Artículo científico
1 Faculdade de Engenharia de Alimentos, Universidade Estadual de Campinas –UNICAMP, Campinas, SP, Brasil.
2 Facultad de Ingeniería Agronómica, Universidad del Tolima, Ibagué, Tolima, Colombia. ]]>
Neste trabalho foi estudado o processo de extração da papaína presente no látex de frutos de mamão (Carica papaya L.) cultivar Maradol. As variáveis estudadas na extração da papaína foram proporção de látex:álcool (1:2.1 e 1:3) e tipo de secagem (à vácuo e por refractance window). As respostas obtidas foram atividade enzimática da enzima e rendimento do processo de extração. O melhor resultado em termos de atividade enzimática e rendimento foi obtido nas condições de secagem à vácuo e proporção látex:álcool de 1:3. A enzima obtida foi caracterizada por testes físico-químicos, microbiológicos e de atividade enzimática e comparada com uma amostra comercial usada como padrão.
Palavras chave: Látex, papaína, processo de extração.
Key words: Extraction method, latex, papain.
A papaína (E.C. 3.4.22.2) é uma enzima proteolítica com massa molecular de 23,406, a qual possui uma cadeia de poilipetideos de 212 aminoácidos. Sua importância comercial deve-se aos variados usos nas indústrias têxteis, farmacêutica, cosméticas e alimentaria (Galindo-Estrella et al., 2009). Nesta última, destaca-se sua ação como amaciante de carnes, agindo nas fibras musculares e nos componentes do tecido conectivo e, na indústria de bebidas é usada para hidrolisar as proteínas de alto peso molecular na clarificação da cerveja, evitando a turbidez deste produto durante seu armazenamento e refrigeração prolongada (Aehle, 2007). O látex obtido de frutos verdes do mamoeiro (Carica papaya L.) corresponde a uma mistura de enzimas proteolíticas que incluem papaína, quimopapaína A e B (EC 3.4.22.6), papaia endopeptidase III, papaia endopeptidase IV, e papaia endopeptidase ômega (Azarkan et al., 2003). Vários estudos têm reportado a extração de papaína empregando diferentes reagentes na etapa de precipitação (Marrero, 1977; Monti et al., 2000). A etapa de secagem na produção desta enzima é de grande importância, pois durante este processo, as enzimas podem perder sua estrutura nativa e em consequencia, afetar sua atividade enzimática (Sloth et al., 2008). Diante disso, este trabalho teve como objetivo estudar a influência das condições do processo de extração, a saber:proporção látex:álcool (1:2.1 e 1:3) na etapa de precipitação e tipo de secagem: à Vácuo(50 °C) e refractance window (95 °C para o meio calefator) na produção de enzima a partir do látex de frutos verdes. Como variáveis respostas foram avaliadas o rendimento do processo de extração. A atividade enzimática foi medida pelos métodos de produção de tirosina e de coagulação do leite, além disso a enzima obtida foi testada em processos de clarificação de cerveja.
Material
Foram empregados frutos verdes de Carica papaya L. da variedade Maradol, entre 5 e 6 meses de idade, os quais foram colhidos em um plantio localizado a 240 m.s.n.m., com temperatura meia de 28 °C e tipo de solo franco-arenoso, na região de Flandes (Tolima, Colômbia). Para a colheita dos frutos foram selecionadas aleatoriamente 59 árvores e de cada árvore foram escolhidos 4 frutos verdes com diâmetro entre 15 e 35 cm, longitude entre 35 e 41 cm e massa entre 1.8 e 2.5 Kg. Todos os reagentes empregados (sulfato de amônio, EDTA, etanol (96% v/v) e metabisulfito de sódio) foram de grau analítico (Merck Chemicals), e papaína comercial empregada como padrão foi fornecida pela Merck Chemicals (Alemanha).
Obtenção do látex
]]> O látex foi extraído a partir de 4 incisões longitudinais na casca dos frutos usando instrumentos em aço inoxidável, coletado por gotejamento, conservado com a adição de metabisulfito de sódio (0.5% p/p) e estocado a -5 °C até seu uso.Extração da papaína
A papaína foi obtida através de uma serie de operações esquematizadas na Figura 1. A primeira etapa compreendeu a eliminação de pequenas moléculas orgânicas e inorgânicas e outras proteínas presentes no látex extraído, por meio da adição de sulfato de amônio e EDTA. Durante esta etapa o látex foi solubilizado e posteriormente diluído com álcool (etanol, 96% v/v) até atingir uma concentração alcoólica de 10%. As impurezas precipitadas na etapa anterior foram eliminadas por filtração empregando terras diatomáceas. O líquido filtrado foi adicionado de etanol (96% v/v) em duas proporções látex:álcool: 1:2.1 ou 1:3, para obter um precipitado, o qual foi recuperado por filtração á vácuo usando papel Wathman no.1.
O sólido foi finalmente secado, empregando dois métodos diferentes: (1) secagem a vácuo (com temperatura 50 °C, Lab live duo-vac oven, Lab Line Instruments), ou (2) secagem por refractance window (MCD Technologies, Inc.) empregando agua a 95 °C como meio calefator e finalmente a enzima foi moída para a obtenção de um pó fino.
Análises físico-químicas e microbiológicas
Umidade final pelo método 925.09 (A.O.A.C., 2005), Cinzas segundo método 923.03 (A.O.A.C., 2005), pH, medido com pHmetro (Schoot-gerate CG818), solubilidade foi determinada com os solventes água, éter etílico, ácido clorídrico, hidróxido de sódio, bicarbonato de sódio e ácido sulfúrico. Para detectar a presença de proteínas foi usado o teste do Biureto e, espectroscopia de absorção no infravermelho (FTS-2400) para verificar a existência de grupos funcionais característicos desta enzima.
Foram realizadas análises microbiológicas como mesófilos (UFC/g), NMP de coliformes totais/g, bolores e leveduras (UFC/g).
Atividade enzimática
]]> Método da tirosina. A atividade proteolítica foi determinada usando caseína como substrato a 37 °C e pH de 8.2. Na proteólise da caseína a tirosina é liberada e pode ser medida por espectrofotometria em 280 nm, a atividade é calculada pela equação 1. Uma unidade de enzima para este procedimento é definido como a atividade a uma determinada quantidade de enzima degrada a caseína, sob condições específicas de pH e temperatura, para produzir um mol de tirosina por minuto (Afaq e Iqbal, 2001).
Método de coagulação do leite
Através deste teste é calculada a potência da enzima em quebrar a estrutura de proteínas do leite (substrato). Em este método 10 mg de solução de papaína a uma concentração de 1 g de enzima em 10 g de ácido acético (0.01%) foi adicionado a uma solução de 10 ml do leite (2.5 g do leite em pó em 100 g de agua) a qual foi aquecida em banho a 50 °C (Ming et al., 2002). O conteúdo de tubo foi agitado até o primeiro sinal de formação de coágulos. O tempo que demora na formação do coagulo e registrado e empregado na equação 2. A atividade da enzima é expressa em unidade de potência de coagulação do leite por grama de enzima seco (Upe).
onde, E: miligramos de papaína usada para precipitar 10 ml do substrato (o leite) no tempo t (min).
Aplicação de papaína em cerveja
Durante a fermentação e a maturação da cerveja formam-se redes coloidais que podem precipitar e ocasionar a turvação da cerveja engarrafada, durante o armazenamento a frio. Esses precipitados coloidais são frações de compostos coloidais como polifenóis e proteínas, assim a ação da papaína procura a estabilização da cerveja por meio da hidrólise desses compostosde modo que a formação da rede de proteína-polifenol é inibida (Rehmanji et al., 2005).
]]> No teste 10 mg de enzima foram adicionados a 100 ml de cerveja sem tratamento enzimático, mantendo-a em reposo durante 1 h, ao final é medido o índice de turbidez (turbidímetro HACH modelo 2100N) e comparado com o do produto acabado (cerveja após o tratamento enzimático) (Rehmanji et al., 2005). A turbidez é expressa em NTU (Unidades Nefelométricas de Turbidez).Delineamento experimental
Foi usado um delineamento experimental foi o inteiramente casualizado com 4 tratamentos, e 2 repetições (Tabela 1) para avaliação da influência dos fatores: proporção látex:álcool (1:2.1 ou 1:3) e tipo de secagem: (1) secagem a vácuo (temperatura 50 °C), ou (2) secagem por Refractance window (agua a 95 °,C como meio calefator). As variáveis respostas foram: rendimento (expressado como a quantidade de enzima seca obtida em relação a quantidade de látex fresco), e atividade enzimática. As determinações analiticas foram conduzidas em duplicata, e os valores das meias foram comparados pelo teste de Tuckey (P < 0.05) utilizando o software Statistica (V.7.0).
Na Figura 2 é apresentado o rendimento de extração (papaína (g)/100g látex) para os tratamentos experimentais. Pode se observar que o rendimento mais alto no processo de extração de papaína foi obtido nos tratamentos 2 e 4, ou seja aqueles que usaram secagem á vácuo e proporções látex:álcool de 1:2.1 e 1:3. Os rendimentos (g papaína/látex) foram de 10.83 ± 0.04 e 11.53 ± 0.2, respectivamente. Foram encontradas diferenças significativas (P < 0.05) quando comparado com os tratamentos 1 e 3, os quais empregaram secagem por refractance window. Os fatores estudados permitiram confirmar a grande influência do tipo de secagem no rendimento final do processo, a interação entre as variáveis proporção látex:álcool e tipo de secagem resultou igualmente importante. Obtendo-se com tratamento 4 o maior rendimento de extração (g papaína/g látex) com valor de 11.53/100. Este valor foi diferente ao reportado por Monti et al. (2000) os quais obtiveram rendimentos em torno de 1.51 mg/g látex em um processo que emprega nitrogênio e EDTA na sequencia de resfriamentos e cristalizações, a partir de látex de frutos de C. papaya oriundos do estado de São Paulo (Brasil). Esta diferença pode ser explicado pela procedência dos futos e as condiçoes operativas do processo de extração, neste sentido Galindo-Estrella et al. (2009) confirmaram que nos frutos de C. papaya L. da variedade Maradol é encontrada a maior atividade proteolítica quando comparado com extratos de caule e folhas.
Na Figura 3 podem se observar os resultados dos testes de atividade enzimática pelo método de produção de tirosina (Figura 3a) e pelo método de coagulação do leite (Figura 3b). Foi evidenciado que a amostra do tratamento 4 teve a mesma atividade enzimática da enzima comercial (padrão), e só apresentaram diferenças significativas quando comparados com os tratamentos 1, 2 e 3 (P < 0.05). Sendo então a relação látex:álcool e o tipo de secagem fatores importantes na atividade enzimática. Estes resultados concordam com o reportado por Puig et al. (2008) que estudaram diferentes métodos de secagem de papaína crua (látex) encontrando alta atividade da enzima quando é sometida a que secagem à vácuo (50 °C) e liofilização (-30 °C). As diferenças em atividade das enzimas nos tratamentos com secagem à vácuo e refractance window podem-se dever à perda de atividade por causa de mudanças produzidas na sua estrutura nativa no processo de secagem, como foi reportado por Devakate et al. (2009) e Sloth et al. (2008).
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Os resultados da caracterização físico-química realizada para a enzima obtida (papaína) são apresentados na Tabela 2. Os testes físico-químicos foram realizados para a amostra do tratamento 4, onde valores de pH, umidade e solubilidade próximos aos da enzima comercial (padrão). A diferença no conteúdo de cinzas pode-se dever à ação quelante do EDTA empregado no processo de extração, o qual forma um complexo com íons metálicos acrescentando sua solubilidade, a procedência diferente das amostras explica as diferenças.
A reação com biureto confirma a presença de aminoácidos e proteínas, pois o reagente de biureto reage com ligações peptídicas em polipeptídeos tanto na enzima obtida quanto na enzima comercial. A presença dos grupos funcionais característicos da papaína é confirmada por meio da espectroscopia de infravermelho o qual reporta a existência dos grupos carboxila, amino, carbono e hidrogênio alifáticos tanto na enzima obtida quanto na enzima padrão (Tabela 2).
Os resultados apresentados na Tabela 2 revelaram a qualidade microbiológica da enzima obtida comparada com a enzima padrão, quanto à presença de microorganismos mesófilos, coliformes totais e bolores e leveduras. Os resultados dessas análises se encontraram dentro dos padrões aceitos pela legislação colombiana.
Quanto ao resultado do teste de clarificação em cerveja (Tabela 3) observou-seque a papaína obtida pelo tratamento 4 conseguiu a diminuição da turbidez da cerveja até um nível comparável com o produto final (comercial). Este teste permitiu concluir que a enzima obtida teve ação efetiva na ruptura de complexos coloidal proteína-polifenolde alto peso molecular (medida pelo decréscimo na turbidez), melhorando a clarificação da cerveja.
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