DOI: http://dx.doi.org/10.15446/rev.colomb.quim.v44n2.55213

Diseño de péptidos basado en la secuencia análoga al represor negativo icaR de Staphylococcus sp.

Design of peptides based on similar sequence of negative repressor icaR of Staphylococcus sp.

Desenho de peptídeos com base na sequência similar ao repressor negativo icaR dos Staphylococcus sp.

Gladys Pinilla^1,*, Liliana C. Muñoz¹, Luz M. Salazar², Jeannette Navarrete¹, Alexander Guevara^1,2

¹ Universidad Colegio Mayor de Cundinamarca. Calle 28 # 5 B 02 Bogotá D.C. Colombia
² Universidad Nacional de Colombia. Carrera 30 calle 45 Bogotá D.C. Colombia
*Autor correspondencia: gpinillab@unicolmayor.edu.co Tel: 3114458015

Article citation: ]]> Pinilla, G.; Muñoz, L. C; Salazar, L. M.; Navarrete, J.; Guevara, A. Diseño de péptidos basado en la secuencia análoga al represor negativo icaR de Staphylococcus sp. Rev. Colomb. Quim. 2015, 44(2), 5-9. DOI: http://dx.doi.org/10.15446/rev.colomb.quim.v44n2.55213

Recibido: 23 de junio de 2015. Aceptado: 13 de julio de 2015

Resumen

La biopelícula como un mecanismo de virulencia en Staphylococcus involucrada en infecciones intrahospitalarias es regulada por un represor negativo icaR, responsable de la transcripción completa del operón icaADBC. La búsqueda de dominios funcionales por modulación computacional de icaR permitió hallar las secuencias peptídicas con actividad biológica análoga a la proteína icaR. Mediante biología computacional se diseñaron péptidos empleando el programa de predicción AntiBP (http://www.imtech.res.in/raghava/antibp/); la síntesis química se hizo por N^α-Fmoc y se caracterizaron y purificaron tres moléculas por RP-HPLC y MALDI-TOF. Se evaluó su seguridad biológica mediante ensayo de actividad citotóxica realizada sobre macrófagos murinos de la línea J774 y la actividad hemolítica se determinó mediante el uso de glóbulos rojos. Los tres péptidos caracterizados IR1, IR2 e IR3, presentaron estructura secundaria predominantemente alfa helicoidal, alto grado de pureza y alto score antimicrobiano; además, mostraron baja toxicidad, evidenciada por la actividad citotóxica y hemolítica en las concentraciones ensayadas y en comparación con los controles usados, que permitiría su potencial uso como moléculas candidatas o principios activos con actividad análoga al represor nativo icaR, frente a la biopelícula de los Staphylococcus sp.

Palabras clave: péptidos catiónicos antimicrobianos, operón, biología computacional, síntesis química, citotoxicidad (DeCS).

Abstract

Staphylococcus sp. biofilm, formed as a mechanism of virulence that is involved in hospital acquired infections, is regulated by a negative repressor icaR, which is responsible for the full transcription of the operon icaADBC. This study, through functional commands by computational modulation of icaR, allowed to find peptide sequences with similar biological activity to the icaR protein. Peptides were designed by means of computational biology using the prediction program AntiBP (http://www.imtech.res.in/raghava/antibp/). The chemical synthesis of peptides was performed by Nα-Fmoc. The purification and characterization of three molecules were carried out using RP-HPLC and MALDI-TOF. Biological safety of peptides was evaluated by tests of cytotoxic activity on murine macrophage cells line J774, and their hemolytic activity was determined by using red cells. The three characterized peptides IR1, IR2 and IR3 presented a predominantly secondary alpha helical structure with a high degree of purity and high antimicrobial scores. In addition, the peptides exhibited low toxicity, proved by their low cytotoxic and hemolytic activity in the tested concentrations and in comparison to the standards used. These results allow the potential use of these peptides as candidate molecules or active principles with similar activity to the native repressor icaR against the Staphylococcus biofilm.

Key words: antimicrobial cationic peptides, operon, computational biology, chemical synthesis, cytotoxicity (DeCS).

Resumo

O biofilme formado como um mecanismo de virulência em Staphylococcus sp., que está envolvido com infecções intra-hospitalares, é regulado por um repressor negativo icaR, o qual é responsável pela plena transcrição do operão icaADBC. Por tanto, o presente estudo, avaliando a segurança biológica de moléculas, concebeu peptídeos antibiofilme semelhantes ao repressor icaR. Por meio da biologia computacional foram concebidos peptídeos usando o programa de predição AntiBP (http://www.imtech.res.in/raghava/antibp/) para identificar as sequências com uma atividade biologicamente similar à da proteína icaR. A Síntese química dos peptídeos se fez pelo N^α-Fmoc e foram caracterizadas e purificadas três moléculas por RP-HPLC e MALDI-TOF. O ensaio de atividade citotóxica foi realizado nos macrófagos murinos da linha J774 e a atividade hemolítica foi determinada por meio do uso de glóbulos vermelhos. Foram caraterizados três peptídeos IR1, IR2 e IR3, além de mostrarem uma estrutura secundaria predominantemente alfa helicoidal, com alto grau de pureza, alto score antimicrobiano e baixa toxicidade, estes podem ser postulados como moléculas candidatas ou princípios ativos com uma atividade similar ao repressor nativo icaR frente ao biofilme dos Staphylococcus sp.

Introducción

La biopelícula como mecanismo de persistencia y resistencia bacteriana hace menos efectiva la actividad de los antibióticos debido a su penetración lenta e incompleta en las bacterias formadoras de biopelícula. Del mismo modo, se ha reportado que estas pueden resistir concentraciones de antibióticos 1000 veces mayores, que las mismas bacterias en estado plantónico (1).

Microorganismos que tienen capacidad de formar biopelícula, como los Staphylococcus sp., producen un polisacárido intercelular adhesina (PIA), el cual media la agregación celular bacteriana y favorece la colonización. La síntesis de PIA y la variación fenotípica están reguladas por diversos factores y componentes genéticos que influyen en la comunicación intercelular bacteriana, en la cual intervienen operones, genes reguladores globales, elementos de inserción, entre otros (2,3).

La síntesis de biopelícula mediada por el operón icaADBC incluye: la enzima N-acetilglucosaminiltransferasa, que se encuentra anclada a la membrana y es codificada por icaA, que a su vez sintetiza PIA a partir de UDP-N-acetilglucosamina; el producto de icaD que optimiza la eficiencia de icaA; el producto de icaC que se relaciona con la externalización de PIA; y finalmente, el gen icaB que codifica una N-deacetilasa responsable de la deacetilación parcial de PIA. La expresión del operón es afectada por condiciones ambientales (4-6) y es regulada principalmente por el represor negativo icaR (7,8). Este represor pertenece a la familia de proteínas represoras de tetraciclina (TetR) que actúan como sensores químicos citosólicos y responden a señales ambientales específicas (9). IcaR es un homo dímero predominantemente alfa helicoidal, en el cual las alfa hélices dos y tres conforman su dominio N-terminal y corresponde a un dominio de unión a ADN, con estructura hélice-giro-hélice (HTH) (10).

A partir de la correlación entre el mecanismo de acción actualmente conocido de icaR (10,11) y de los péptidos antimicrobianos PAMs, se plantea que los péptidos sintetizados en este estudio podrían causar un efecto inhibitorio de la biopelícula de Staphylococcus, anclándose específicamente al codón de inicio del operón ica ADBC, impidiendo su transcripción y/o uniéndose a moléculas internas utilizadas para su metabolismo y autoregulación (7,9). Adicionalmente, podrían tener efecto antimicrobiano al unirse a las membranas bacterianas por acción electrostática. El objetivo de este estudio fue diseñar péptidos análogos al represor icaR, evaluando la seguridad biológica de los mismos, para que posteriormente sean probados en su potencial efecto o principio activo antibiopelícula.

Materiales y métodos

Diseño de los péptidos

Las imágenes moleculares de la proteína icaR fueron producidas usando el programa UCSF Chimera (Universidad de California, San Francisco supported by NIH P41 RR-01081) (12) y la búsqueda de dominios funcionales en la proteína empleando la herramienta SMART (13).

A partir de la secuencia original reportada para icaR (13,14) se diseñó el péptido IR1, utilizando el servidor web Antibp Server (14). También se realizaron modificaciones a la secuencia original del péptido IR1 y se recalcularon los parámetros del péptido para incrementar el score antimicrobiano de los nuevos péptidos IR2 e IR3, utilizando The Antimicrobial Peptide Database (APD) (15). Con el fin de mejorar la exactitud de las predicciones de la estructura secundaria se utilizó GOR, Fragment Database Mining (FDM) GOR V (15,16), PSIPRED (17) y se utilizó el programa Helical Weell para mostrar su conformación anfipática (18).

Los péptidos IR1, IR2 e IR3 fueron sintetizados por Fmoc (9-fluorenilmetoxicarbonilo) en fase sólida, usando resina Rink-amida, descrita previamente por Merrifield y modificada por Houghten Sarin (19). Los péptidos crudos se identificaron por cromatografía líquida de alta eficiencia en fase reversa (CLAE-FR) (L7400 La Chrom Merck Hitachi); se usó una columna analítica RP18, marca Waters, (5 µm; 25 cm de largo y 0,46 cm de diámetro) y acetonitrilo, agua, metanol y ácido trifluoracético como solventes grado HPLC; se aplicaron 20 μL de la muestra (2 mg/mL), se eluye con el empleo de un sistema de gradiente A/B de 0 a 70% B (A: Agua desionizada, B: acetonitrilo) en 30 minutos, con flujo de solvente utilizado de 1.0 mL/min y una temperatura de 21ºC. La pureza de los péptidos sintetizados fue confirmada por espectrometría de masas (Autoflex Bruker Daltonics Maldi-Tof) y se analizaron en un espectropolarímetro de dicroísmo circular para determinar su estructura secundaria preferencial.

Actividad hemolítica

La determinación de la actividad hemolítica se realizó por duplicado con glóbulos rojos (GR) grupo O Rh positivo con 8 diluciones seriadas a partir de una solución de 50000 µg/mL de cada péptido. Como controles negativos se incluyó insulina (péptido no hemolítico) y GR en solución salina fisiológica; como control positivo GR en agua destilada. Los datos exportados a Excel se analizaron con el programa Graph Pad Prism 5.0 Trial Version. Se determinó la concentración hemolítica media (CH₅₀), la cual corresponde a la concentración del péptido que ocasionó la hemólisis del 50% de los eritrocitos en suspensión (20).

Ensayo de citotoxicidad

Para establecer el efecto deletéreo de los péptidos se realizó un cultivo de macrófagos murinos de la línea J774, empleando células con viabilidad superior al 90%, las cuales fueron incubadas durante 24 h a 37 ºC con atmósfera de CO₂ al 5%. Las células adheridas se incubaron 72 h con ocho concentraciones de cada péptido en RPMI 1640 a partir de 1200 μg/mL (por triplicado). La viabilidad celular fue evaluada mediante el método de Alamar Blue con algunas modificaciones (20).

Resultados y discusión

Selección de la secuencia de icaR y síntesis de péptidos

La habilidad de producir biopelícula depende en gran parte de la presencia del operón ica como un posible marcador de cepas virulentas especialmente en S. epidermidis. El regulador icaR de la familia de represores transcripcionales TetR responde a señales en ambientes específicos y pueden afectar la expresión de genes como respuesta fisiológica (10,13).

Se identificó el dominio del represor de resistencia a Tetraciclina (TetR_N) basados en su similitud a nivel de secuencia con icaR en el extremo amino terminal entre los residuos cinco y 51 cuya secuencia corresponde a: IIDNAITLFSEKGYDGTTLDDISKSVNIKKASLYYHYDNKEEIYRKS.

Por otra parte, el análisis de interacción de icaR (Figura 2), con otras proteínas en el servidor STRING, permitió verificar la interacción del represor con otros genes que conforman el operón icaABDC (22).

Se ha evidenciado una mutación en la región intergénica icaR-icaA de 5pb (TATTT) en Staphylococcus sp., capaz de inducir hiperproducción del polisacárido intercelular adhesina (PIA), clave en el proceso de agregación bacteriana a través de un estímulo en la transcripción de icaABDC, sin afectar la expresión ni la unión de icaR. Adicionalmente, se encontró que icaR se une por su motivo funcional a una región de 42 pb de ADN corriente arriba en sentido 5´, ubicándose en la región inmediatamente anterior al codón de inicio de icaA, impidiendo que éste comience la transcripción en cadena del operón completo y por lo tanto inhibe la formación de biopelícula (23,24).

En este estudio, a partir de la secuencia nativa de la cadena A de icaR, desde el residuo 21 al 35 se sintetizó la secuencia molde (TLDDISKSVNIKKAS) denominada IR1 y a partir de estas se sintetizaron otros dos péptidos modificados denominados IR2 (TLIDKLKSVGRKKAK) e IR3 (TLIDKLKSVGRKKAK) para lograr el incremento de score antimicrobiano de 0,930 para IR1 a 3,057 para IR2 y 3,426 para IR3. Este proceso se logró a través de la sustitución de residuos con carga neutra por aminoácidos cargados positivamente como lisina o arginina, que aumenta de forma significativa las interacciones electrostáticas con los ácidos teicóicos de las bacterias Gram positivas. Específicamente, se cambió la Serina en el C-terminal de IR1 por Lisina tanto en IR2 como en IR3.

De igual manera, se buscó que la estructura de estos dos últimos fuera más helicoidal y anfipática, con el fin de obtener la carga neta positiva más alta. Lo anterior de acuerdo a lo descrito para péptidos antimicrobianos catiónicos, es decir, que aumentan o disminuyen su actividad por modificaciones en su secuencia tales como reducción, sustitución, duplicación e incorporación de compuestos acetilados, ya que estas modificaciones producen aumento en la interacción con las membranas bacterianas y por lo tanto aumento en la actividad antimicrobiana (25,26).

En cuanto a los resultados de la caracterización de los péptidos, la cromatografía muestra que los péptidos tienen una pureza mayor del 90%, confirmada por el análisis espectrométrico de masas MALDI-TOF, donde los pesos moleculares para IR1, IR2 e IR3 (1618,85; 1685,09; 1637,03 u.m.a. respectivamente) concuerdan con la masa teórica determinada.

Actividad hemolítica y citotóxica de los péptidos

Para que los PAMs tengan aplicaciones farmacológicas se requiere que posean actividad antimicrobiana pero que no muestren actividad citotóxica contra las células normales del huésped. Los péptidos IR1, IR2 e IR3 mostraron una actividad hemolítica CH₅₀ de 6,4%, 6,3% y 1,8% y concentraciones letales 50 (CL₅₀) mayor a 1200 µg/mL, 1111 µg/mL y 1017 µg/mL respectivamente. Como control positivo se usó gentamicina a la concentración inhibitoria bacteriana en la práctica clínica.

La actividad hemolítica de algunos péptidos, restringe su utilidad para administraciones terapéuticas y requiere de optimización en los diseños de estos, con el objetivo de minimizar dicho impacto (20). En cuanto al ensayo de citotoxicidad, para los péptidos IR2 e IR3 se encontró una CL₅₀ dentro del rango de concentraciones evaluadas y para IR1 la CL₅₀ es superior a la concentración máxima utilizada, resultados concordantes con estudios previos (14,20).

Conclusiones

Se diseñaron péptidos antimicrobianos a partir de la secuencia nativa de icaR, secuencia encontrada en reguladores transcripcionales de bacterias y que podrían inhibir la formación de biopelícula por su unión a la región anterior al codón de inicio de icaA, impidiendo la transcripción del operón completo icaADBC o parte de este. De igual manera, tendrían un efecto antimicrobiano por su carácter catiónico y anfipático, que permitiría la unión a los ácidos teicóicos de bacterias Gram positivas, como los Staphylococcus.

El análisis bionformático de la superficie de icaR mostró un potencial electrostático de gran parte de los residuos expuestos al ambiente extracelular del dominio TetRN, que probablemente contribuye a estabilizar la unión con el respectivo sustrato. Por lo tanto, la posible actividad antibiopelícula de los péptidos diseñados en este estudio, dependerá de la secuencia, así como de los epitopes análogos a icaR, tamaño, estructura, anfipaticidad catiónica y el grado helicoidal que incrementa la estabilidad y la unión a la membrana de la bacteria.

Los péptidos evaluados muestran en general una baja toxicidad, siendo el péptido IR3 el más seguro, evidenciado por el ensayo de hemólisis, que demostró poca capacidad de los péptidos para lisar glóbulos rojos, lo que significa que no causaría una respuesta significativa de tipo inmune; asimismo, en el ensayo de citotoxicidad, los péptidos presentan una CL₅₀ por encima de 1000 µg/mL, facilitando su uso inocuo, siendo menos tóxicos que la gentamicina, aminoglucósido de referencia para el control bacteriano.

Teniendo en cuenta la secuencia, el score antimicrobiano de los péptidos obtenidos, y el bajo grado de toxicidad, éstos podrían ser postulados como moléculas candidatas en el diseño de nuevos fármacos antimicrobianos y/o antibiopelícula, por su posible actividad análoga a la regulación negativa del represor nativo icaR, responsable de la formación de biopelícula en Staphylococcus sp.

Agradecimientos

Este proyecto está siendo financiado por COLCIENCIAS Convocatoria 657-2014 Código COL0041221. Contrato RC651-2014 y por la Universidad Colegio Mayor de Cundinamarca. Agradecemos a la Dra. Gabriela Delgado y al Dr. José Julián Pérez-Cordero del Grupo de Investigación de Inmunotoxicología, Departamento de Farmacia, Facultad de Ciencias, Universidad Nacional de Colombia.

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