Determination of Helicobacter spp. in swine from Antioquia State, Colombia

Identificação de Helicobacter spp em suínos no departamento de Antioquia, Colômbia

Berardo de J Rodríguez^1*, MV, PhD; Diego Aranzazu T¹, MV, Esp; Laura C Ortiz¹, MV.

¹Grupo de Investigación Centauro, Escuela de Medicina Veterinaria, Facultad de Ciencias Agrarias; Universidad de Antioquia. AA. 1226, Medellín. Colombia.

Resumen

Los porcinos desarrollan de manera natural y frecuente úlceras gastroesofágicas (UGE) y se han observado úlceras colonizadas por Helicobacter spp. En los humanos se ha comunicado la asociación de estos microorganismos con gastritis y úlcera gástrica y, de manera análoga, en los suinos se ha relacionado a Helicobacter spp en la producción de lesiones gástricas. Por lo anterior, se realizó esta investigación con los objetivos de determinar la presencia de Helicobacter spp en cerdos del departamento de Antioquia (Colombia) con lesión ulcerosa y preulcerosa de la pars esophagea, y caracterizar histológicamente los diferentes estadios de dicha lesión. Para ello se evaluaron microscópicamente 275 estómagos que presentaron UGE, 15 con erosión y 15 que presentaron la mucosa gástrica intacta. El análisis de los resultados se efectuó mediante estadística descriptiva y se utilizó la prueba de Z para diferenciar proporciones con un nivel de confiabilidad del 95%. Del total de úlceras evaluadas el 74.90% fueron crónicas, el 13.45% subagudas y el 11.63% agudas, de ellas en el 63.63% se determinó la presencia de Helicobacter spp. Este artículo comunica por primera vez en Colombia el hallazgo de colonización natural por Helicobacter spp en porcinos y discute algunos aspectos de la patogenia de la UGE.

Palabras clave: Gastrospirillum suis, Helicobacter heilmannii, Helicobacter pylori, prueba de inmunohistoquímica, úlcera gástrica en porcinos

Summary

Swine as well as human naturally harbor Helicobacter spp. and frequently develop gastroesophagic ulcer (GEU). Nowadays in Colombia there are no reports of natural colonization or infection by Helicobacter spp. in swine. The aim of this study investigation was to verify the presence of Helicobacter spp. in ulcerated and preulcerated lesion in the gastric mucosa of pigs and to typify to the different stages of the lesion. This research was carried out in 275 ulcerated, 15 erosioned and 15 normal stomachs obtained from Medellin abattoir at the State of Antioquia, Colombia. The analysis of the results was made by using descriptive statistic. A Z test was used to establish differences between proportions with a level of confidence of 95%. This paper report for the first time in Colombia the natural colonization of porcine stomach by Helicobacter spp. and discuss some aspects of the pathogenesis of GEU.

Key words: Gastrospirillum suis, Helicobacter Heilmannii, Helicobacter pylori, immunohistochemistry, swine gastric ulcer

Resumo

Os porcos irá naturalmente desenvolver frequentemente úlceras gastroesofágico (UGE) e som observadas úlceras colonizadas por Helicobacter spp. Nos seres humanos tem sido relatada a associação desses microrganismos com a gastrite ea úlcera gástrica e, de igual modo, no Suína tem sido associada ao Helicobacter spp na produção de lesões gástricas. Pelo exposto esta pesquisa foi realizada com o objetivo de determinar a presença do Helicobacter spp suínos no departamento de Antioquia (Colômbia) com lesão ulcerosa e preulcerosa da pars esophagea, histologia, e caracterizar as diferentes etapas desse prejuízo. É avaliada microscopicamente 275 estômagos apresentando UGE, 15 com a erosão da mucosa gástrica e 15 apresentando mucosa gástrica intacto. A análise dos resultados foi realizada pela estatística descritiva eo teste foi usado para diferenciar Saragoça proporções com um nível de confiabilidade de 95%. Do total foram avaliadas as úlceras crónicas 74.90%, 13.45% e 11.63% subagudas aguda deles em 63.63% ao identificou a presença do Helicobacter spp. Este artigo comunica pela primeira vez na Colômbia a descoberta de colonização natural por Helicobacter spp em suínos e discute alguns aspectos da patogênese da UGE.

Palavras chave: ensaio de imunohistoquímica, Gastrospirillum suis, Helicobacter heilmannii, Helicobacter pylori, úlcera gástrica nos suínos

Introducción

La úlcera gastroesofágica (UGE) es una lesión caracterizada por un área de digestión ácido péptica que afecta la pars oesophagea del cerdo (3), la cual se ha observado asociada a altos niveles tecnológicos de producción (5, 8, 30). Esta condición presenta una amplia distribución mundial con niveles de prevalencia que fluctúan entre el 5 y el 100% y mortalidades iguales o superiores al 25%, causadas por hemorragias de lesiones profundamente erosionadas (25, 30, 34). Aunque varios factores se han involucrado en la etiología de esta lesión, tales como: infección, intoxicación, trastornos nutricionales, estrés, hiperacidez gástrica, cambios hormonales y estacionales, su patogénesis permanece sin aclararse por completo (2, 9, 30).

Desde el aislamiento inicial de la bacteria Helicobacter pylori en 1983 (37), se ha propuesto a este microorganismo como el principal agente causal de gastritis crónica y úlcera péptica en el humano (18, 19, 21); de igual forma, se le ha encontrado asociado a la presentación de adenocarcinoma y linfoma gástricos (6, 27, 29). Hasta el presente se han identificado 13 especies incluidas en el género Helicobacter, la mayoría de las cuales son colonizadoras eficientes del estómago de los mamíferos (16, 17, 31). Por lo anterior, se ha propuesto que estas bacterias pueden causar lesiones gástricas en los animales de forma análoga o como lo hacen en el humano (13, 15, 20).

Para el diagnóstico de H. Suis en el cerdo se han empleado los métodos de coloración Carbolfuschina y Warthin-Starry en muestras histopatológicas, ya que la tinción de Hematoxilina-eosina no lo demuestra de manera adecuada (4, 22, 35). Hasta el presente sólo se ha logrado cultivar en esta bacteria la mucosa gástrica de animales susceptibles, más no en medios especiales de cultivo in vitro (4, 11, 13). Es importante resaltar que H. heilmannii se ha observado asociado a la presentación de gastritis y linfoma gástrico en el humano (29), por lo que al igual que otras bacterias del género Helicobacter se ha propuesto como una posible zoonosis (27, 31, 40).

Debido a que un estudio reciente realizado en Colombia por este mismo grupo de investigación, determinó una prevalencia alta de úlcera gástrica porcina y de lesiones preulcerosas en animales de matadero (36), se realizó esta investigación con el propósito de determinar la presencia en forma natural de Helicobacter spp en el estómago de cerdos sacrificados en el matadero de la ciudad de Medellín que presentaron diferentes estadios de evolución de la UGE, para ello se utilizaron métodos histopatológicos sensibles para su diagnóstico.

Materiales y métodos

Aval de Comité de ética

Este estudio estuvo enmarcado en procedimientos rutinarios de inspección veterinaria post mortem, no se realizó ninguna intervención experimental sobre los animales, y se evaluaron exclusivamente piezas anatómicas obtenidas posteriormente al faenado, razón por la cual no se solicitó aval del Comité de ética.

Tipo de estudio y selección de muestras

El desarrollo del trabajo consistió en un estudio descriptivo de corte, en el cual se incluyeron 312 estómagos de cerdos que habían sido evaluados macroscópicamente en un estudio anterior (36), en donde las muestras se tomaron de la siguiente manera: los estómagos se abrieron longitudinalmente por la curvatura mayor, se lavaron con agua de grifo y se efectuó su inspección macroscópica con el fin de seleccionar aquellos aptos para realizar su posterior evaluación histológica. De 282 especímenes en donde se observó ulceración gastroesofágica, se tomaron cuatro centímetros cuadrados pertenecientes a cada una de las regiones gástricas (esofágica, cardial, fúndica y pilórica); además, se tomaron 15 muestras con erosión y 15 con la mucosa intacta y en todos se incluyó un número igual de fragmentos con las características previamente descritas.

Procesamiento histológico

Prueba de inmunohistiquímica. Con la finalidad de confirmar si los microorganismos encontrados en una muestra que resultó positiva a la coloración de Warthin-Starry presentaban las características morfológicas e inmunológicas del género Helicobacter, se realizó una prueba inmunohistoquímica (1, 38). Para ello se utilizaron secciones de tejido fijadas en formol tamponado e incluidas en parafina. La coloración se realizó sin tratamiento con pepsina. Como anticuerpo primario, se utilizó un anticuerpo policlonal de conejo dirigido contra H. pylori (Dako Cytomation; codigo B0471) a una dilución 1:500. En una segunda etapa se agregó un conjugado biotinilado porcino anti-inmunoglobinas de conejo diluido 1:1000 (Dako Cytomation; código E0431), seguido por la adición del complejo Estrectavidina-Avidina-Biotina-Peroxidasa diluido 1:1000 (Dako Cytomation; código K0377). Las secciones se colorearon con Diamino-Bencidina (Sigma-Aldrich; código D5637) y luego fueron contrateñidas con hematoxilina. Como control positivo se incluyó un espécimen positivo procesado como se describió en las líneas anteriores, como control negativo se incluyó espécimen tisular negativo para H. pylori.

Evaluación microscópica

La lectura histopatológica de las placas se efectuó mediante microscopía de luz en Laboratorio de Patología Animal de la Universidad de Antioquia. La detección de los microorganismos con forma de espiral se realizó mediante el examen con objetivo de inmersión bajo un aumento de 1000X. La cuantificación de los microorganismos en las secciones tisulares se efectuó de la siguiente manera:

a. Abundante: > de 50 microorganismos/5 campos

b. Moderado: 10 a 49 microorganismos/5 campos

c. Escaso: < de 10 microorganismos/5campos

Microfotografías

Las microfotografías de los campos más representativos se tomaron en una película Ektachrome Tungsten (100 T), para ello se utilizó una cámara Zeiss automática acoplada a un microcopio Zeiss Axiolab MC80DX®.

Análisis estadístico

Resultados

Evaluación histopatológica

De las 282 úlceras gastroesofágicas inspeccionadas macroscópicamente se incluyeron en el estudio histológico 275, debido a que 7 muestras no resultaron aptas luego de su preparación para ser observadas en el microscopio. De estas, 206 úlceras (74.90%) correspondieron a úlceras crónicas que mostraron dos patrones histológicos: 202 de ellas (73.45%) se caracterizaron por la presencia de erosión y necrosis epitelial extensas, infiltración superficial por neutrófilos y profunda por macrófagos, linfocitos y eosinófilos, así como por proliferación de tejido de granulación en la lámina propia; a éstas se les denominó úlceras crónicas activas (véanse Tabla 1 y Figura 1). Cuatro de un segundo patrón (1.45%) presentaron necrosis, erosión epitelial y formación de un tejido conectivo inactivo en la lámina propia; e infiltración de macrófagos y linfocitos difusos; a éstas se les denominó úlceras crónicas quiescentes (véase Tabla 1).

Las 37 úlceras subagudas (13.50%) representaron el segundo grupo en frecuencia y se caracterizaron por la presencia de necrosis epitelial, congestión e infiltración inflamatoria mixta en lámina propia con eosinófilos abundantes. Por su parte, las 32 úlceras agudas (11.60%) ocuparon el tercer lugar de presentación y en ellas se encontró necrosis epitelial y erosión, congestión y hemorragia extensas, infiltración inflamatoria de tipo polimorfonuclear abundante y presencia ocasional de fibrina (véase Tabla 1). En el estudio histopatológico se incluyeron 15 muestras sin ulceración que poseían su epitelio intacto y 15 que presentaban erosión epitelial; en ambos tipos de muestras se observaron frecuentemente lesiones como: hiperqueratosis, paraqueratosis, hiperplasia epitelial, espongiosis, degeneración balonosa y la formación de vesículas y pústulas epiteliales; además, la presencia de infiltración inflamatoria variable en la lámina propia, lo que corresponde a un cuadro histológico de gastroesofagitis (véase Figura 2).

Microorganismos encontrados

Al examinar las muestras con ulceración, coloreadas con Warthin-Starry, en 175 (63.63%) se detectó la presencia de microorganismos intensamente teñidos, con morfología fuertemente espiralada y apariencia de tirabuzón (véase Figura 3), éstos correspondieron morfológicamente a los microorganismos previamente descritos como H. heilmannii (4, 29) y Candidatus H. suis (13, 31, 40) (véanse Tablas 2 y 3). En algunas muestras se encontró un segundo microorganismo más pequeño que el anterior con forma de "S" itálica que se coloreó intensamente con Warthin-Starry y que corresponde morfológicamente con H. pylori (6, 22, 28) (véase Figura 4).

Los microorganismos como H. heilmannii o Candidatus H. suis se encontraron distribuidos en todas las regiones gástricas (véase Tabla 3), pero su presentación fue significativamente más frecuente en las regiones fúndica y pilórica al compararse con aquellas esofágica y cardial (p<0.05). No se observó diferencia estadísticamente significativa en cuanto a la cantidad de estos microorganismos entre las cuatro regiones gástricas (p>0.05) (véase Tabla 3). En el estudio no se encontró diferencia estadísticamente significativa entre los diferentes tipos de úlceras para la presentación de dicha bacteria (p>0.05) (véanse Tablas 2 y 4).

Resultados de imunohistoquímica

Discusión

Las lesiones histopatológicas encontradas tanto en los cerdos preulcerados y en los ulcerados en el estudio, sugieren la existencia de un proceso de patogenia común con diferentes etapas, que se inicia con una respuesta epitelial ante una causa desencadenante que no está claramente establecida y que se caracteriza microscópicamente por hiperplasia epitelial, con hiperqueratosis paraqueratótica; posteriormente, se produce espongiosis, que da inicio a degeneración balonosa del epitelio, con la subsecuente formación de vesículas que son pobladas por infiltración inflamatoria polimorfonuclear predominante, originando así pústulas (8). De esta manera, se establece una gastroesofagitis con erosiones epiteliales, que se transforman en úlceras luego que la acidez gástrica actúa sobre la lámina propia epitelial y el tejido conectivo subyacente (véase Figura 2).

En los estómagos evaluados se encontró una mayor proporción de úlceras crónicas con respecto a las agudas y a las subagudas, hallazgo similar a lo comunicado anteriormente (23). Estas observaciones indican que el proceso de ulcerogénesis se inicia temprano en el ciclo productivo y que posiblemente el destete y los primeros días del levante constituyen fases de alto riesgo para el inicio de la enfermedad.

El patrón morfológico y los cambios inflamatorios de la úlcera gástrica porcina hallados en esta investigación son similares a los que se han observado en el humano, excepto por su localización, que predomina en la pars oesophagea en el cerdo y en el bulbo duodenal y la mucosa prepilórica en el humano (3, 14, 28). La diferencia en la localización de la úlcera en las dos especies puede explicarse por la presencia de un epitelio no secretor en la pars oesophagea del cerdo, incapaz de producir moco para proteger la mucosa mediante mecanismos de tampón del efecto de la acidez gástrica (2). Los cerdos con ulceración presentan un incremento del moco gástrico, pero éste posee grupos ácidos libres aumentados, que disminuyen la capacidad para proteger la mucosa, lo que conduce a una alteración de la resistencia a la hidrólisis ácida (5). La similitud morfológica entre la úlcera porcina y la humana no implica una patogénesis similar, pero si sugiere la presencia de mecanismos comunes para su desarrollo (11, 22).

En esta investigación se determinó la colonización natural del estómago por microorganismos espiralados. La evaluación histológica con la coloración de Warthin-Starry reveló la presencia de dos tipos morfológicos de bacterias: la primera, que se caracterizó por su mayor tamaño y su morfología intensamente espiralada, concuerda con las descripciones previas de H. heilmannii (4, 27, 28); y la segunda, de menor tamaño y con forma de "S" itálica corresponde morfológicamente con la bacteria que se ha denominado como H. pylori (17, 21).

Un estudio reciente determinó que H. pylori puede adoptar la misma morfología que H. heilmannii bajo condiciones variables de cultivo y sugiere que su diagnóstico utilizando únicamente criterios morfológicos, no es específico para diferenciar las dos especies bacterianas (14). Otros estudios realizados en estómagos porcinos han caracterizado diferentes especies bacterianas espiralazas (7), tales como: H. heilmannii tipo I y tipo II, H. pylori y una nueva especie denominada Helicobacter suis (10, 22, 38). La técnica de inmunohistoquímica utilizada en este estudio reveló que los dos tipos morfológicos de bacterias encontradas corresponden al género Helicobacter, ya que presentaron una reacción positiva al ser enfrentadas con anticuerpos policlonales contra H. pylori; esto, unido a las investigaciones anteriores efectuadas por otros autores, en las que se ha inducido experimentalmente la producción de úlceras por H. pylori en cerdos libres de patógenos específicos (1, 11, 12) y se ha determinado la asociación entre la detección de la bacteria H. heilmannii y la presentación de úlcera gastroesofágica en cerdos de matadero (33, 40), indica que es necesario realizar futuras investigaciones utilizando técnicas específicas para tipificar las especies de Helicobacter presentes en los cerdos en Colombia e identificar con precisión los dos tipos morfológicos encontrados en este estudio.

En este estudio los microorganismos similares al H. heilmannii o a Candidatus H. suis presentaron un grado mayor de colonización en las fosetas gástricas de las regiones pilórica y fúndica, en íntima relación con el aparato de secreción ácida del estómago como lo han informado otros investigadores (3, 7, 28). La colonización con H. heilmannii produce respuestas inflamatorias gástricas similares a las producidas experimentalmente por H. pylori en lechones y esta última bacteria induce hiperacidez mediante la formación de amoníaco utilizando la enzima ureasa, causa necrosis de las células caliciformes e impide una adecuada sulfatación de la mucina (12, 28). Por lo anterior, no se debe descartar la posibilidad que H. heilmannii contribuya al proceso de ulceración potenciando fenómenos de hiperacidez en los porcinos estudiados, sometidos a factores predisponentes o desencadenantes para la ulceración como: sexo, raza, dietas ricas en carbohidratos fermentables y presencia de microorganismos comensales de tipo Lactobacillus (22).

Los hallazgos en esta investigación y en otras que se han realizado con el propósito de esclarecer los mecanismos involucrados en el desarrollo de la úlcera gastroesofágica, indican que esta enfermedad es de naturaleza multicausal y que es necesario determinar todas las interacciones existentes entre los factores epidemiológicas predisponentes y aquellos patológicos desencadenantes y, en forma específica, es importante establecer las relaciones que puedan existir entre la naturaleza de la dieta y sus interacciones con los diferentes microorganismos gástricos que históricamente se han encontrado asociados a procesos de ulceración en los porcinos. Este artículo constituye el primer reporte hasta donde conocemos de la colonización de Helicobacter spp en cerdos en Colombia y el primer estudio sistemático en caracterizar histológicamente la úlcera gastroesofágica porcina y otras lesiones gástricas en cerdos en matadero en Colombia.

Agradecimientos

Los autores agradecen a la estampilla Universidad de Antioquia por la financiación de esta investigación. A la Empresa Central Ganadera y al personal de la planta de faenado de Medellín por su colaboración en la toma de las muestras. Al Instituto de Patología del Hospital San Vicente de Paúl por su colaboración en el procesamiento inmunohistoquímico.

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^¶ Para citar este artículo: Rodríguez BdeJ, Aranzazu D, Ortiz LC. Determinación de Helicobacter spp en cerdos en el departamento de Antioquia, Colombia. Rev Colomb Cienc Pecu 2008; 21:210-218.