Roger D Salgado^1,3 , MVZ,MSc; Clara C Rugeles^2,3, MVZ,MSc; Jaime Alvarez^1,3 , MVZ, Esp

^{1 2} Programa de Reproducción animal Programa de morfofisiología

³ Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Universidad de Córdoba

rodasao@yahoo.es

(Recibido: 21 octubre, 2004; aceptado: 9 junio, 2005)

Resumen

El objetivo de este estudio fue evaluar el efecto de diferentes concentraciones de heparina y de semen en el medio de fertilización sobre el porcentaje de oocitos bovinos fertilizados in vitro. En el experimento uno, los oocitos obtenidos de ovarios de matadero fueron madurados in vitro y distribuidos al azar en seis tratamientos para fertilización in vitro, de acuerdo a las concentraciones de heparina (2, 4, 8, 10, 16, 20 µg/ml). En el experimento dos, una vez seleccionada la concentración de heparina en experimento 1, se evaluaron tres dosis de espermatozoides en el medio de fertilización (0.5x10⁶ espermatozoides/ml, 1x10⁶espermatozoides/ml y 2x10⁶espermatozoides/ml). En cada experimento se utilizó un diseño completamente al azar y los datos fueron analizados por ANAVA. La concentración de heparina tuvo efecto (p<0.05) en el porcentaje de oocitos fertilizados encontrándose los mejores resultados en la concentración de 10 µg/ml, con una tasa de penetración del 67%. La concentración espermática afecta la fertilización, encontrándose la mayor proporción de oocitos con fertilización normal (74%) al utilizar concentración 2x10⁶ espermatozoides/ml. Sin embargo, no fue significativamente diferente a la concentración de 1x10⁶ (p>0.05). Los resultados indican que la tasa de fertilización guarda relación directa con la dosis de heparina y la concentración espermática.

Los espermatozoides mamíferos no son capaces espermatozoides a través del tracto reproductivo de fertilizar oocitos inmediatamente después que son femenino y la reacción acrosómica cuando los depositados en el tracto reproductivo femenino; espermatozoides se unen a la zona pelúcida (14,15), ellos primero tienen que sufrir un periodo de mientras que in vitro, una de las formas preparación llamado capacitación. Durante la ampliamente utilizadas consiste en la exposición del capacitación se dá la alteración de la membrana semen a la heparina para que puede adquirir la plasmática para permitir al espermatozoide realizar capacidad fertilizante. De esta manera, el objetivo la fusión de la membrana plasmática y membrana de este trabajo fue evaluar diferentes acrosomal externa, denominada reacción concentraciones de heparina y número variable de acrosómica. In vivo, la capacitación espermática células espermáticas para alcanzar óptimos es adquirida durante la migración de los resultados en fertilización de oocitos bovinos in vitro.

Los ovarios fueron obtenidos de vacas sacrificadas en matadero, colocados en solución salina 9% a una temperatura de 30-35ºC. y transportados al laboratorio en un tiempo de 30 minutos. La colección de oocitos y la maduración in vitro (IVM) fueron realizadas por el método previamente descrito por Chacón y Estrada (3). El medio de maduración consistió en: medio-199 con 0.026M de bicarbonato de sodio, pH 7.4; suplementado con 10% (v/v) de suero de vaca en estro recolectado el primer día del estro e inactivado a 56ºC por 30 minutos.; 0.2mM piruvato de sodio, 50mg/ml gentamicina, 80UI/ml HCG, 1mg/ml de 17-β estradiol, y 45mg/ml de FSH porcina. Todos los cultivos fueron realizados con una tensión de 5% CO₂ en aire, a 39ºC y humedad relativa del 90%.

De los oocitos seleccionados como buenos (complejo cumulus-oocito no expandido y citoplasma granulado y homogéneo) se seleccionaron grupos de 10-12 oocitos al azar, los cuales fueron transferidos dentro de gotas de 50ml en discos de cultivo estériles 60 x 15mm cubiertas con 10 ml de aceite mineral previa estabilización de las gotas mínimo 2 horas y cultivados en una incubadora por 24 horas a 39 ºC en una atmósfera de aire con 5% de CO₂ y una humedad relativa del 90 %.

Después de la maduración los oocitos fueron transferidos al medio de fertilización donde fueron divididos aleatoriamente en seis tratamientos de acuerdo a la concentración de heparina en el medio de fertilización (4, 8, 10, 16 y 20 mg de heparina/ml). Se realizaron tres réplicas por tratamiento con un número de oocitos alrededor de 20 por réplica y en cada réplica la concentración de esperma fue 1x10⁶ / ml. Después de 18 horas de fertilización los oocitos fueron fijados en una solución de una parte de ácido acético y tres de metanol, por 24 horas, después fueron teñidos con orceina al 2% para evaluación de fertilización. La concentración de heparina que se seleccionó fue aquella que produjo el mayor porcentaje de fertilización (oocitos con dos o más pronúcleos). La evaluación de fertilización se realizó teniendo en cuenta la descripción de los estados de desarrollo pronuclear realizada por Xu y Greve (20).

La técnica utilizada para preparar los espermatozoos bovinos para (fertilización in vitro) IVF y aumentar el porcentaje de células espermáticas móviles fue el método conocido como Swim-up previamente descrito por Parrish et al (13).

Una vez seleccionada la concentración de heparina en la primera parte, se evaluaron tres dosis de espermatozoides del eyaculado de un toro de raza holstein (0.5x10⁶ espermatozoides/ml, 1x10⁶ espermatozoides/ml y 2x10⁶ espermatozoides/ml). A las 18 horas pos- fertilización los oocitos fueron fijados en una solución 1:3 de ácido acético y metanol, respectivamente, durante 24 horas. Luego fueron teñidos con una solución de orceína al 2% para evaluar la fertilización. La concentración de espermatozoides seleccionada fue aquella que produjo la máxima fertilización con el mínimo de polispermia. Se realizaron un total de tres réplicas por tratamiento.

Discusión

La proporción de penetración (67%) que se obtuvo con una concentración de 10 mg/ml es similar al valor reportado en la literatura, el cual oscila entre 2- 100 mg/ml, siendo la concentración de 10 g/ml la más comúnmente usada (19). Estas diferencias se deben a que el efecto de la heparina es dosis dependiente y varía para cada toro, como lo demuestran Parrish et al (13,14), Saeki et al (18) y Niwa y Ohgoda (11), y además puede estar relacionado con la mayor producción de proteínas fijadoras de heparina en el semen. De acuerdo con Kim (7), la presencia de proteínas fijadoras de heparina se relaciona con porcentajes de fertilidad de 67 a 87% y su funcionamiento es afectado por la osmolalidad del medio empleado.

La mayor proporción de oocitos con fertilización normal (74%) fue obtenida con una concentración de 2x10⁶ espermatozoides/ml, pero al mismo tiempo produjo el mayor porcentaje de polispermia. Entretanto esta concentración de esperma no fue significativamente diferente a la de 1x10⁶ (p> 0.05). Estos resultados concuerdan con los reportados por Hernández -ledezma et al (6); Saeki et al (18); Van Inzen et al (21); Lu KH, Seidel GE Jr. (10), los cuales encontraron que la concentración óptima de semen fue de 1x10⁶ espermatozoides/ml y además reportaron que a medida que se aumentaba la concentración de espermatozoides en el medio de fertilización se incrementaba la incidencia de poliespermia, contrario a lo reportado por Kurtu et al (8) quienes no encontraron este efecto (p< 0.05) al aumentar la dosis seminales por encima de 0.5x10⁶ espermatozoides/ml, cuando utilizaron el mismo toro. Por otro lado la incidencia de poliesperrmia, según Saeki et al (18), podría relacionarse con la presencia de proteínas séricas al suplementar el medio con suero de vaca en estro.

Saeki et al (18), Van Inzen et al (21), Lu KH, Seidel GE Jr (10), reportan concentraciones fertilizantes de por lo menos 1x10⁶ espermatozoides/ml, si consideramos que trabamos con gotas de 50 ul para grupos de 10 a 12 oocitos, la concentración de la dosis final sería de 50.000 espermatozoides /gota.

Otros autores como Pinyopummintr y Bavister (16), Ferry et al (5), Rieger et al (17), Leven K et al (9) y Camargo et al (1, 2) trabajaron con una concentración espermática superior, de 1.8 y de 2x10⁶, sin reportar el alto grado de polispermia. Camargo (2) con sistema de co-cultivo reporta un 87% de oocitos divididos y 37.5% de blastocitos eclosionados, con dosis espermática de 1.8 x10⁶, sin embargo recomienda el uso de dosis fertilizante de concentraciones a partir de 1 x10⁶.

Summary

Heparin and spermatic concentration effect over the percentage of in vitro fertilization of bovine oocites.

The objective of this study was to evaluate the effect of different heparin concentrations and of the semen in the percentage of bovine oocytes in fertilization medium. In the experiment 1, the obtained oocytes of slaughterhouse ovaries were matured in vitro and distributed at random in six treatments for fertilization in vitro, according to the heparin concentration (2, 4, 8, 10, 16, 20 µg/ ml). In the experiment 2, once selected the heparin concentration from experiment 1, three sperms doses were evaluated in fertilization medium (0.5x10⁶ espermatozoas/ml, 1x0⁶ espermatozoas/ml and 2x0⁶ espermatozoas/ml). In each experiment totally randomized design was used and data were analyzed by ANAVA. The concentration of heparin (p<0.05) affected the percentage of fertilized oocytes being the best results in the concentration of 10 µg/ml, with a rate of penetration of 67%. The spermatic concentration affects the fertilization, the biggest oocytes proportion with normal fertilization (74%) when using concentration 2x10⁶ spermatozoas/ml. However, it was not significantly different to the concentration of 1x 10⁶ (p>0.05). The results indicate that the fertilization rate keeps direct relationship with the heparine dose and the spermatic concentration.

Keywords: bovine, fertilization in vitro, heparin, swim up.

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