Effect of centrifugation on plasma membrane and DNA of bovine spermatozoa

Efeito da centrifugação sobre a membrana plasmática e o DNA de espermatozóides bovinos

Rodrigo Urrego^{1, 2}, Zoot, MS; Andrea Ríos¹, Zoot; Martha Olivera Ángel³, MV, Dr. Sci. Agr; Omar Camargo^{1, 3}, MVZ, MS.

¹Grupo de Biotecnología Animal, Facultad de Ciencias Universidad Nacional de Colombia sede Medellín.

Medellín, Colombia.

³Grupo de Fisiología y Biotecnología de la Reproducción. Facultad de Ciencias Agrarias, Universidad de Antioquia, Medellín, Colombia.

(Recibido: 5 septiembre, 2007; aceptado: 21 febrero, 2008)

Resumen

El objetivo de este estudio fue determinar si la integridad de la membrana plasmática y el ADN de los espermatozoides pueden ser afectados por la centrifugación realizada en el proceso de lavado y selección. Los espermatozoides fueron sometidos a diferentes tiempos de centrifugación (10, 30 y 45 min); se utilizó un control negativo con espermatozoides no centrifugados y un control positivo con espermatozoides sometidos a estrés oxidativo con peroxido de hidrógeno (H₂O₂) (200 µM). Para evaluar la integridad de la membrana se utilizó la prueba hipoosmótica (HOST) y para evaluar la fragmentación del ADN se utilizó el ensayo cometa: El análisis estadístico se realizó mediante la prueba de Fisher. La centrifugación durante 10, 30 y 45 min, presentó un efecto estadísticamente significativo sobre el daño en el ADN, respecto de los espermatozoides no centrifugados (p<0.05). Además, se observó diferencia estadística significa (p<0.05) entre los espermatozoides centrifugados a diferentes tiempos con respecto al control positivo realizado con H₂O₂ (200 µM). La comparación de medias no indicó diferencia estadística significativa entre los espermatozoides no centrifugados y los centrifugados por un periodo de 10 y 30 min (p>0.05) en la reacción positiva a la prueba HOST, lo cual sí sucedió (p<0.05) al comparar los no centrifugados y los centrifugados por 45 min. El control positivo realizado con H₂O₂ presentó diferencia significativa (p<0.05) con el resto de los tratamientos. En conclusión, los resultados del presente trabajo sugieren que la centrifugación de los espermatozoides durante 10, 30 ó 45 min a 700 x g para la realización del gradiente diferencial de Percoll, tiene un efecto deletéreo sobre el ADN de los espermatozoides bovinos y que la centrifugación por 45 min además de causar daño en el ADN produce pérdida de la integridad de la membrana plasmática.

Palabras clave: espermatozoides bovinos, fragmentación de ADN, integridad de la membrana

The aim of this study was to evaluate the effects of different times of centrifugation on plasma membrane integrity and DNA of bovine sperm cells, by means of the hyposmotic test (HOST) and the comet assay, respectively. The sperm cells were centrifuged at 700 x g for 10, 30 or 45 min. No-centrifuged thawed semen served as negative control whereas hydrogen peroxide (H₂O₂) (200 mM) treated sperm cells were used as a positive control. The results indicate that while the integrity of the plasma membrane was not affected by centrifugation, bovine sperm DNA was damaged independently of centrifugation times. Significant differences between negative control and treatments were found (p<0.05) and in the same way, between treatments and positive control, where the damage for oxidative stress was greater. These results indicate that centrifugation could be detrimental for in vitro bovine embryo production. Additionally, some grade of DNA fragmentation in not centrifuged sperm cells (negative control) was registered, suggesting that DNA of bovine sperm cells could be affected by other factors, probably freezing procedure.

Key words: bovine spermatozoa, DNA fragmentation, membrane integrity

Resumo

O objetivo de este estudo foi determinar se a integridade da membrana plasmática e o DNA dos espermatozóides podem ser afetados pela centrifugação realizada no processo de lavado e seleção. Os espermatozóides foram submetidos a diferentes tempos de centrifugação (10, 30 e 45 min); foi utilizado um controle negativo com espermatozóides não centrifugados e um controle positivo com espermatozóides submetidos a estresse oxidativo com peróxido de hidrogênio (H₂O₂) (200 µM). Para avaliar a integridade da membrana foi utilizado o teste hipoosmótica (HOST) e para avaliar a fragmentação do DNA Fo utilizado o ensaio cometa: A análise estatística se realizou mediante o teste de Fisher. A centrifugação durante 10, 30 e 45 min, apresentou um efeito estatisticamente significativo sobre o dano no DNA, em relação aos espermatozóides não centrifugados (p<0.05). Além disto, observou-se diferença estatisticamente significativa (p<0.05) entre os espermatozóides centrifugados a diferentes tempos em relação ao controle positivo realizado com H₂O₂ (200 µM). A comparação de medias não detectou diferença estatisticamente significativa entre os espermatozóides não centrifugados e os centrifugados por um período de 10 e 30 min (p>0.05) na reação positiva à prova HOST, o qual ocorreu ao comparar os não centrifugados e os centrifugados por 45 min (p<0,05). O controle positivo realizado com H₂O₂ apresentou diferença significativa (p<0.05) quando comparado contra os outros tratamentos. Em conclusão, os resultados do presente trabalho sugerem que a centrifugação dos espermatozóides durante 10, 30 ou 45 min a 700 x g para realização do gradiente diferencial de percoll, têm um efeito deletério sobre o DNA dos espermatozóides bovinos e que a centrifugação por 45 min além de causar dano no DNA produz perda da integridade da membrana plasmática.

Palavras chave: espermatozóides bovinos, fragmentação do DNA, integridade da membrana

En la fertilización in vitro (FIV) bovina generalmente se utiliza semen de alta calidad que ha sido previamente congelado, lo que implica someter a los espermatozoides a un procedimiento de lavado y selección en el que los de mejor movilidad son separados del plasma seminal, de los muertos e inmóviles, de los diluyentes y crioprotectores y de otras estructuras, por medio de técnicas como el "swim-up" y el gradiente de Percoll (12, 18, 28). Estas técnicas requieren como mínimo una centrifugación, paso fundamental en el lavado y selección de los espermatozoides, en el que se puede generar daño a la membrana plasmática de los gametos masculinos (1, 30, 31) y aumentar la producción basal de especies reactivas de oxígeno (ROs, del inglés Reactive oxygen species) (1, 23, 39). Las ROs son especies químicas - moléculas o átomos, que contienen electrones desapareados en su orbital más externo lo que les confiere una reactividad química que los induce a interactuar rápidamente con otras moléculas (15, 16). Los mayores metabolitos del oxígeno producidos por la reducción de uno de sus electrones son: el radical superóxido (O₂^.), el radical hidroxilo (OH•^.) y la particular forma reducida del oxígeno, el peróxido de hidrogeno (H₂O₂). Las ROs son capaces de reaccionar indiscriminadamente con cualquier molécula con la que tengan contacto, le extraen electrones y generan nuevos radicales libres citotóxicos (5).

Las ROs tienen un efecto dual sobre las células espermáticas, ya que fisiológicamente son requeridas para los procesos de capacitación y reacción acrosómica (25), pero también, sus altas concentraciones inducen a una pérdida de la función espermática, entendida como la anulación de los cambios y funciones que son necesarias y suficientes para permitir la fertilización del oocito (9, 10). En la membrana plasmática de los espermatozoides, el radical hidroxilo inicia la oxidación de los ácidos grasos poliinsaturados de las cadenas laterales de las membranas en un proceso conocido como la peroxidación lipídica. Debido a que cada ácido graso que padece la peroxidación genera un radical con el potencial para producir peroxidación en otro ácido graso, este fenómeno considerado altamente deletéreo se traduce estructuralmente en una disminución de la fluidez de la membrana y funcionalmente en una reducción de la capacidad de la célula espermática para llevar acabo la fertilización (6, 13, 19).

La prueba hipoosmótica -HOST, es una técnica desarrollada para evaluar la funcionalidad de la membrana plasmática de los espermatozoides; su principio consiste en que al someter los espermatozoides a condiciones hipo-osmóticas, los espermatozoides bioquímicamente activos permitirán la entrada de agua y mostrarán diferentes grados de turgencia en un esfuerzo por mantener la dinámica del equilibrio entre los líquidos de su compartimiento interno y el entorno extracelular. Esta respuesta se asocia con el grado de integridad normal de la membrana y la actividad funcional de la misma, requisito indispensable para que se de la reacción acrosómica durante el proceso de fertilización (8).

La integridad del ADN espermático también es afectada por la alta concentración de las ROs, las cuales de una manera dependiente de la dosis, pueden generar un aumento significativo en la fragmentación del ADN y una pérdida severa de la movilidad (13, 29, 33). El OH• juega un papel determinante en el daño infringido al ADN, ya que éste puede alterar la estructura de las purinas y pirimidinas en las cadenas de los ácidos nucleicos (ARN y ADN) y generar además quiebres en las cadenas de polinucleótidos, alterando de esta forma la información genética. Se conoce alrededor de veinte lesiones generadas por la reacción del OH• con el ADN (21).

La electroforesis en gel de una sola célula o "ensayo cometa" es una técnica rápida, simple, visual y sensible, para medir y analizar quiebres de ADN en células de mamífero (26, 27, 35); ha sido adaptada para medir quiebres en el ADN de las células espermáticas y aunque el procedimiento varía de laboratorio a laboratorio, este se ha basado principalmente en los siguientes pasos: la preparación de una solución espermática, la puesta en un gel, la lisis celular, la desnaturalización del ADN, la electroforesis, la neutralización, la tinción del ADN, y el análisis de las imágenes (34). Por su alta sensibilidad el ensayo cometa se ha venido utilizando ampliamente para evaluar la integridad del ADN de las células espermáticas sometidas a diferentes condiciones de estrés oxidativo. Por lo tanto, el objetivo de este estudio fue determinar si la integridad de la membrana plasmática y el ADN de los espermatozoides bovinos pueden ser afectados por el proceso de lavado y selección espermática.

Materiales y métodos

Preparación del semen

Para este trabajo se utilizaron pajillas de semen congelado de 0.5 ml provenientes de un sólo toro de la raza holstein. Las pajillas de semen fueron descongeladas a 35 °C/1 min. Después de descongelar, el semen fue sometido de inmediato a uno de los tres tratamientos: 1) espermatozoides lavados y seleccionados mediante un método que utiliza la centrifugación, 2) espermatozoides seleccionados y lavados mediante un método sin centrifugación, y 3) un control positivo, realizado con espermatozoides sometidos a estrés oxidativo con H₂O₂ (200 µM).

En la técnica de Percoll, 200 µl de la muestra de semen previamente descongelado fueron puestos sobre el gradiente de Percoll que contenía 1 ml de Percoll con un gradiente de densidad de 45 y 90%. Se llevó a cabo la centrifugación a 700 x g/10 min/temperatura ambiente. Después de remover el sobrenadante, los espermatozoides fueron resuspendidos en medio FIV-TALP y la concentración celular se ajustó a una concentración de 1 x 10⁶ células/ml.

Método de swim up

Para el procedimiento de jumping, igualmente se tomaron 200 µl de la muestra de semen descongelado y se depositó en el fondo de la copa la cual había sido llenada con 1 ml de medio Sperm-Talp previamente incubado por un periodo mínimo de 2 horas; la muestra fue incubada a 37 °C, 5% de CO₂ y 99% de humedad relativa/1 h. La parte superior del sobrenadante fue recuperada y resuspendida en medio FIV-TALP y llevada a una concentración de 1x 10⁶ células/ml. Una parte de la fragmentación espermática recuperada fue mezclada con H₂O₂ a una concentración final de 200 µM como control positivo.

Ensayo cometa

Para evaluar el efecto de la centrifugación sobre el ADN de las células espermáticas mediante el ensayo cometa, se utilizó el protocolo propuesto por Shen y Ong (34): de cada tratamiento se utilizaron con 5x10⁵ espermatozoides/ml suspendidas en agarosa de bajo punto de fusión al 0.5% (en PBS libre de Ca⁺⁺ y Mg⁺⁺) en portaobjetos pretratados con 100 µl de agarosa de punto de fusión normal al 0.5% (en PBS libre de Ca⁺⁺ y Mg⁺⁺). Después de incubación 10 min/temperatura ambiente, los portaobjetos fueron colocados en solución de lisis I (2.5 M NaCl, 0.1 M EDTA, 10% DMSO y 1% de Triton X 100) a un pH = 10.0, a 4 °C/4 h; posteriormente, las placas fueron pasadas a solución de lisis II (2.5M NaCl, 100 mM Na2 EDTA, 10 mM Tris, 200 µg/ml de proteinaza K y 300 mM de DTT) a un pH = 7.4, a 37.5 °C/18 h. Terminada la lisis II, las placas fueron incubadas en tampón de electroforesis (NaOH0.3 M, EDTA 200 mM) a un pH = 13.0 a 4 ºC/10 min, en cuarto oscuro. Luego se realizó el corrido electroforético a 25 V y 100 mA/10 min. El siguiente paso fue lavar las láminas portaobjetos con tampón neutralizante (0.4 M Tris-HCL; pH 7.5) y deshidratarlas con metanol puro; una vez secas se tiñeron con 40 µl de Bromuro de etidio (20 µg/ml). Finalmente, los portaobjetos fueron visualizados en un microscopio Axiolab-Zeiss provisto de un sistema de fluorescencia y equipado con una cámara CCD SONY (DSC-S85 de 4.1 mega pixeles), con un aumento de 200X. Las imágenes de 50 cometas seleccionados aleatoriamente fueron analizadas con un software analizador de imágenes (Comet Score) proporcionado gratuitamente en Internet por la empresa TriTek-Corp. La variable para cuantificar el daño en el ADN fue el "momento de Olive (OTM).

Prueba hipoosmótica

Para evaluar el efecto de la centrifugación sobre la membrana de las células espermáticas mediante la prueba HOST, se utilizó el protocolo propuesto por Correa y Zavos (8) para espermatozoides bovinos. Debido a que los azúcares y los electrolitos mantienen la integridad funcional de los espermatozoides, se preparó una solución compuestas por un azúcar (fructosa) y un electrolito (citrato de sodio) en agua pura (Milli Q-UF). La osmolaridad de la solución fue 100 mOsmol/l verificada con osmómetro. Se hizo una adición y mezcla de 100 µl de la muestra que contenía los espermatozoides con 500 µl de la solución hipoosmótica. La mezcla fue incubada a 38.5 ºC/30 min. Posteriormente, se evaluó la reacción hipoosmótica espermática colocando una gota de la muestra bien mezclada sobre un portaobjetos, que fue cubierto con un cubreobjetos y observado bajo microscopio a 400X. Se contaron un total aproximado de 200 células espermáticas, considerando como positivos a la prueba HOST los espermatozoides que presentaran doblez o hinchazón en sus piezas medias o enrollamiento de sus piezas principales. El porcentaje de espermatozoides reaccionados se calculó con el número de células que reaccionaron al HOST sobre el número total de espermatozoides contados en la misma placa.

Análisis estadístico

El análisis estadístico de los datos se efectuó por análisis de varianza y las correspondientes pruebas de medias (Duncan). Las pruebas se realizaron utilizando el paquete estadístico Statgraphics Plus, versión 4.1.

Resultados

En las figuras 1 y 2 se muestra el efecto de la centrifugación sobre el ADN de las células espermáticas. Entre los espermatozoides seleccionados con centrifugación y los seleccionados sin centrifugación no hubo diferencia estadística significativa, pero entre estos dos tratamientos y el H₂O₂ si hubo diferencia estadística significativa (p<0.05). En la figura 3 se muestra el efecto de la centrifugación sobre la membrana plasmática de los espermatozoides sometidos a diferentes tratamientos. Igualmente, se observa que no hubo diferencia estadística significativa (p>0.05) entre los espermatozoides centrifugados y los no centrifugados, pero sí la hubo cuando se compararon estos con el control positivo realizado con H₂O₂.

Discusión

El factor masculino como causante de las pérdidas gestacionales tempranas, particularmente en los casos de muerte embrionaria, ha sido poco estudiado. Los recientes hallazgos en la biología de la reproducción han mejorado tanto la comprensión fisiológica del espermatozoide como los mecanismos para llevar acabo la fertilización y estos nuevos hallazgos han llevado a la elaboración de pruebas de fertilidad masculina basadas sobre la integridad del genoma y de la membrana celular espermática (19, 32). El mantenimiento de la integridad del ADN espermático es crucial para la salud de las nuevas generaciones (3, 14).

El ADN de los espermatozoides es seis veces más compacto y posee un volumen 40 veces menor al ADN de una célula somática (40). Esta compactación es el resultado de las uniones disulfuro entre el ADN y las protaminas, las cuales constituyen aproximadamente el 85% de las proteínas unidas al ADN, mientras que las proteínas histonas representan alrededor del 15% (38). Este empaquetamiento tiene diferentes funciones: 1) reducir el volumen de la célula espermática para facilitar su viaje por el tracto genital femenino, 2) minimizar el daño por agentes exógenos antes de la fertilización, y 3) conservar el genoma transcripcionalmente inactivo. Adicionalmente, los espermatozoides están inmersos en un líquido que contiene altos niveles de antioxidantes. Pero a pesar de estos mecanismos de protección el daño tanto en el ADN como en la membrana plasmática de las células espermáticas puede ocurrir en tres puntos críticos: en los procesos de formación, en los procesos de maduración espermática (34), o en los procedimientos de preparación espermática realizados en diversas biotecnologías de reproducción asistida. Una alta proporción de espermatozoides con daño en el ADN o en la membrana plasmática quizás pueda ser una causa de infertilidad (36).

En el presente estudio se compararon dos técnicas para la preparación y selección de los espermatozoides: el convencional gradiente de Percoll, en el que se hace una centrifugación de los espermatozoides; y el swim up, en el que se omite la centrifugación de los espermatozoides. La centrifugación en la preparación de los espermatozoides ha mostrado que puede causar daño a la célula espermática mediante mecanismos que están mediados por un potenciamiento en la producción de ROs, los cuales pueden generar daño tanto en el ADN como en la membrana plasmática (1). En los resultados arrojados por este estudio se muestra que hay diferencia estadística significativa en cuanto a daño en el ADN de células espermáticas evaluado por ensayo cometa entre los espermatozoides centrifugados a 10, 30 y 45 min y los no se centrifugados.

De otro lado, se halló diferencia estadística significativa en cuanto al daño en membrana plasmática evaluado por prueba HOST entre los espermatozoides centrifugados por 45 min con respecto a los no centrifugados, pero no hubo diferencia significativa entre los no centrifugados y los centrifugados por 10 y 30 min. El control positivo realizado con H₂O₂ a una concentración final de 200 µM causó daño significativo tanto al ADN como a la membrana plasmática de los espermatozoides bovinos.

Los resultados de este estudio sugieren que las condiciones de centrifugación bajo la cual se hizo la selección de los espermatozoides tienen un efecto deletéreo sobre el ADN de las células espermáticas, lo que coincide con los reportes en donde se evidencia que las ROs pueden afectar la integridad del ADN de las células espermáticas. La generación de ROs inducida por nicotinamida adenina dinucleótido fosfato (NADPH) y xanatina/xantina oxidasa o por adición directa de H₂O₂ a los espermatozoides puede causar un aumento significativo en la fragmentación del ADN espermático (2, 3, 20) como se observa en las figuras 1 y 2.

La membrana plasmática de los espermatozoides bovinos tiene una alta concentración de ácidos grasos poliinsaturados, los cuales pueden padecer peroxidación lipídica iniciada por las ROs, particularmente el H₂O₂. El daño por peroxidación lipídica conlleva a una pérdida de la integridad de la membrana plasmática de los espermatozoides (37) lo cual se ve reflejado en la figura 3 cuando a las células espermáticas se someten a estrés oxidativo con H₂O₂ y a un extenso periodo de centrifugación de 45 min. Además, estudios recientes también muestran que los ROs pueden afectar la integridad del ADN de las células espermáticas (3, 4). La generación de ROs inducida por nicotinamida adenina dinucleótido fosfato (NADPH) y xanatina/xantina oxidasa o por adición directa a los espermatozoides, puede causar un aumento significativo en la fragmentación del ADN espermático como se observa en la figura 3, en donde la adición de H₂O₂ (200 mM) produjo una alta fragmentación de las células espermáticas. Aunque hubo diferencia estadística significativa en cuanto a daño en ADN entre los espermatozoides centrifugados y no centrifugados con respecto a los espermatozoides sometidos a estrés oxidativo con H₂O₂ (véase Figura 1). Sin embargo, se observó en los espermatozoides no centrifugados una alta fragmentación (véase Figura 3). Quizás, está alta fragmentación en el ADN de espermatozoides bovinos que no han sido sometidos a estrés oxidativo con H₂O₂, sea debida a los procesos de criopreservación. La criopreservación está asociada al estrés oxidativo en espermatozoides de humano (4), de ratón (22) y de bovino (24). Además, el congelamiento y descongelamiento de los espermatozoides bovinos aumenta la generación de ROs (7), que producen alteraciones en el citoesqueleto (17), inhiben de la fusión esperma-oocito (2), afectan el axonema del espermatozoide, lo cual está asociado con pérdida de movilidad (11) y producen daño en el ADN (20); todo ello concuerda con nuestro estudio como se puede evidenciar en la figura 2.

En conclusión, los resultados del presente trabajo sugieren que la centrifugación de los espermatozoides a 700 x g por un tiempo de 10, 30 ó 45 min, para la realización del gradiente diferencial de Percoll, tiene un efecto deletéreo sobre el ADN de los espermatozoides bovinos y que la centrifugación por 45 min además de causar daño en el ADN produce pérdida de la integridad de la membrana plasmática. Estos resultados también sugieren que la congelación de espermatozoides bovinos genera estrés oxidativo el cual produce daño en el ADN.

Agradecimientos

Los autores agradecen a la División de Investigaciones Medellín (DIME) por financiar este trabajo, además a los directores de los laboratorios de Biotecnología Animal y Biología Celular y Molecular de la Universidad Nacional de Colombia sede Medellín y a la directora del laboratorio Singamia de la Universidad de Antioquia por prestar sus instalaciones. Los autores también agradecen a la planta de procesamiento de semen de la Universidad Nacional, y en su nombre al profesor Luis Emilio Trujillo, por proporcionar el material seminal.

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^¶ Para citar este artículo: Urrego R, Ríos A, Olivera Ángel M, Camargo O. Efecto de la centrifugación sobre la membrana plasmática y el ADN de espermatozoides bovinos. Rev Colomb Cienc Pecu 2008; 21:19-26.

Autor para el envío de correspondencia y la solicitud de separatas: Grupo INCA-CES. Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia. Universidad CES, Medellín, Colombia. E-mail: rurrego@ces.edu.co