1Facultad de Ciencias Agropecuarias. Universidad Nacional de Colombia, Sede Palmira. A.A 237. Palmira, Valle del Cauca, Colombia. 2Centro Internacional de Agricultura Tropical CIAT, Colombia. *Autor para correspondencia: anacruzmorillo@yahoo.es
La yuca (Manihot esculenta Crantz) es un arbusto perenne cultivado en África, América Latina y el Sureste asiático, cuya raíz constituye una fuente importante de energía en la dieta humana en países tropicales. Los carotenoides son pigmentos naturales que se encuentran ampliamente distribuidos en la naturaleza. Se reconoce que aproximadamente cincuenta de ellos tienen actividad provitamina A, siendo b-caroteno el de mayor eficiencia para su conversión en vitamina A. El estudio de la variabilidad genética es un procedimiento útil para fortificar, enriquecer o incrementar el contenido de nutrientes de los alimentos o cultivos, entre ellos los carotenos en raíz de yuca mediante procesos de selección y recombinación en programas de mejoramiento que permitan identificar genotipos superiores. En el presente estudio, a partir de la evaluación de la diversidad genética, se generó un dendrograma de accesiones de yuca en el cual se formaron seis grupos con 68% de similitud. La heterocigosidad promedio observada fue de Ht = 0.559. Los análisis de regresión y correlación entre el contenido de carotenos totales y los datos moleculares mostraron que los marcadores que se encuentran correlacionados con altos contenidos de carotenos pertenecen al grupo de ligamiento D del mapa molecular de yuca.
Palabra clave: Calidad proteica, carotenoides, Manihot esculenta, microsatélites, valor nutritivo, variación genética, yuca.
Cassava (Manihot esculenta Crantz) is a perennial shrub cultivated in Africa, Latin America and Southeast Asia. It is an important dietary source for humans in tropical countries. Carotenoids are natural pigments that are widely distributed in the nature, where about 50 of them have provitamin A activity, b-carotene has been the most efficient. Among the procedures to fortify (enrich or increase the nutritional content of foods or crops) cassava varieties, the study of genetic variability of the content of carotenoids in the root is one of the most common to carried out processes of selection and recombination in the breeding program which will allow the identification of superior genotypes. In this study, the evaluation of genetic diversity produced a dendrogram with six groups of 68% similarity. The average observed heterozygosity was Ht = 0.559. Regression and correlation analysis between content of total carotenoids and microsatellites markers showed that they were highly correlated with high levels of carotenoids and were found in linkage of the group D of the molecular and genetic cassava map.
Key words: Carotenoids, cassava, genetic variation, Manihot esculenta, microsatellite, nutritional value, quality protein.
La vitamina A se presenta principalmente como vitamina A propiamente dicha, que se halla en productos lácteos y otras fuentes de origen animal, y en forma de provitamina A (b-caroteno) que se convierte en vitamina A en el organismo y se encuentra en alimentos de origen vegetal. Un incremento de esta última forma en la yuca aseguraría una mejor salud visual y en general mejor calidad de vida para las personas que viven en las regiones más pobres del mundo, donde es ampliamente cultivada y consumida.
La deficiencia de vitamina A es un problema importante de salud pública en países en vía de desarrollo, ya que cada año su deficiencia causa ceguera en más de 100,000 niños y mujeres embarazadas (FAO, 2006). Las principales fuentes de esta vitamina aparecen en alimentos que no hacen parte de la dieta o están más allá del alcance económico de los más pobres, por tanto, estas personas tienen alta dependencia de los carotenoides presentes en los alimentos vegetales que pueden ser convertidos a vitamina A (carotenoides provitamina A). Los carotenoides están relacionados con la intensificación de la función inmunológica en el tratamiento y prevención de enfermedades y en la reducción de la morbilidad y mortalidad (Adewusi y Bradbury, 1993).
Grupos de investigación como Harvest Plus (1998) trabajan en el mejoramiento del contenido de vitamina A en los alimentos que hacen parte de la dieta básica humana, mediante el mejoramiento convencional y la identificación de genotipos deseables para uso en procesos de selección y recombinación. Igualmente, con el uso de herramientas biotecnológicas se han insertado genes que codifican enzimas de la ruta de biosíntesis para obtener variedades con mayores niveles de carotenos, incluido, el b-caroteno, en especies como arroz, canola, papa y tomate (Sandmann, 2001; Decreux et al., 2004; Ye et al., 2000).
El conocimiento de la variabilidad genética asociada con el contenido de carotenos es requisito esencial para los programas que buscan mejorar la calidad nutritiva de las raíces de yuca, además es el punto de partida para las investigaciones tendientes a conocer el funcionamiento de los mecanismos de síntesis, transporte y acumulación de estos pigmentos en la ruta de biosíntesis de carotenoides. El presente trabajo tuvo como objetivo estudiar la variabilidad genética en 67 accesiones existentes en el Banco de Germoplasma de Yuca en el Centro Internacional de Agricultura Tropical (CIAT) y evaluar marcadores microsatélites asociados a QTL's reportados en trabajos anteriores y que han permitido encontrar regiones del genoma de yuca asociadas con altos contenidos de b-caroteno (Marín, 2008; Morillo, 2009).
La investigación se realizó con la coordinación del Proyecto de Mejoramiento y Genética de Yuca, en los laboratorios de Bioquímica y Marcadores Moleculares de la Unidad de Biotecnología del CIAT, Palmira (Colombia). Para caracterizar la variabilidad genética se utilizaron 67 materiales de yuca disponibles en campo en el CIAT, provenientes de distintas fuentes, entre ellas, autopolinizaciones, cruzamientos dirigidos o mezcla de semillas, y de regiones geográficas de Brasil (MBRA), Perú, (MPER), Cuba, Argentina (MARG) y Colombia (MCOL) (M = Manihot).
La extracción de ADN genómico se realizó mediante el protocolo descrito por Dellaporta et al. (1983), modificado para miniextracción en el Laboratorio de Genética de Yuca del CIAT. Para la cuantificación se utilizó un fluorómetro de ADN modelo DYNA Quant 200 Hoefer, empleando como estándar de calibración ADN Lambda a 100 ng/µl.
Se seleccionaron 140 marcadores microsatélites que presentaron patrones electroforéticos consistentes y apropiados para los análisis moleculares, los cuales han sido usados en estudios de mapeo y de variabilidad genética en yuca (Marín, 2008; Kizito et al., 2007; Chavarriaga-Aguirre et al., 1998). Estos marcadores fueron desarrollados en estudios previos por Mba et al. (2001).
]]> Las temperaturas de hibridación para los microsatélites se mantuvieron entre 45 °C y 55 °C. La amplificación se realizó en un termociclador MJ research PTC-100TM Programmable Thermal Controller Hot Bonnet (MJ Research, Inc - EE.UU.). El cóctel para desarrollar las reacciones de amplificación contenía Buffer Tampón Taq 1X, MgCl2, 2mM, dNTPs 200 uM, Primer F 0.2 uM, Primer R 0.2 uM, Taq Polimerasa 1 unidad, ADN 10 ng/µl, Agua HPLC (15 µl), para un volumen final de la reacción de 25 µl. Se utilizaron las condiciones térmicas descritas por Mba et al. (2001), con las modificaciones siguientes: desnaturalización inicial de 94 °C por 2 min, seguido de 30 ciclos a 94°C por un min, 45-55°C por un min, 72°C por 2 min y una extensión final de 72 °C por 5 min.La detección y visualización de los productos amplificados se hizo mediante electroforesis de tipo vertical en geles de poliacrilamida al 4% con un espesor de 0.4 mm (McCouch et al., 1997), preparados en un equipo de secuenciación Sequi-Gen GT de Bio-Rad y corridos a 100 W/cm3 durante 90 min. Para la visualización se utilizó tinción con sales de plata, como se describe en el protocolo estándar.
Análisis de resultados
Para el análisis de la variabilidad genética se construyó una matriz de presencias (1) o ausencias (0) para evaluar cada uno de los alelos encontrados, en la cual las accesiones forman las filas y las columnas las bandas evaluadas en cada uno de ellos.
Para estudiar el grado de similitud entre los individuos se empleó el índice de similitud de Nei y Li (1979) (Leung et al., 1993), también conocido como similitud de DICE (Sneath y Sokal, 1973) o de Sorensen (1948), con la fórmula:
donde, Sij = Similitud entre el individuo i y el j, a = Número de bandas presentes simultáneamente en los individuos i, j, b = número de bandas presentes en i y ausentes en j, c = número de bandas presentes en j y ausentes en i.
El coeficiente de DICE omite la consideración de pares negativos (0 - 0) y da doble peso a los pares positivos (1 - 1) (Sneath y Sokal, 1973) lo que es útil en términos de similitud del ADN, donde la ausencia compartida de una banda no es, necesariamente, una indicación de similitud entre dos individuos.
Método de clasificación
]]> La matriz de similitud se construyó con el programa SIMQUAL del sofware Numerical Taxonomy System for Personal Computer (NTSYS- pc versión 1.8) (Sneath y Sokal, 1973). El método utilizado fue el de distancia (o similitud) UPGM A (Unweighted Pair-Group Method with Arithmetic Mean) el cual produce una menor distorsión al ser comparada con la matriz original de similitud. A partir de esta matriz se construyó un dendrograma con el Programa TREE de NTSYS- pc (NTSYSpc versión 2.02). Finalmente, se realizó un bootstrap de 100,000 repeticiones para verificar la validez de los resultados obtenidos (Felsenstein, 1985; Efron, 1979).Análisis de varianza molecular (Amova)
Este análisis fue utilizado para probar si existían diferencias entre los distintos sitios geográficos donde fueron recolectados los materiales, además, para determinar cuál de ellos aporta mayores diferencias. Las accesiones fueron distribuidas en grupos con base en el análisis del dendrograma y un nivel de similitud del 68%. Para efectuar el Amova se asumió que cada grupo formado era una población separada. Se utilizó el programa Amova-Prep (Miller, 1998) para generar matrices de distancia, con base en el coeficiente de DICE, y para crear archivos de distancia entre los grupos analizados. Este programa fue diseñado para automatizar los procesos de preparación de archivos utilizados en el Amova (Excoffier, 1992).
Diversidad genética
Para estimar los parámetros de heterocigocidad promedio (H) y el porcentaje de loci polimórficos se utilizó la fórmula no sesgada de Nei y Li (1979). La heterocigocidad esperada (He) es la medida más generalizada de diversidad genética y consiste en la probabilidad de muestrear dos genes que sean diferentes, dentro de una o más poblaciones. Se calcula mediante la fórmula:
donde, xi es la frecuencia en la población del alelo i, y q es el número de alelos. H es la probabilidad de que dos individuos tomados al azar tengan diferente patrón, es el valor o dato con que se presenta la diversidad de la población.
Para estimar la mayor diversidad posible en cada subgrupo, se calculó el coeficiente de diferenciación genética (FST), según lo propuesto por Wright (1978) mediante el programa TFPGA (Tools for Population Genetic Analysis, versión 1.3) (Miller, 1997). Wright (1978) clasifica la diferenciación genética de acuerdo con el FST de la forma siguiente: (1) 0 - 0.05 = poca diferenciación genética, (2) 0.05 - 0.15 = moderada diferenciación genética, y (3) > 0.25 = gran diferenciación genética.
La variación en la frecuencia alélica de las accesiones analizadas se obtuvo utilizando el paquete estadístico TFPGA, además, se determinó el 'f' estadístico insesgado con un intervalo de confianza de 95%.
]]> Determinación del contenido de carotenos totalesLa extracción y cuantificación del contenido de carotenos en raíces de yuca se desarrolló siguiendo la metodología empleada por Safo- Katanga et al. (1984), modificado por Bedoya (1999) y descrita por Chávez et al. (2005). El contenido de carotenos totales fue determinado por el método de absorción espectrofotométrica. La detección se hizo a una longitud de onda de l = 450 nm para extractos de raíz y se usó éter de petróleo como referencia para medir el blanco.
El contenido de carotenos totales se analizó por estadística descriptiva (medidas de tendencia central, de variación, desviación, correlación y regresión) mediante el programa Microsoft Excel (2003) y SAS (2005). Se construyeron histogramas de frecuencia y gráficas de dispersión.
Caracterización molecular
El número de alelos en cada locus en todo el grupo de datos estuvo comprendido en un rango desde 2 hasta 5. En 70% de los 140 marcadores se encontraron tres o más alelos y el número, promedio, de alelos por locus fue de 2.5. Las relaciones genéticas entre las accesiones evaluadas se observan en el dendrograma de la Figura 1. Se formaron seis grupos con un nivel de similitud de 0.68 en los cuales se puede observar claramente una tendencia a agruparse según su procedencia, autopolinización, cruzamiento dirigido o selección masal. No obstante, existen algunos materiales que no obedecen a un patrón de agrupamiento y se encuentran clasificados dentro de distintos grupos, lo que indica las relaciones que se pueden presentar entre las accesiones evaluadas. En el dendrograma se observa que la mayor cantidad de materiales de yuca evaluados se encuentra en el grupo A, que tienen diferente origen geográfico y proceden de distintas fuentes -autopolinizaciones o cruzamientos dirigidos, entre otros- lo que contribuye a la variabilidad genética total observada en todos los grupos evaluados.
No obstante que la yuca es una planta que se propaga vegetativamente, el análisis molecular mostró una gran variabilidad genética, especialmente en las poblaciones silvestres (MBRA 443 y CB 1910, entre otras) que no han sido seleccionadas ni multiplicadas por el hombre, sino que su dispersión ocurre naturalmente. La diversidad genética de las poblaciones que se reproducen clonalmente puede ser debida a diferentes factores, tales como diseminación por semillas, el nivel de alogamia de la especie, el manejo de los agricultores y su proceso empírico de selección basado en sanidad, tamaño de fruto, resistencia a enfermedades y palatabilidad. Algunos de estos materiales son recolectados en campo e introducidos en cultivos por los campesinos, para contribuir así a la variación genética total.
Considerando los seis grupos formados anteriormente mediante el análisis de similitud (0.68), el porcentaje de loci polimórficos fue de 94%, Los valores de heterocigosidad encontrados fueron altos y variaron en un rango entre 0.557 y 0.592, con un promedio de 0.56. Esto implica que la probabilidad de que dos alelos seleccionados al azar sean diferentes es mayor que 50%. El grupo A presentó el valor más alto de heterocigosidad (0.592), lo cual puede ser explicado por el número de muestras que lo componen, la naturaleza alógama de la especie, el origen geográfico (materiales procedentes de Cuba, Colombia) o la fuente de donde proviene el material (autopolinizaciones y cruzamientos), entre otros factores, que contribuyen a aumentar la variabilidad genética en estas poblaciones.
En estudios de diversidad genética en yuca con utilización de marcadores aloenzimáticos (Lefevre y Charrier, 1993a,b; Resende et al., 2000) la proporción de heterocigotos observada fue tres veces menor que cuando se usaron marcadores microsatélites. Se debe tener presente que las isoenzimas miden la diversidad genética que se expresa o la de tipo selectivo, mientras que los microsatélites miden la diversidad genética total o no-selectiva. Los microsatélites son regiones en tandem informativos, repetitivas, no-codificantes y por tanto con una mayor cobertura del genoma.
]]> En accesiones domesticadas de girasol, la proporción de heterocigotos observados fue dos a tres veces más grande para loci microsatélites que para aloenzimas (Tang y Knapp, 2003) y en landraces de sorgo fue 20 veces más grande para microsatélites que para aloenzimas (Djè et al., 1999). En general, la alta proporción de heterocigotos observados en evaluaciones con marcadores microsatélites es esperada debido a su alto polimorfismo y a las características propias de estos marcadores mencionadas anteriormente. Lo anterior corrobora las ventajas de los marcadores microsatélites en la estimación e identificación de la variabilidad genética en poblaciones naturales, lo que a la vez asegura la confiabilidad de la información obtenida en este estudio. Los marcadores microsatélites han sido muy utilizados en la evaluación de la variabilidad genética de yuca para el mapeo de regiones del genoma asociadas con características de interés como carotenos (Marín, 2008), contenido de proteínas (Sheffield et al., 2006) materia seca (Kawano et al., 1987), deterioro fisiológico (Rosero-Alpala et al., 2010), entre otras.La heterocigosidad promedio total observada en los loci evaluados y al considerar todos los grupos formados fue de Ht = 0.559, al igual que la heterocigosidad promedio esperada (He = 0.532), lo cual puede estar asociado con la probable naturaleza alógama de la especie, y favorece la conservación del alto porcentaje de heterocigotos, así como la presencia de algunas accesiones que pudieron ser recolectadas en estado silvestre. Además, estos pequeños desvíos entre lo observado y lo esperado pueden ser indicio de equilibrio Hardy-Weinberg (HW) para los marcadores usados, no obstante la prueba de equilibrio mostró lo contrario. Esta prueba de equilibrio para los 140 marcadores microsatélites utilizados en este estudio y realizada mediante la prueba de ji-cuadrada (X2) para las desviaciones de las frecuencias génicas con respecto a lo esperado con el supuesto de Hardy-Weinberg, mostraron que ninguno de los marcadores utilizados se encontraba en equilibrio, resultado importante para la continuidad de los análisis de diversidad genética y estructura poblacional de los materiales evaluados.
Por otra parte, solamente una pequeña fracción de la heterocigosidad observada fue debida a la diferenciación entre los grupos formados (Gst = 0.034), mientras que la mayor parte de la diversidad se encontró dentro de los grupos (Hs = 0.543), lo que indica la necesidad de hacer muestreos más precisos al evaluar la diversidad genética presente en poblaciones naturales de yuca, o sea, estudios microgeográficos que permitan explorar mucho más el potencial genético de estos materiales. Por el contrario, Kizito et al. (2006) en un estudio sobre diversidad y variabilidad genética de yuca en pequeñas fincas en Uganda encontraron que la mayor parte de la diversidad genética total (FIT = 0.236) estaba entre variedades (Fst = 0.250) comparada con la diversidad dentro de ellas (FIS = -0.021), demostrando así que las variedades fueron diferenciadas unas de otras por factores genéticos y ambientales. Lo anterior muestra que los estudios de variabilidad están influenciados por factores tanto genéticos como ambientales y que para su estimación es necesario hacer un buen muestreo, con una variabilidad representativa de la especie en estudio y de las condiciones ambientales que influyen en su desarrollo.
En un estudio del efecto de la introgresión en el acervo genético de la yuca y la diferenciación genética entre América Latina y el Este y Oeste de África, Kizito et al., (2007) encontraron que los cálculos de diferenciación genética entre los grupos (Fst), mostraron una pequeña variación entre las variedades en Uganda y Tanzania (Este de África) y Nigeria (Oeste de África), con un Fst, promedio de 0.048. Sorprendentemente se encontró una gran diferenciación genética entre las variedades de yuca de Uganda y Nigeria y entre variedades de Tanzania y Nigeria, lo que no ocurrió entre variedades de América Latina y los países africanos (Fst promedio, = 0.067). Lo anterior pone de manifiesto el efecto de la introgresión en la diversidad genética de una especie y, tal como se encontró en este estudio, la variabilidad puede estar asociada con el efecto del muestreo o la genética misma de los materiales, que al interactuar en diferentes ambientes manifiestan todo su potencial.
En estudios de diversidad genética en Uganda, los valores más pequeños del promedio de heterocigosidad esperada y corregida por el tamaño pequeño de la muestra, se presentaron en agroecosistemas del Norte (0.487), mientras que los agroecosistemas de montaña tuvieron los más altos valores (0.594) (Nei y Li, 1979). Es necesario resaltar que en los ecosistemas donde la acción antrópica es mínima, hay una alta variabilidad. Esto confirma los hallazgos en este estudio en relación con las accesiones silvestres, no domesticadas y no intervenidas por el hombre, que ayudaron a aumentar la variabilidad genética total hallada en los grupos evaluados (Ht = 0.532).
Los resultados muestran una considerable variación genética, tanto entre como dentro de grupos conformados, aunque la variación fue más grande en este último caso. Sin embargo, la gran similitud encontrada entre algunas accesiones evaluadas sugiere la ocurrencia de intercambio de material entre agricultores de fincas cercanas o intercambio de germoplasma entre los productores e investigadores de diferentes países.
Teniendo en cuenta los valores de heterocigosidad (Ht = 0.559) y de diferenciación genética (Gst = 0.034) observados en este estudio, se puede afirmar que hay suficiente diversidad genética entre las accesiones evaluadas, la cual puede estar asociada con la probable naturaleza alógama de la especie, migración, flujo de genes, transferencia de materiales entre regiones, presencia de accesiones silvestres, entre otros factores. Por lo tanto, existen materiales a partir de los cuales se pueden diseñar esquemas de mejoramiento tendientes a la obtención de una mejor calidad nutritiva de la yuca.
En Brasil, centro de origen de la planta, se encontró una alta diversidad de la yuca silvestre y sus clones indígenas. Los recursos genéticos de Manihot han sido recolectados, evaluados y manipulados desde 1970 (Nassar, 1999). La diversidad genética de las especies silvestres por la evolución y selección natural, combinada con la selección a través de miles de años, ha permitido el desarrollo de recursos genéticos muy diversos. Estos clones indígenas han tolerado la selección de otros clones con alto contenido de b-caroteno, como también ricos en licopeno combinados con una alta palatabilidad (Nassar et al., 2005), los cuales han sido propagados y distribuidos por los agricultores en el Distrito Federal y Estados adyacentes en Brasil.
En este estudio, los materiales silvestres hallados en los grupos B y F aportaron significativamente a la variabilidad genética total del grupo por las características mencionadas anteriormente, en consecuencia se hace necesario el planteamiento de estrategias de conservación de este germoplasma.
Los resultados de este estudio muestran el potencial de las especies silvestres en el incremento de características de importancia nutritiva como el contenido de proteínas; por tanto existe la posibilidad de explotar esa variabilidad en la búsqueda de materiales con buenos contenidos de carotenoides pro-vitamina A. Los resultados muestran la existencia de variabilidad genética, la cual representa un potencial que puede ser útil cuando se incorpore dentro de los programas de mejoramiento de la productividad, la calidad, la resistencia a factores bióticos y abióticos del germoplasma de yuca y, finalmente, la conservación de la fuente de genes que se encuentra en los materiales recolectados en estado silvestre.
]]> Contenido de carotenos totales y marcadores microsatélites asociadosEl contenido de carotenos totales en las 67 accesiones evaluadas mostró valores entre 0.95 y 18.25 ug/g, con base en el peso fresco, para los genotipos CB5-5 y CB7-9, respectivamente (Cuadro 1).
El patrón de distribución del contenido de carotenos totales en las accesiones evaluadas (Figura 2) mostró que las clases más numerosas corresponden a los individuos que presentan contenidos entre 5 y 12 ug/g en peso fresco, por tanto constituyen materiales promisorios para ser evaluados con los marcadores microsatélites polimórficos seleccionados anteriormente y evidencian la presencia de loci que codifican para características cuantitativas o QTL's.
Los análisis entre los contenidos de carotenos totales y los marcadores microsatélites identificados previamente como polimórficos, y con loci que codifica para características cuantitativas (QTLs) (Marín, 2008), mostraron valores de correlación entre 0.45 y 0.62 y de regresión entre 0.19 y 0.38, para los marcadores SSRY-178 y SSRY-324 que se encuentran en los grupos de ligamiento H y D, respectivamente (Cuadro 2).
En estudios anteriores, en los cuales fueron evaluados estos mismos marcadores, pero en poblaciones segregantes F1 provenientes del cruzamiento entre raíces blancas y amarillas entre sí mismas y blancas x amarillas y en las familias S1, se encontraron valores de correlación y regresión mucho más altos. Una vez más, los marcadores que explican en mayor proporción la variación fenotípica observada para la característica contenido de carotenoides, se encuentran ubicados en el grupo de ligamiento D. Por otra parte, los marcadores que mostraron alta correlación con los bajos contenidos de carotenos en las familias S1, en estas evaluaciones presentaron bajos valores de correlación, como el marcador SSRY-178 y SSRY-49 (AM691, AM697, AM698). Estos marcadores pueden ser tenidos en cuenta en procesos de selección negativa para la característica, ya que permitirían la identificación temprana de aquellos genotipos que poseen muy bajos contenidos de carotenoides. Así, las regiones del genoma que habían sido identificadas anteriormente con bajos, intermedios y altos contenidos de b-caroteno, presentan el mismo comportamiento en otras poblaciones y en otras condiciones, lo cual es bueno en los programas de Mejoramiento Asistido por Marcadores (MAS) que busquen incrementar los contenidos de estos pigmentos en las raíces de yuca.
Al personal del Programa de Mejoramiento y Genética de Yuca, al Laboratorio de Bioquímica y Calidad de Raíces y al Laboratorio de Marcadores Moleculares del CIAT, por su apoyo en la realización del presente trabajo.
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