Sandra C Pardo-Carrasco1 MVZ, MS; José A Arias-Castellanos3 Biol. PhD; Héctor Suárez-Mahecha1 MVZ, MS; Pablo E Cruz-Casallas3, MVZ, PhD; Wálter Vásquez-Torres3, Biol. PhD; Víctor Atencio-García1 Ing. Pesq., MS; Evoy Zaniboni-Filho2 Ocean. PhD.
1Centro de Investigación Piscícola, Departamento de Ciencias Acuícolas, FMVZ, Universidad de Córdoba, Kra 6 N° 67-103, Montería, Colombia.
2Departamento de Acuicultura, Universidad Federal de Santa Catarina, Florianópolis, SC, Brasil.
3Instituto de Acuicultura, Universidad de los Llanos, A.A. 110, Villavicencio, Colombia.
(Recibido: 11 abril, 2005; aceptado: 23 enero, 2006)
Resumen
]]> En hembras de yamú Brycon amazonicus de primera maduración sexual (2 años de edad), con un peso corporal (PC) de 1.500 ± 1 g y longitud total (LT) de 42.6 ± 0.1 cm, fueron probados dos inductores hormonales, extracto de pituitaria de carpa (EPC) y análogo de mamífero de la hormona liberadora de gonadotropinas (mGnRH-a). Ocho tratamientos fueron realizados: seis con mGnRH-a (10, 15 y 20µg/kg en una sola aplicación y 10, 15 y 20 µg/kg en dos aplicaciones del 10 y 90%, respectivamente), una con EPC (5.5 mg/kg en dos aplicaciones, 10% y 90%, con un intervalo de 12 horas) y un control (solución salina 0.9%). Las hembras inducidas con mGnRH-a y las hembras control no desovaron. El 83.3% de las hembras inducidas con EPC desovaron a las 6.7 ± 0.14 h a 26.9 ± 0.18 ºC (temperatura del agua), con un promedio de 117.6 ± 6.8 g de huevos por hembra y 1469.6 ± 34.1 huevos por gramo. La tasa de fertilidad presentó un promedio de 55.3 ± 6.1% seis horas después de la fertilización (HDF) y 51 ± 5.8% de sobrevivencia embrionaria a 10 HDF. La eclosión sucedió a las 12 HDF. Solamente las hembras inducidas con EPC presentaron un crecimiento significativo del diámetro ovocitario (p<0.05) de 1086 a 1178 µm.Palabras clave: Bryconinae, cultivo, reproducción.
Introducción
De las más de 40 especies del género Brycon, se destaca por su potencialidad para la piscicultura continental del neotrópico (28) el yamú Brycon amazonicus (Spix y Agassiz, 1829), cuyo sinónimo más conocido es B. siebenthalae (Eigenmann, 1912) (15). Sobresale por su rápido crecimiento, hábito alimenticio omnívoro y características sensoriales excelentes (2,17). Es un pez reofílico, nativo de la cuenca del río Orinoco, que no se reproduce espontáneamente en cautiverio y que gracias a las ventajas anteriormente descritas, los piscicultores lo producen con fines industriales.
Algunos métodos para mejorar las técnicas de inducción a la reproducción y de producción de semilla de yamú han sido desarrollados (19) con el objetivo de suministrar alevinos en forma estable para su cultivo, un asunto vital para la consolidación de la especie en la acuicultura industrial (3).
Evaluar diferentes inductores, buscando mejorar el desempeño reproductivo y disminuir los costos, es importante cuando se trata de optimizar las técnicas reproductivas hormonales. La hipofización, considerada como la primera generación de inductores para el desove, ha sido muy usada desde 1930 (5). Sin embargo, el extracto de hipófisis de carpa (EPC), presenta algunas desventajas como su alto costo (31), variabilidad en la calidad y cantidad de hormonas presentes (14) especialmente en el contenido de gonadotropinas (GtH), contenido adicional de otras hormonas y la posibilidad de transmitir enfermedades (33). De acuerdo con Donaldson (5), las tecnologías de la tercera generación involucran el uso de análogos de la hormona liberadora de gonadotropinas (GnRH-a) con o sin antagonistas de dopamina como el domperidone, el pimozide y la metaclorpramida, en sus muchas formas de aplicación. Zohar y Mylonas (34) mencionaron que por lo menos tres ventajas han sido identificadas para el uso de GnRH-a en la inducción de la reproducción. Primero, es una molécula pequeña de 10 aminoácidos que no genera respuesta inmunológica. Segundo, se induce la liberación de GtH endógeno y se desencadenan desde un nivel superior los procesos de maduración final, ovulación, desove y espermiación, proporcionando una mejor integración de las hormonas necesarias para la reproducción. Tercero, debido a su simplicidad es una molécula que puede sintetizarse en laboratorio, evitando el riesgo de transmisión de enfermedades.
Estudios recientes han determinaron la presencia de más de una forma de GnRH en el cerebro de los peces (23, 29) con varias funciones y potencialidades, generando hipótesis para explicar las variables eficiencias de cada tipo de GnRH en los peces.
De otra parte, determinar el estado de maduración sexual es importante para decidir someter a los peces a inducción hormonal. Características como el diámetro ovocitario, la posición de la vesícula germinal y el factor de condición relativa (Kn), pueden ayudar a reconocer las hembras listas para inducción. Varios autores concuerdan que en miembros de la familia Serrasalmidae (Piaractus mesopotamicus) y algunos de la Bryconidae (Brycon cephalus), aparecen como características de madurez las siguientes: la distribución del diámetro ovocitario podría ser unimodal y superior a cierto tamaño de acuerdo con la especie (27), la vesícula germinal podría estar en posición central o migrando hacia la periferia (8) y para Brycon insignis, el Kn podría ser superior a 1 (1).
Los objetivos del presente estudio fueron determinar los parámetros reproductivos de las hembras de yamú y comparar el efecto de dos inductores hormonales, el EPC y diferentes dosis y protocolos de mGnRH-a en la inducción a la ovulación y al desove.
]]> Materiales y métodos
En el Instituto de Acuicultura de la Universidad de los Llanos localizado en Villavicencio, Colombia a una latitud 4o 05 ‘ N, longitud 73o 37 ‘ O, y una altitud de 420 m, ejemplares de yamú fueron obtenidos por inducción hormonal con EPC de individuos capturados en el río Meta. Durante el segundo año de vida, los futuros reproductores fueron manipulados mensualmente buscando un cierto grado de“domesticación”. Fueron mantenidos en estanques de tierra a una densidad de 300 g/m2, alimentados con una ración del 30% de proteína bruta y 3000 kcal. A los dos años de edad alcanzaron la madurez sexual, con un PC 1.5 ± 0.001 kg y LT 42.6 ± 0.1 cm. Fueron seleccionados inicialmente de acuerdo con características externas de maduración sexual como abdomen suave, papila genital rojiza y mediante biopsia ovárica se verificó el estado de maduración. Los reproductores se distribuyeron completamente al azar entre los tratamientos. La temperatura, la humedad relativa y la precipitación durante el tiempo de los experimentos fue de 26.4 oC, 84.5% y 516.1 mm respectivamente. Los parámetros físico químicos del agua presentaron pequeña variación, con valores promedios de 27.6 ± 0.1 oC de temperatura, 7.9 ± 0.4 mg/l de oxígeno disuelto y 6.5 ± 0.1 de pH.
Los tratamientos aparecen descritos en la tabla 1. Las hormonas usadas fueron: Extracto de pituitaria de Carpa (EPC) (Argent, USA) y análogo de mamífero del factor liberador de gonadotropinas (mGnRH-a) (DAla6, des-Gly10, Sigma Co., St Louis, Missouri) En todos los casos, el diluyente fue solución salina y las aplicaciones se hicieron en la musculatura dorsal.
A través del uso de un catéter plástico, se tomaron tres muestras de ovocitos (9) de cada hembra, una al momento de la selección, otra al tiempo de la segunda dosis y la tercera al momento del estrujamiento. A las hembras que no ovularon, la tercera muestra se les tomó dos horas después de ocurrida la ovulación y el desove en las demás. Las muestras fueron preservadas en formol bufferado 3.7% y posteriormente se midieron 100 ovocitos de cada muestra con la ayuda de un estéreo microscopio; el diámetro de los ovocitos fue determinado y la distribución de frecuencia se graficó. En la primera y tercera muestra, se clarificaron submuestras utilizando la solución de Serra (etanol 80%, formol 15%; ácido acético glacial 5%) para determinar la posición de la vesícula germinal (VG). Los estadíos de maduración del ovocito fueron clasificados como sigue: vesícula germinal central, migrando, maduro y ovocitos atrésicos en los cuales posteriormente a la adición de la solución de Serra, la vesícula germinal no se encontraba visible, la membrana externa estaba arrugada y su forma no era esférica (18).
El factor de condición relativo fue calculado con el propósito de verificar la condición apropiada de las hembras seleccionadas para el tratamiento hormonal, de acuerdo a lo propuesto por Andrade-Talmelli et al (1), Kn = Pt/Pe donde Pt corresponde al peso total del animal y Pe al peso esperado por la relación entre peso y longitud total.
Después de la última inyección, la temperatura del agua fue medida cada hora hasta completar los 160 grados hora a partir de la cual se procedió a revisar cada 15 minutos las hembras para determinar el inicio de la ovulación (19, 20). Todos los desoves fueron realizados en seco para medir la cantidad de huevos desovados por hembra y la cantidad de huevos en cada gramo de huevos. La fertilización fue hecha con una mezcla de semen de machos inducidos con EPC (19, 20). Posteriormente los huevos fueron colocados en incubadoras tipo experimental con una capacidad de 1.5 litros dejando tres incubadoras por cada hembra, como lo describen Pardo-Carrasco et al (21). Por medio de tres conteos de 100 huevos por incubadora, la tasa de fertilidad fue determinada 6 horas después de la fertilización (HDF) y la tasa de sobrevivencia embrionaria se midió a las 10 HDF en el estado de embrión avanzado (la eclosión ocurrió a las 12 HDF a 27 oC).
Para los parámetros reproductivos, la diferencia entre promedios fue probada usando análisis de varianza convencional ANOVA, seguido de test de Tukey cuando había diferencia (p<0.05). Para los diámetros ovocitarios, la frecuencia de distribución fue analizada. Para lo anterior fue utilizado el software Systac versión 7.0 (Spss Inc, 1997).
]]>Resultados
Las hembras inducidas con mGnRH-a y las del control no desovaron. En hembras inducidas con EPC el porcentaje de desove fue del 83.3%. El tiempo de latencia (horas trascurridas entre la última inyección y la liberación de huevos) fue de 6.7 ± 0.14 h a 26.9 ± 0.18 oC (véase Tabla 2).
El diámetro ovocitario inicial para todas las hembras tuvo una distribución unimodal, la cual osciló entre 1000 y 1125 µm, con un valor mínimo de 800 µm y un máximo de 1450 µm sin diferencia significativa entre hembras (p>0.05). Solamente las hembras tratadas con EPC presentaron un crecimiento significativo del diámetro ovocitario entre las tres muestras tomadas (p<0.05) de 1086 a 1178 µm, presentando una moda de 1250 µm, el valor mínimo de 1000 µm y máximo de 1450 µm (véase Figura 1).
]]> La vesícula germinal al comienzo del experimento fue encontrada con 7.54 ± 1.2% en estado central; 80.2 ± 1.7% migrando; 7.66 ± 0.9% maduro y 4.62 ± 1.1% en estado atrésico sin presentar diferencias entre los tratamientos. Al final del experimento, las hembras tratadas con EPC presentaron progreso en la migración de la vesícula germinal con 6.2 ± 3.2% en estado migrando, 74.9 ± 5.3% maduro y 18.85 ± 4.9% en estado atrésico, a diferencia de las hembras inducidas con mGnRH-a y de las control que no presentaron signos de avance en la maduración final (p<0.05) (véase Figura 2). La mortalidad postinducción de los reproductores fue del 10%.
Discusión
Los parámetros reproductivos de las hembras concuerdan con lo reportado en investigaciones previas de los autores (19), se presenta un porcentaje de éxito levemente mejor para las hembras inducidas con EPC, lo cual indica que nuevos experimentos deben ser conducidos a fin de mejorar este índice. Sin embargo, Lam (14) menciona las desventajas de la hipofización, los extractos de pituitaria son impuros produciendo una acción inesperada, creando dificultad para alcanzar una respuesta positiva en el 100%. La tasa de mortalidad después de la inducción disminuyó en relación a las investigaciones previas (20%) (19), condición que podría explicarse como resultado de la mayor manipulación de los reproductores y mostrando una cierta adaptación a los procesos en cautiverio.
Resultados negativos en experimentos similares con GnRH en Brycon han sido obtenidos por diferentes autores (12, 19, 24) y varios aspectos pueden ser discutidos al respecto. La posibilidad de un efecto del estado de maduración puede ser descartada, todas las hembras fueron seleccionadas en igualdad de condiciones, con diámetros ovocitarios superiores a 1000 µm y con el 80.2 ± 1.7% de los ovocitos con la vesícula germinal migrando hacia la periferia, evidencia que habían iniciado la maduración final. De otra parte, los experimentos fueron realizados entre abril y mayo, meses que hacen parte del período reproductivo del yamú, el cual se extiende de marzo a junio (2). Otros eventos que pudieron tener influencia en la efectividad del mGnRH-a, son el tipo de análogo utilizado de GnRH (16), la vía de aplicación (18) y la combinación de mGnRH-a con un antagonista de la dopamina (22).
En el presente estudio, es probable que la causa de la respuesta negativa sea la ausencia de un bloqueador de los factores inhibidores de la liberación de gonadotropinas (GRIF) como domperidone o metaclorpramida, método conocido como LINPE (22). Ramos (25) tuvo éxito usando el método LINPE en Brycon cephalus, resaltando que el mGnRH-a con domperidone no fue efectivo a las dosis probadas (10 µg/kg en una o dos aplicaciones + 5 mg/Kg a 15 mg/ kg, respectivamente), pero cuando lo combinaron con metaclorpramida (10 µg/kg en una aplicación + 10 ó 20 mg/kg, respectivamente) tuvo acción positiva en la inducción. El Ovaprim® (Laboratorio SYNDELL, Canadá) fue solamente efectivo cuando lo usaron al doble de la dosis recomendada por el fabricante (1 ml/ kg). El trabajo de Ramos (25) muestra que no todas las sustancias usadas para bloquear el GRIF son efectivas en este género de peces y que los efectos son dependientes de las dosis. Otra posibilidad es que el tipo de análogo utilizado no tenga receptores en la pituitaria del yamú. Estudios acerca de las formas moleculares de GnRH presente en el cerebro de los Brycon podrían dilucidar estas hipótesis. En el cerebro de Piaractus mesopotamicus y Prochilodus lineatus, han sido observados tres tipos de GnRH: de pollo (cGnRH-II), de salmón (sGnRH) y de Seabream Sparus aurata (sbGnRH) (23, 29); obteniendose resultados positivos con el uso de mGnRH-a sin bloqueador de GRIF (4, 32, 33). Sin embargo, en otros teleósteos como Carassius auratus, Oncorhynchus masou (13) y Clarias garipinus (11) fueron encontradas solamente dos formas (cGnRH-II y de Catfish Clarias garipinus cfGnRH o sGnRH) y en ellos se ha observado que es necesario usar el método LINPE para estimular la maduración final y el desove.
Esta evidencia sugiere la posibilidad que los Bryconideos presenten diferencias en relación a otros peces estudiados de América del Sur. Otro hecho, es que la liberación de gonadotropinas esta sujeta a la sensibilidad estacional del sistema GnRH, la cual es modulada por la dopamina, quiere decir esto que dependiendo del estado de maduración sexual, es o no necesario el uso de bloqueadores de GRIF (30).
Varios autores confirman el incremento del diámetro ovocitario al momento de la ovulación después de la inducción hormonal (10, 31). En B. cephalus inducidos con EPC, Romagosa (26) encontró un incremento en la frecuencia de ovocitos de mayor tamaño en la tercera muestra, así como sucedió para las hembras tratadas con EPC en el presente estudio. Este hecho evidencia un efecto positivo del EPC, mientras que en las hembras tratados con mGnRH-a no se observó incremento en el diámetro ovocitario y el desove no ocurrió.
]]> El factor de condición relativo (Kn) fue usado por primera vez por Eckmann (7) con Brycon erythropterus cf. para determinar hembras maduras. Recientemente Romagosa (26) y Andrade-Talmelli et al. (1) corroboraron su uso en Brycon insignis, determinando que valores centralizados alrededor de 1 indican hembras listas para participar en los procesos de inducción hormonal. En el presente trabajo el Kn osciló entre 0.97 y 1.01, con un promedio de 1.0, clasificando todas las hembras como aptas para la inducción.En este estudio, fue observado que el EPC estimula el desplazamiento de la vesícula germinal hacia la periferia, similar a la información reportada por Drori et al (6) para Cyprinus carpio inducida con el método LINPE y EPC.
En conclusión, bajo las condiciones experimentales mostradas, el mGnRH-a no fue efectivo en la inducción a la ovulación y el desove de yamú Brycon amazonicus, mientras que EPC fue efectivo en inducir el 83.3% de las hembras tratadas.
Agradecimientos
Los autores desean expresar sus agradecimientos al Instituto de Acuicultura de la Universidad de los Llanos - IALL por el acompañamiento del experimento, el suministro de los reproductores y el apoyo de su equipo. La financiación estuvo dada por la Universidad de los Llanos y COLCIENCIAS a través del proyecto «Maduración gonadal, reproducción inducida y alevinaje del yamú Brycon siebenthalae (1122-09- 267-98).»
Summary
Induction to maturation and ovulation of yamú Brycon amazonicus with CPE and mGnRHaIn females of yamú Brycon amazonicus of first sexual maturation (two years old, body weight (BW) 1.500 ± 1 g and total length (TL) 42.6 ± 0.1 cm), two hormonal inductors were evaluated, carp pituitary extract (CPE) and mammalian gonadotropin-releasing hormone analogue (mGnRH-a). Eight treatments were conducted: six with mGnRH-a (10, 15 and 20 µg/kg BW in single injection and 10, 15 and 20 µg/kg BW in two injections of 10 and 90%, respectively), one with CPE (5.5 mg/ kg BW in two applications, 10% and 90%, with an interval of 12 h), and one control (saline solution 0.9%). Females induced with mGnRH-a and females controls did not spawn. The 83.3% of the females induced with CPE spawned at the 6.7 ± 0.14 h at 26.9 ± 0.18 ºC (water temperature), with a mean of 117.6 ± 6.8 g per egg volume per female, and 1469.6 ± 34.1 eggs per gram. The fertility rate showed a mean of 55.3 ± 6.1% 6 hours after fertilization (HAF), and 51 ± 5.8% of embryonic survival to 10 HAF. The hatching happened at 12 HAF. Only females induced with CPE presented a significant growth of the diameter (p<0.05) of 1086 to 1178 µm.
Key words: Bryconinae, culture, reproduction.
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