucílago del café, pero es incapaz de perforar las almendras (Vélez 1997).

Los adultos de estas dos especies se pueden encontrar atacando simultáneamente los frutos de café, siendo H. hampei la especie más abundante y de distribución más amplia en todo Colombia. Actualmente infesta unas 800.000 ha de café (Bustillo 2006) en un rango entre 600 y 2.200 m.s.n.m. con temperaturas entre 19 y 21°C (Arcila 2007), mientras que H. obscurus se encuentra asociada principalmente a cultivos de macadamia en regiones de la zona central cafetera colombiana ubicadas entre los 20 y 23°C, a altitudes comprendidas entre 1.000 y 1.500 m.s.n.m (Villegas y Sánchez 2008). Los adultos de H. obscurus y H. hampei a simple vista son difíciles de distinguir. H. hampei posee setas erectas y filiformes, mientras que H. obscurus las posee más cortas y achatadas en forma de bate en su extremo con seis estrías longitudinales (Alonzo-Padilla 1984; Rubio 2003).

Ambas especies presentan varias sinonimias dados los problemas para identificar correctamente las 200 especies del género Hypothenemus conocidas en el ámbito mundial (Wood 2007). H. obscurus se encuentra distribuido en Costa Rica, Sur África, en el sudeste asiático, Sur de Estados Unidos, Hawai, Guadalupe, Jamaica, Puerto Rico, México, Guatemala, Nicaragua, Costa Rica, Trinidad, Guyana, Surinam, Colombia y Brasil, donde se tiene reportada como plaga del cultivo de macadamia (Macadamia integrifolia Maiden y Betch) ocasionando una disminución del rendimiento y calidad de la nuez. Igualmente esta especie se alimenta de las vainas y semillas, y en algunas ocasiones en ramas secas, de una amplia variedad de hospedantes entre los cuales los más importantes son: el algarrobo Hymenaea courbaril (Caesalpinaceae), tamarindo Tamarindus indica (Caesalpinaceae), clavellino Caesalpina pulcherrima (Caesalpinaceae), nuez moscada Myristica fragrans (Myristicaceae), nuez del brasil Bertholletia excelsa (Lecythidaceae), yarumo Cecropia sp. (Cecropiaceae), matapalo Phoradendron sp. (Loranthaceae), Ficus sp. (Moraceae), mangle Rhizophora sp. (Rhizophoraceae), cacao Theobroma cacao (Sterculiacae), congolo Mucuna sp. (Fabaceae) y café Coffea arabica (Rubiaceae) (Wood 2007). Estos antecedentes nos indican que H. obscurus es de hábitos polífagos, contrario a H. hampei el cual ha sido descrito de hábitos monófagos, alimentándose exclusivamente del género Coffea spp. (Rubiaceae) (Vélez 1997; Bustillo 2006).

En Colombia H. obscurus está reportada como plaga del cultivo de la nuez de macadamia en la zona cafetera de los departamentos de Quindío, Risaralda, Caldas, Cauca, Valle y Cundinamarca (Villegas 1998). Las hembras inician el ataque al realizar perforaciones laterales en la nuez, hasta alcanzar la almendra donde depositan sus huevos, de los que emergen las larvas que consumen la almendra casi en su totalidad, encontrando que el daño se produce tanto en los frutos verdes que se empiezan a secar en el árbol como en los frutos que se caen al suelo (Beardsley 1990; Jones et al. 1992; Villegas 1998). Además del daño mecánico directo ocasionado por la Falsa Broca al alimentarse y destruir las almendras, los orificios de entrada y de salida realizados por el insecto en los frutos son la puerta de entrada a esporas de hongos saprofitos que contaminan la nuez, causando mayores pérdidas de calidad y disminución del valor comercial de la almendra (Jones et al.1992). En el caso del cultivo de café, H. hampei ataca y daña los frutos que son comercializados, reduce la producción por la destrucción de los granos (pérdida de peso), provoca la caída de frutos, deprecia el café en su clasificación por tipo al aumentar los granos perforados y quebrados en el beneficio y además, altera el sabor de la bebida (Duque y Cháves 2000).

Una de las características biológicas de la Broca del Café es su comportamiento reproductivo altamente endogámico, la broca fundadora produce una progenie compuesta principalmente por hembras, en una proporción de 10:1 con respecto a los machos, estos últimos ápteros y de menor tamaño, los cuales permanecen dentro del fruto apareándose con las hembras de su misma progenie (consanguíneos) (Bustillo 2008; Benavides 2008). Una vez apareadas, las hembras emergen para buscar nuevos frutos de café para ovipositar de manera que la mayor parte del ciclo el insecto ocurre dentro del fruto.

La haplodiploidía ha evolucionado al menos unas 17 veces en animales, incluyendo los taxones Rotifera, Nematoda, Arachnida e Insecta (Mable y Otto 1998). En los artrópodos existen dos formas de llegar a ser un macho haploide en las especies haplodiploides: en organismos arrenotocos los machos se desarrollan a partir de huevos no fertilizados haploides; mientras que en pseudoarrenotocos, los machos se desarrollan de huevos fertilizados diploides, pero luego el genoma paterno es eliminado. En el último caso, existen dos formas de perder el genoma paternal: (i) el set de cromosomas paterno es eliminado durante los estados tempranos del desarrollo embrionario y el macho se convierte en un individuo somáticamente haploide; o (ii) el set cromosómico paterno es inactivado y retenido al interior de las células somáticas como una masa condensada de cromatina y eliminados durante la espermatogénesis. En ambos casos, el set cromosómico materno es génicamente expresado y cromosómicamente transmitido a su progenie. A la fecha, la pseudoarrenotoquía ha sido estudiada en cóccidos (Hemiptera) (Nur 1980), ácaros de la familia Phytoseiidae (Acari) (Nelson-Rees et al. 1980; Schulten 1985; Perrot-Minnot et al. 2000) y en la Broca del Café (Coleoptera) (Brun et al. 1995; Borsa y Kjellberg 1996).

En vista de que el ciclo de vida de H. obscurus no está descrito completamente y que esta especie parece cercana a H. hampei, surgió la necesidad de hacer este estudio comparativo para determinar las diferencias biológicas, morfológicas, citogenéticas y genéticas existentes entre estas dos especies pertenecientes al mismo género, pero contrastantes en hábitos y comportamientos, que podría ayudar a entender las razones biológicas y genéticas que posee la Broca del Café para ser una especie tan especializada en alimentarse, desarrollarse y reproducirse únicamente en plantas del género Coffea spp.

Aspectos biológicos de H. obscurus y H. hampei. Para avanzar en el conocimiento de la biología de la Falsa Broca y la Broca del Café, se realizaron estudios comparativos sobre la cría de estos dos insectos en frutos de macadamia, granos de café y dietas artificiales. También se estudió el daño y el modo de penetración de H. obscurus en frutos de macadamia. Para el desarrollo de una dieta artificial para la cría de H. obscurus en confinamiento, se estudió la dieta Cenibroca (Portilla 1999) usada para la cría de la Broca del Café, donde se reemplazó el café molido por endospermo y pericarpio de macadamia.

El modo de penetración y el daño de la Falsa Broca se registraron mediante observación directa en cultivos de macadamia de la Estación Experimental Paraguacito de Cenicafé, localizada a 1.200 m de altitud, en el departamento del Quindío, Colombia. Se recolectaron 100 frutos brocados del suelo de una parcela de 180 árboles productivos, que contenían una perforación de entrada en la corona. Estos frutos se mantuvieron en condiciones ambientales controladas de 26±1°C y 80±2% de HR durante 60 días en cajas plásticas de 30 x 25 x 10cm con tapa y dos orificios de ventilación de 5cm de diámetro cubiertos con muselina blanca. Una vez se obtuvieron los adultos se establecieron colonias del insecto mediante la cría en dieta artificial.

En laboratorio se realizó un ensayo de alimentación de H. obscurus y H. hampei con frutos y granos de café. Inicialmente se tomaron 100 cerezas de café (Coffea arabica var. Colombia) con 22 a 30 semanas de desarrollo y se depositaron sobre cajas plásticas. Estos frutos se infestaron en una proporción de 1:1 con 100 hembras adultas de Falsa Broca provenientes de la colonia en dieta artificial de macadamia (Cenibroca modificada). Del mismo modo, otros 100 frutos de café con las mismas características se infestaron con hembras fértiles de Broca del Café criadas sobre café pergamino del 47% de humedad. En otro experimento, granos de café pergamino del 47% de humedad se individualizaron en 80 viales de vidrio borosilicato (12 × 35mm) con tapa plástica y se infestaron con un adulto hembra de H. obscurus y de H. hampei (40 repeticiones/especie). Estas muestras se mantuvieron en condiciones de laboratorio de 26±1°C de temperatura y 80±2% de humedad relativa (HR).

Los frutos y granos de café se disecaron 12 días después. Se registró el número de frutos y granos perforados, la posición de los adultos de cada especie en frutos y granos de café y la presencia de estados inmaduros.

Con el fin de describir el ciclo de vida (huevo a adulto) de las dos especies de Hypothenemus, se realizó un experimento con dietas artificiales. La unidad experimental estuvo conformada por un vial de vidrio (60 x 25mm) esterilizado con 1 g de dieta artificial Cenibroca (café) y Cenibroca modificada (macadamia), conteniendo una hembra fértil de cada especie en cuatro tratamientos (Tabla 1): T1 dieta de macadamia con H. obscurus, T2 dieta de macadamia con H. hampei, T3 dieta de café con H. obscurus y T4 dieta de café con H. hampei. La infestación de las dietas se realizó con adultos de Falsa Broca y Broca del Café desinfectados con una solución al 3% de hipoclorito de sodio con tres lavados durante tres minutos y un enjuague con agua destilada para evitar contaminación en las dietas. Los viales se ubicaron dentro de cajas plásticas de color negro sobre estantes metálicos para evitar la entrada de luz y semejar los hábitos crípticos del insecto. Este experimento se mantuvo en las mismas condiciones de laboratorio descritas anteriormente. Por cada tratamiento se tuvieron 30 repeticiones, asignadas bajo un diseño completamente aleatorio. Se evaluó la oviposición de las hembras y el número de estados biológicos de cada especie en las dietas artificiales a los 28 y 35 días después de infestadas. Los datos se analizaron por medio de la estimación del promedio y del coeficiente de variación por tratamiento, con un análisis de varianza al 5% bajo un modelo con un diseño completamente aleatorio y prueba de Tukey (p<5%) entre tratamientos. Se determinó la duración del ciclo de vida de ambas especies a partir de las unidades experimentales de los tratamientos (T1) y (T4).

Comparación morfológica entre H. obscurus y H. hampei. Se tomaron fotografías mediante Microscopia Electrónica de Barrido (MEB), para lo cual los adultos de ambas especies se fijaron en solución de glutaraldehido (2,5%) con buffer fosfato (0,1M; pH7,4) por 48 horas y luego se sometieron a deshidratación en una serie gradual de diferentes concentraciones de etanol (80, 90 y 100%) durante 20 minutos; luego las muestras se sumergieron en etanol:xileno (1:1) durante 12 horas y después se transfirieron a etanol 100% por 20min. El secado por punto crítico con CO2 se realizó en una cámara de vacio Tousimis 780 (Rockville, MD). Los especímenes adultos se colocaron sobre un portaobjeto adherido con cinta transparente de doble faz en posición lateral, dorsal y ventral, con 10 individuos por cada especie. Las muestras se sometieron a fase de metalizado con Oro y Paladio de 18nm cubiertas con un pulverizador y visualizadas en el Microscopio Electrónico de Barrido (JEOL JSM-820, Tokio), de la Unidad de Virología del CIAT, Palmira, Colombia.

Evaluación de partenogénesis. Para determinar si H. obscurus y H. hampei presentaron sistema de reproducción partenogenética, por especie se individualizaron 50 pupas hembras en viales de vidrio con dieta de macadamia y café respectivamente. La diferenciación de sexos en las pupas de ambas especies se logró gracias a que ambas especies presentaron claro dimorfismo sexual, siendo los machos más pequeños, con cuerpo más recurvado y ápteros. Los viales se mantuvieron bajo condiciones controladas de temperatura de 26±1°C y humedad relativa de 80±2% en cajas multiuso plásticas de color negro. Se tomaron lecturas cada semana hasta 50 días después para contabilizar y determinar la presencia o ausencia de posturas y el desarrollo de las progenies.

Análisis citogenético de H. hampei y H. obscurus. Para comparar células somáticas de H. hampei y H. obscurus, larvas y pupas de ambas especies se prepararon tejidos procedentes de la unidad de cría de broca en el laboratorio de Entomología de CENICAFE, Colombia. Se usó el método de microcentrifugación de Camargo et al. (2006) con algunas modificaciones. Cada individuo se sumergió en solución hipotónica (NaCl 44mM; CaCl₂ 0,90 mM; KCl 1,34mM; Na- HCO₃ 1,19mM; Colchicina 1%) durante 2h, después de la primera hora, los individuos se maceraron suavemente usando un pistilo plástico para obtener una suspensión celular. Posteriormente, las suspensiones celulares fueron fijadas en Carnoy (4 etanol: 1 ácido acético). La suspensión celular fue preparada por medio de dispersión mecánica de los tejidos, haciendo entre ocho y 10 movimientos suaves con una micropipeta. Las células fueron colectadas por centrifugación durante 4 min a 3000rpm en una microcentrífuga a temperatura ambiente, el sobrenadante se descartó y el botón celular fue resuspendido en fijador fresco. Esta suspensión se centrifugó nuevamente y se resuspendió en 15μL de fijador fresco. Después, 10mL de la suspensión fue goteada desde una altura de 20 a 30cm sobre láminas de porta objetos limpias y enfriadas en agua-hielo. Las láminas goteadas se secaron por flameo y después se tiñeron por 5min con solución Giemsa (5% en H₂O). Las bandas C se prepararon usando el procedimiento descrito por Schwarzacher et al. (1980) con algunas modificaciones. Las láminas goteadas se hidrolizaron después de tres días con una solución de ácido acético (45%) a 60°C por 10 minutos. Posteriormente, se incubaron en Ba(OH)2 a 25°C por 10min y en buffer 2xSSC (pH 7,0) a 60°C por 80 min. Las láminas secas se tiñeron con Giemsa (4%) por 5 minutos. Todas las observaciones y las fotomicrografías se realizaron en un microscopio Nikon Eclipse 90i, las imágenes se capturaron con la cámara integrada usando un software Lucia v5.3 y se procesaron en el programa Adobe Photoshop CS3.

Desarrollo de perfiles genéticos. Los perfiles genéticos de ambas especies se obtuvieron mediante la técnica de AFLP (Polimorfismos Amplificados de Longitud de Fragmentos), utilizando el sistema de análisis II de AFLP (GIBCO Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) según la metodología de Vos et al. (1995). Para estos ensayos se usaron tres combinaciones de cebadores específicos EcoRI/MseI (AC/CTG, AA/CTG, AA/ CTC) a partir de ADN de 10 adultos para cada especie. El ADN fue extraído con el kit Dneasy Tissue-Qiagen (Valencia, CA, USA.). Los amplificados se visualizaron en geles de poliacrilamida (5%) preparados en cámaras de electroforésis vertical (OWL Thermo Fisher Scientific Inc, Portsmouth, NH) y se revelaron por tinción con AgNO₃ según la metodología de Bassam et al. (1991).

Aspectos biológicos de H. obscurus y H. hampei. Las hembras de H. obscurus perforan el pericarpio del fruto de macadamia a través de la corona o cicatriz del cáliz floral cuando el fruto aún está verde y no en la parte lateral del endocarpo como fue reportado anteriormente (Jones et al. 1992; Villegas 1998) (Fig. 1A); posteriormente, ellas perforan el endocarpo inmaduro para poder entrar en el endospermo o nuez, donde barrenan y forman galerías y cámaras en su interior. Una vez adentro, ovipositan entre 10 y 30 huevos y completan su ciclo de vida (Fig. 1C). Posteriormente se aparearon y las hembras rompieron la parte lateral del endocarpo, abriendo varios orificios circulares por donde emergieron los adultos en busca de nuevos frutos para colonizar (Fig. 1E). La contextura externa lisa y dura del endocarpo, la cual no permite apoyo y fricción al insecto, podría ser la explicación para que no pueda penetrar lateralmente. Una situación diferente se presenta cuando los frutos están secos, ya que el endocarpo se vuelve extremadamente duro y se dificulta la salida de las hembras de la nueva generación. En este estudio se observó que más del 80% de las hembras muertas halladas dentro de frutos secos presentaron los dientes de las mandíbulas completamente desgastados y un gran número de perforaciones parciales no finalizadas de adentro hacia afuera del endocarpo en frutos colectados del campo (Fig. 1D).

Además del daño mecánico directo ocasionado por el insecto al alimentarse y destruir las almendras, los orificios de entrada y de salida son la puerta de entrada a esporas de hongos saprofitos que contaminan la nuez, causando mayores pérdidas de calidad y disminución del valor comercial de la almendra, tal como lo reporta Jones et al. (1992).

H. obscurus logró perforar 59% de las cerezas de café, pero sólo el 3% logró roer los granos superficialmente. No se observaron galerías dentro de los granos y sólo un huevo fue depositado en el interior de un grano. H. hampei por el contrario, perforó el 96% de las cerezas de café, el 66% de los granos y ovipositó en el 8% de ellos a los 12 días de la infestación. Sobre café cereza se encontraron estados inmaduros en el 32,5% de los frutos infestados con Falsa Broca, con un promedio de 5,3 estados por fruto alimentándose de pulpa y mucílago en el espacio que separa los dos granos; estos estados larvales lograron desarrollarse hasta adulto. La totalidad de los frutos de café perforados por H. hampei contenían estados inmaduros en el interior de las almendras con un promedio de 40 estados por grano. Estos resultados confirman las observaciones previas (Vélez 1997; Bustillo 2006). Estos resultados indican que bajo las condiciones de laboratorio, H. obscurus tuvo la capacidad de perforar y desarrollarse en cerezas de café, alimentándose del mucílago y pulpa de las cerezas sin realizar daño a las almendras. Se confirman los hábitos polífagos de H. obscurus, incluido el café, tal como lo reportan Vélez (1997) y Wood (2007). A pesar de que estas pruebas se realizaron en laboratorio y los insectos fueron expuestos a una sola posibilidad de alimento, no se esperaría en condiciones naturales en Colombia que la Falsa Broca ofrezca una amenaza al cultivo del café, ya que los registros citados de Falsa Broca en frutos de café en otros países tampoco reportan daño a las almendras (Wood 2007).

Las evaluaciones de cría de H. obscurus en dieta artificial Cenibroca modificada (macadamia) permitieron observar que la adición de sólo endospermo, producía una película lipídica que no permitía el normal desarrollo de los estados del insecto. La proporción de los componentes provenientes de macadamia que permitieron la cría de la Falsa Broca fue de 20% de endospermo con 80% de pericarpio molidos (Tabla 1).

En la dieta de café, H. obscurus ovipositó en solo 10% de las unidades experimentales, en contraste con la dieta de macadamia donde ovipositó en la totalidad de ellas. El análisis de varianza mostró diferencias significativas en la capacidad reproductiva de esta especie entre la dieta de macadamia y la dieta de café a los 28 y a los 35 días (n=30; gl= 6; P=0,0001) (Tabla 2). Lo mismo se observó para H. hampei, donde esta especie no ovipositó en dieta de macadamia (n=30; gl=6; P=0,0001) (Tabla 2). Estos resultados confirman los hábitos polífagos de H. obscurus y monófagos de H. hampei tanto en dieta artificial Cenibroca (macadamia) y Cenibroca (café) como en frutos de café, mientras que Vélez (1997) solo lo reportó en frutos de café.

El ciclo de vida desde huevo hasta adulto de H. obscurus en dieta artificial de macadamia fue un poco más largo que el de H. hampei (Tabla 3). Estos resultados registran por primera vez la cría de H. obscurus en dieta artificial bajo condiciones de laboratorio. Se encontró una proporción sexual (macho: hembra) de 1:12 en H. obscurus y 1:10 en H. hampei. Estas diferencias de radio sexual podrían estar relacionadas con la probacteria Wolbachia y su efecto en la determinación sexual de estas especies, de la manera como ha sido reportada como distorsionador de la determinación sexual en varios insectos (Benavides 2008) y su presencia en la Broca del Café fue confirmada (Vega et al. 2002). Se presume que en la Falsa Broca se podría presentar esta misma situación. Entre los mecanismos reportados como un distorsionador en la determinación sexual de insectos está la feminización o conversión sexual en el cual individuos genéticamente machos se convierten en hembras funcionales (Rousset et. al. 1992) y la incompatibilidad citoplasmática, en al cual la fertilidad depende de la ausencia o la presencia de la probacteria en el macho o la hembra (O´Neill et al. 1997; Benavides 2008).

Comparación morfológica entre H. obscurus y H. hampei. Los huevos de las dos especies son de color blanco hialino, lisos y de forma elíptica (Figs. 2A, F), siendo un poco más grandes en H. hampei en longitud y grosor (Tabla 4). Las larvas son blanco crema, de tipo curculioniforme, eucéfalas, ápodas y encorvadas. La cabeza es marrón claro con mandíbulas bien desarrolladas (Figs. 2B, G). Pasan por dos etapas de crecimiento o instares larvales (L1 y L2). Las pupas de ambas especies son del tipo exarata, de color blanco recién formadas y se tornan de color crema al cabo de dos días. La cabeza está cubierta completamente por el pronoto (Figs. 2 C, H) vistas dorsalmente bajo un Microscopio de Luz (ML). Los adultos de H. obscurus son negro brillante, de forma cilíndrica (vistos dorsalmente), el cuerpo está recubierto de setas achatadas en forma de bate en su extremo. Las formas adultas jóvenes recién formadas, cuando la cutícula del cuerpo aún no está completamente melanizada, son de color castaño claro acaramelado, pero al cabo de dos días se tornan de color negro. Las hembras son de mayor tamaño que el macho (Tabla 4) (Figs. 2 I, J) y presentan alas membranosas bien desarrolladas y funcionales. Los machos carecen de alas membranosas y permanecen todo el tiempo dentro de los frutos apareándose con las hembras de su misma progenie. En H. hampei, los adultos son más grandes que H. obscurus y presentaron setas filiformes (Figs. 2 D, E) vistos con un Microscopio de Luz (ML). La forma del pronoto es semicircular en H. obscurus como en H. hampei pero con la superficie reticulada y rugosa que es lisa en H. hampei. El pronoto visto en forma dorsal, cubre completamente la cabeza en los dos sexos de ambas especies. La hembra de H. obscurus, de perfil, muestra una línea dorsal más o menos recta, mientras que en H. hampei es levemente curvada (Figs. 2 D, I). En los machos, en cambio presentan un arco más pronunciado y comprende todo el perfil del borde anterior del protórax y la extremidad apical de los élitros (Figs. 2 E, J) siendo más pronunciado en H. hampei que en H. obscurus. Según Wood (2007), un carácter diagnóstico de la Falsa Broca es la frente de la cabeza de forma convexa y amplia, con un surco profundo y estrecho en el área medial desde el nivel superior de los ojos hasta el borde del epistoma; sin embargo, este es un carácter débil frente a H. hampei.

Las mandíbulas en las dos especies, son estructuras fuertemente esclerotizadas, articuladas dorsolateralmente, situadas en la región anterior de la cabeza y de forma triangular (Figs. 3 A, B); poseen dos regiones, una región ventral, en donde se observan tres incisivos diseñados para cortar y en la región dorsal un molar amplio que facilita la trituración del material alimenticio. El tercer incisivo en H. obscurus es más desarrollado y visible al que presenta H. hampei (Figs. 4 A, B).

Las hembras de H. hampei presentan en promedio un número aproximado de 115 omatidios (Fig. 3 C), mientras que el ojo compuesto de H. obscurus exhibe alrededor de 150 omatidios (Fig. 3 D) vistos con un Microscopio Electrónico de Barrido (MEB). Este carácter diagnóstico que no estaba documentado para H. obscurus, puede servir para separar ambas especies adultas.

El flagelo de la antena está conformado en las dos especies por ocho flagelómeros que se encuentran fusionados, los primeros cuatro y el pedicelo forman el funículo y los cuatro restantes de la región distal forman una porra o clava ovalada, que presenta una serie de setas a lo largo de las suturas que unen los flagelómeros, estas setas de la porra en H. hampei son de menor longitud comparadas con las de H. obscurus (Figs. 5 C y 6 D). Wood (2007) describe que el funículo antenal del género Hypothenemus presenta de tres a cinco segmentos, de acuerdo con lo registrado en este trabajo, las especies H. hampei y H. obscurus presentan cuatro segmentos flagelares y solamente en la región distal del cuarto flagelo se observan entre seis a ocho setas (Figs. 5A y 5 B).

Visto dorsalmente, el pronoto de los dos insectos se inclina en la zona posterior y contiene una gran cantidad de asperezas simétricas, en tipo espiral que presentan setas de diferentes formas y tamaños. Estas setas son largas, cilíndricas y de forma filiforme en H. hampei, mientras que en H. obscurus son redondeadas en su extremo, en forma de bate y se caracterizan por tener seis a siete estrías longitudinales en la puntas (Figs. 6 A a la D) vistas con un Microscopio Electrónico de Barrido (MEB). Con un Microscopio de Luz las estrías no se alcanzan a visualizar bien, solo se puede apreciar la forma de las setas. La superficie de los élitros en la Broca del Café y en la Falsa Broca es lisa y brillante, las diferencias que presentan están relacionadas en cuanto al número de estrías y la forma de las setas en las interestrías. Los élitros en las hembras de H. obscurus cuentan con 10 interestrías y nueve estrías dispuestas longitudinalmente, mientras que en H. hampei éstos presentan 11 interestrías y 10 estrías dispuestas longitudinalmente vistos con un Microscopio de Luz (ML) (Figs. 7A y 7B).

La tibia en las dos especies se encuentra recubierta de setas y presenta en la región anterior una serie de dientes que difieren en las dos especies, para el caso de H. hampei la tibia presenta una serie de seis o siete espinas en la margen distal, mientras en H. obscurus se observan ocho espinas (Figuras 7 C y 7 D). Este carácter diagnóstico no fue reportado por Wood (2007). En las dos especies estas espinas son más evidentes en las patas pro y mesotorácicas, pero en las patas metatorácicas son pequeñas y ovaladas. El abdomen en H. hampei y H. obscurus es completamente curvado en la parte dorsal, debido a que en esta región se pliegan las alas posteriores que se resguardan en los élitros. En posición ventral, las dos especies muestran cinco esternitos o placas abdominales muy diferenciadas, pero en H. hampei se presenta mayor cantidad de setas en la región ventral del abdomen.

Estudio de partenogénesis. Hubo oviposición en el 70% de los viales para H. obscurus y en más del 90% en los viales para H. hampei. El total promedio acumulado de huevos fue de 42,1±5,5 por hembra en H. obscurus y 32,4±6,4 huevos en H. hampei. Al día 50 las hembras fueron retiradas y se hizo seguimiento a las posturas durante dos meses. De un total de 1.750 huevos ovipositados por H. obscurus en 50 días y de 1.458 huevos ovipositados por H. hampei en el mismo periodo, ninguno de los huevos eclosionaron, confirmando en este estudio que H. hampei ni H. obscurus presentaron partenogénesis; esto concuerda con los trabajos de Álvarez y Cortina (2004) en Colombia y Barrera et al. (1995) en Méjico para la Broca del Café y se encuentra en contraste con los resultados de Muñoz (1989) en Honduras, y Montoya (1992), Montoya y Cárdenas (1994) en Colombia, donde una pequeña proporción de hembras no fertilizadas produjeron huevos fértiles (< 0,3%).

Estudio citogenético. El estudio de las metafases de H. hampei y de H. obscurus evidenció un número diploide de 2n=14 en las hembras y un sistema de determinación sexual en el que un set cromosómico se encuentra condensado en los machos de ambas especies (Figs. 8C, 8D). De acuerdo con las observaciones en las preparaciones cromosómicas, las hembras de H. hampei y de H. obscurus presentaron una fórmula cariotípica formada por cinco pares de cromosomas submetacéntricos y dos pares acrocéntricos. El tamaño de los cromosomas se dsitribuye para las dos especies, desde 5 a 1μm aproximadamente, tres de ellos poseen tamaños similares (Figs. 8A, 8B). Las células pro-metafásicas de machos de H. hampei y H. obscurus evidenciaron una masa condensada de uno de los componentes haploides, acompañadas de siete cromosomas (Figs. 8C, 8 D). Las células interfásicas de hembras de las dos especies se caracterizaron por la presencia de cromómeros; manchas conspicuas e intensamente teñidas que se relacionaron con un alto grado de condensación de la cromatina (Figs. 8E, 8F). El análisis cariotípico de los machos de estas dos especies revelaron que el set heterocromático haploide visto durante la metafase forma un cromocentro que usualmente está acompañado de varias manchas heteropicnóticas (Figs. 8G, 8H).

Dado que algunos cromosomas de una misma metafase presentaron similitudes macro que dificultaron su análisis, fue necesario realizar bandeo-C. Esta técnica permitió revelar selectivamente las regiones de heterocromatina constitutiva y ofreció mejor información sobre la arquitectura de los cromosomas para una mejor caracterización de los cariotipos (Fig. 9). Adicionalmente, en este estudio se confirma que el cariotipo de H. hampei y H. obscurus son muy parecidos, de hecho, ambas especies se caracterizaron por poseer una fórmula cromosómica idéntica. Podría argumentarse que H. obscurus también desarrolla el sistema genético de heterocromatización de un set cromosómico. En todos los machos de ambas especies se observó un tipo de masa heterocromática acompañada de numerosos puntos heteropicnóticos en células interfásicas y de siete cromosomas en células metafásicas. Además, las manchas heteropicnóticas observadas en interfase no necesariamente corresponden a centrómeros, debido a que el número de manchas sobrepasa en muchas ocasiones al número de centrómeros presentes en Hypothenemus. En general, entre H. hampei y H. obscurus no se lograron observar diferencias cromosómicas evidentes, esto indicaría que las diferencias citogenéticas entre estas dos especies yacen a un nivel estructural muy fino y que su divergencia evolutiva radica en rearreglos cromosómicos muy pequeños, tales como microdeleciones, microduplicaciones, microinversiones, o incluso efectos epigenéticos dados por modificaciones en la estructura de la cromatina independientes de la secuencia del ADN.

La haplodiploidía verdadera (arrenotoquía) ha sido documentada dentro de la subfamilia Scolytinae en las tribus Xyleborini y Dryocoetini (Kirkendall 1993), representando al menos el 70% de las especies de esta subfamilia. Sin embargo, la haplodiploidía funcional en Scolytinae ahora podría ser descrita en una especie más: H. obscurus, (Cryphalini), sumándose a la Broca del Café. Todas las especies haplodiploides en Scolytinae, incluyendo las especies del género Hypothenemus, comparten varias características ecológicas y reproductivas como la endogamia extrema, relación sexual basada en las hembras, machos desprovistos de alas y desarrollo de vida en galerías construidas en diversos órganos vegetales (Kirkendall 1993). Análisis filogenéticos proponen que la haplodiploidía bajo arrenotoquia evolucionó una sola vez dentro de Scolytinae para conformar un clado claramente reconocible; Xyleborini y Dryocoetini (Normark et al. 1999). Basados en esta hipótesis, la haplodiploidía funcional pudo aparecer una vez en la tribu Cryphalini dentro de un clado formado por los géneros Hypothenemus, Cryptocarenus, Trischidias y Periocryphalus (en Cryphalini se describen cerca de 25 géneros), conocidos como endogámicos y con radios sexuales basados en las hembras (Wood 2007). A pesar que en Cryptocarenus, Trischidias y Periocryphalus no existen datos citogenéticos que soporten la haplodiploidía funcional, es probable que este sistema genético esté presente en estos géneros dado que comparten las características ecológicas y reproductivas con otras especies haplodiploides en Scolytinae (Vega et al. 2002).

Desarrollo de perfiles genéticos de H. obscurus y H. hampei. Las especies compartieron el 14,9% de los 254 marcadores generados con las combinaciones evaluadas; sin embargo, el agrupamiento generado a partir del análisis de distancia realizado bajo el algoritmo de UPGMA, identificó las especies. El índice de similitud de Jaccard se calculó utilizando la información generada mediante AFLP, encontrando valores de similitud de tan solo 0,184/1,0, los cuales son bastante bajos y comunes en individuos de especies distintas (Fig.10).

A pesar de que H. hampei y H. obscurus provienen de diferentes centros de origen, África y América, y que atacan diferentes cultivos de importancia económica como son café y macadamia, la similitud en sus características morfológicas, biológicas y genéticas son sorprendentes. Los estudios morfológicos entre los adultos de estas dos especies permitieron identificar caracteres no documentados previamente (Vélez 1997; Wood 2007); el número de estrías longitudinales en los élitros, la cantidad de omatidios en los ojos compuestos, las espinas en las tibias de las patas protorácicas y la forma de los dientes en las mandíbulas, se convierten en caracteres diagnósticos de estas especies. A nivel biológico, se documentó el modo de alimentación y penetración de las hembras de H. obscurus en frutos de macadamia, el cual controvierte los reportes previos (Jones et al. 1992; Villegas 1998). Se determinó en este estudio el ciclo de vida completo de H. obscurus, por primera vez en una dieta artificial de macadamia, en condiciones de laboratorio. Se confirman los hábitos polífagos de H. obscurus y monófagos de H. hampei. A nivel genético, aunque los perfiles genéticos indicaron clara diferenciación de especies, ninguna especie evidenció partenogénesis; los estudios citogenéticos y reproductivos documentados aquí por primera vez para H. obscurus, indican que son similares a los reportados para H. hampei, como el número y estructura cromosómica, la condensación de un juego cromosómico en los machos, pseudoarrenotoquía y un alto grado de endogamia.

El estudio de una especie tan cercana a la Broca del Café es importante para determinar las condiciones biológicas y genéticas que la llevaron a adquirir una alta especialización al cultivo del café. Las diferencias entre estas especies yacen en caracteres moleculares mínimos que han ofrecido respuestas adaptativas y evolutivas complejas. Le proseguirá a esta investigación el análisis de la expresión génica de ambas especies criadas en café para identificar los genes y rutas metabólicas necesarias en la broca durante su desarrollo y reproducción sobre granos de café, paso intermedio en la exploración de nuevas estrategias de control genético y etológico para el manejo de ambas plagas.