1Centro de Investigación de Enfermedades Tropicales (CINTROP), Departamento de Ciencias Básicas, Escuela de Medicina, Universidad Industrial de Santander. 2Centro de Investigación en Ciencia y Tecnología de Alimentos (CICTA), Escuela de Química, Universidad Industrial de Santander. 3Centro de Investigación en Biomoléculas, CIBIMOL-CENIVAM, Universidad Industrial de Santander, Bucaramanga, Colombia.
*Autor para correspondencia: pescobarwwww@gmail.com
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Rec.: 08.03.11 Acept.: 05.06.12
Se evaluó el efecto antifúngico in vitro de cinco aceites esenciales (AEs) (AE1, AE2, AE3, AE4 y AE5) extraídos de Lippia origanoides, L. citriodora y L. alba sobre aislados de monilia (Moniliophthora roreri) obtenidos de frutos de cacao infectados provenientes de San Vicente de Chucurí, Santander, Colombia. Las plantas de Lippia fueron colectadas en cinco localidades colombianas. Los aislados de monilia (M1, M2, M3, M4 y M5) fueron caracterizados por su morfología, germinación y crecimiento en medios de cultivo. La actividad antifúngica de diferentes concentraciones de los AEs fue evaluada contra el aislado M2 y la cepa de M. roreri (ATCC 64239), para determinar su efecto sobre la germinación y la inhibición del crecimiento micelial. Los AEs estudiados inhibieron 100% de la germinación y del crecimiento micelial cuando fueron utilizados en concentraciones de 800 - 1000 µg/ml. Concentraciones de 200 µg/ml también mostraron efecto sobre los aislamientos fúngicos, siendo los AEs obtenidos de L. origanoides (AE2 y AE3) los más activos. Estos estaban compuestos principalmente por timol, p-cimeno, g-terpineno, acetato de timilo, carvacrol, b-mirceno, trans-b-cariofileno. Diferencias significativas (P < 0.05) sobre la susceptibilidad se observaron entre las dos cepas fúngicas estudiadas, siendo en general más susceptible el aislado M2 que la cepa ATCC. Los AEs de L. origanoides son candidatos para ser usados como posibles biofungicidas en el control de la moniliasis. Son necesarios estudios futuros orientados a determinar la actividad in vivo antifúngica de estos AEs y sus principales componentes.
Palabras clave: Control cultural, fungicidas, Lippia spp., monilia, Moniliopththora roreri, plantas aromáticas, plantas plaguicidas, Theobroma cacao.
The in vitro antifungal effect of five essential oils (EOs) (EO1, EO2, EO3, EO4 and EO5) extracted from Lippia origanoides, L. citriodora and L. alba on isolates of Monilia (Moniliophthora roreri) was evaluated. Lippia plants were collected at five locations in Colombia, and monilia isolates were obtained from infected cocoa fruits collected in San Vicente de Chucurí, Santander, Colombia. The fungi strains (M1, M2, M3, M4 and M5) were characterized by morphology, germination and growth in culture media. Antifungal activity of different concentrations of EOs was evaluated against the M2 and the isolated strain of M. roreri (ATCC 64239) determining their effect on germination and mycelial growth inhibition. The five essential oils studied inhibited 100% germination and micelial growth when they were used at concentrations from 800 to 1000 µg/ml. Concentrations of 200 µg/ml also showed an effect on fungal isolates, being the EOs obtained from L. origanoides (EO2 and EO3) the most active. These were mainly composed of thymol, p-cymene, g-terpinene, timilo acetate, carvacrol, b-myrcene, trans- b-caryophyllene. Significant differences (P < 0.05) on susceptibility were observed between the two fungal strains studied, being generally more susceptible the isolated M2 that the ATCC strain. The EOs of L. origanoides are candidates for use as biofungicides possible to control the moniliasis. Future studies oriented to determinate the in vivo antifungal activity of these EOs and its major components are required.
Key words: Antifungic agents, aromatic plants, cultural control, frosty pod rot, Lippia spp., Moniliopththora roreri, pesticide plants, Theobroma cacao.
]]> Introducción
El cacao (Theobroma cacao L.) es un árbol tropical del cual se obtienen las semillas productoras de chocolate y sus derivados, que constituye el tercer producto agrícola más importante en los países tropicales, después del té y el café. La producción mundial anual de cacao es aproximadamente de 3,700,000 toneladas, 68% de la cual proviene del continente africano, seguido por Indonesia (12%), Latinoamérica (8%) y otros países tropicales (10%) (Prabhakaran, 2010; Hebbar, 2007).
La calidad y la producción de los cultivos de cacao se encuentran limitadas principalmente por problemas fitosanitarios, que generan pérdidas hasta del 100% de las cosechas (Hebbar, 2007). Entre las enfermedades más importantes se encuentran las infecciones por hongos fitopatógenos como la ’escoba de bruja’ causada porMoniliophthora perniciosa (=Crinipellis perniciosa), la moniliasis o pudrición acuosa producida por Moniliophthora roreri (Cif.) H.C. Evans et al. (1978) y la pudrición negra, causada por varias especies de Phytophthora (Hebbar, 2007).
En Colombia, la moniliasis, una enfermedad dos veces más destructiva que la pudrición negra y más difícil de controlar que la escoba de bruja, se encuentra ampliamente distribuida y ocasiona pérdidas superiores al 90% de la producción (Phillips-Mora y Wilkinson, 2007). La patogenicidad de la enfermedad ha sido atribuida a la capacidad de penetración y multiplicación del hongo en el parénquima cortical de la planta, lo que causa necrosis de los tejidos. Además, el inóculo de frutos infectados es muy abundante y puede conservar su alta capacidad infectiva hasta por nueve meses (Phillips-Mora y Wilkinson, 2007). Las esporas del hongo infectan exclusivamente los frutos y, según la edad y las condiciones ambientales, producen síntomas como maduración prematura, hipertrofias, deformaciones, puntos de color verde con zonas amarillentas de maduración, manchas de color marrón cubiertas con un micelio blanquecino, marchitez y secamiento completo de los frutos (Evans, 2002; Phillips-Mora y Wilkinson, 2007).
Las medidas de control están orientadas principalmente a evitar la diseminación de la enfermedad y a la implementación de buenas prácticas de cultivo como podas, drenajes, remoción de frutos enfermos, entre otros. Debido a que estas prácticas culturales son costosas, se buscan alternativas como la utilización de biocontroladores, clones de cacao resistentes a la infección y productos químicos elaborados con cobre, recomendados como complemento en plantaciones con alta productividad.
Los productos naturales derivados de plantas, entre ellos los aceites esenciales (AE), constituyen una alternativa de control de las enfermedades ocasionadas por fitopatógenos. Estos productos son mezclas complejas de compuestos orgánicos presentes en diferentes concentraciones (Stashenko et al., 2010). Los AEs derivados de plantas aromáticas pertenecientes a diferentes familias, especialmente a la familia Lamiaceae, o sus componentes principales han mostrado una buena actividad contra algunas especies de hongos fitopatógenos (Muller-Riebau et al., 1995; Zambonelli et al., 1996; Pitarokili et al., 2003; Kordali et al., 2008).
El género Lippia está constituido por plantas aromáticas utilizadas tradicionalmente para el control de enfermedades gastrointestinales y respiratorias (Pascual et al., 2001). Se encuentran ampliamente distribuidas en el territorio colombiano y las especies más frecuentes son L. origanoides H.B.K., L. citriodora (Ort.) H.B.K. y L. alba (Mill.) N.E. Brown (Mesa-Arango et al., 2009; Stashenko et al., 2010). Las plantas de L. alba se clasifican en diferentes quimiotipos (I-VII) de acuerdo con las variaciones intraespecíficas en los patrones de composición (Hennebelle et al., 2006). Los AEs de este género muestran un amplio espectro de actividades biológicas contra bacterias, hongos, parásitos, virus e insectos (Escobar et al., 2010; Meneses et al., 2009; Mesa-Arango et al., 2009; Olivero et al., 2009). Algunas especies de Lippia han revelado actividad contra hongos fitopatógenos (Deka et al., 2010; Linde et al., 2010; Regnier et al., 2010).
El objetivo del presente trabajo fue determinar la actividad de los AE de L. origanoides, L. citriodora y L. alba sobre aislados de Moniliophthora roreri obtenidos de frutos de cacao recolectados en el departamento de Santander, Colombia.
En enero y mayo de 2009 se recolectaron frutos de cacao en cuatro fincas productoras de la zona rural del municipio de San Vicente de Chucurí, Santander, localizadas entre 720 y 1200 m.s.n.m. (Cuadro 1). De cada planta se seleccionó aleatoriamente un fruto enfermo con síntomas tempranos de la enfermedad como gibas o jorobas y puntos o manchas pardo-oscuras en la corteza.
Después de lavar los frutos recolectados, se tomaron fragmentos de la corteza que fueron sembrados en agar papa dextrosa (PDA, Merck) y agar extracto de malta (MEA, Merk) a 25 °C hasta observar crecimiento (Saldarriaga y Pineda, 2001). Las colonias fueron identificadas por sus características macroscópicas y microscópicas y las compatibles se replicaron en PDA hasta obtener cultivos puros. Para la clasificación se siguieron los criterios descritos en el manual de Barnett y Hunter (1972).
En total se obtuvieron cinco aislados de Moniliophthora roreri (M1, M2, M3, M4 y M5 -Cuadro 1) que fueron caracterizados por diámetro, coloración y textura de las colonias, tipo y tamaño, crecimiento en PDA y MEA y producción de esporas (Cuadro 1). El aislado M2 presentó la mayor tasa de crecimiento y porcentaje de germinación, características indispensables para la realización de los ensayos de actividad antifúngica propuestos; por tal motivo éste fue el único aislado fúngico utilizado. En el estudio también se usó una cepa referenciada de M. roreri obtenida del ATCC 64239 que se denomina en este texto cepa ATCC. Aunque no hay información de la susceptibilidad de esta cepa a antifúngicos, se consideró conveniente utilizarla ya que, a diferencia del aislado M2, está caracterizada como M. roreri, la especie de Moniliophthora involucrada en la moniliasis de cacao (Phillips- Mora y Wilkinson, 2007).
Aceites esenciales utilizados
En el estudio se utilizaron cinco AEs (AE1, AE2, AE3, AE4 y AE5) obtenidos de plantas de Lippia distribuidas en diferentes lugares de Colombia (Cuadro 2). La identificación taxonómica de las plantas se hizo en el Herbario Nacional de Colombia. Las plantas fueron clasificadas por el doctor J. L. Fernández y los pliegos-testigo de cada planta fueron depositados en el mismo Herbario (Cuadro 2).
Los AEs se obtuvieron a partir de 300 g de hojas y tallos del material cosechado, por hidrodestilación asistida y radiación con microondas (MWHD). La identificación de los componentes presentes en ellos se llevó a cabo por cromatografía de gases mediante acoplada a espectrometría de masas (GC-MS) empleando un cromatógrafo Agilent Technologies 6890 Plus (HP, Palo Alto, California, USA) acoplado a un detector selectivo de masas Agilent Technologies MSD 5973 (Stashenko et al., 2010). Como control positivo se utilizó la anfotericina B (AmB, Sigma-Aldrich).
Se prepararon soluciones stock de los AEs y la AmB en dimetilsulfóxido (DMSO) y soluciones de trabajo en solución salina pH 7.4. La concentración final de DMSO en la solución stock fue menor que 0.05%. Se prepararon diluciones seriadas de los AEs en el medio de cultivo PDA líquido. Cada dilución fue colocada en caja Petri o láminas portaobjetos, según el tipo de ensayo.
Determinación de la actividad antifúngica
La actividad antifúngica se evaluó por la inhibición del crecimiento micelial del hongo y de la germinación determinada por la técnica de microcultivo. Las esporas del hongo (1 x 106 esporas/ml) fueron colocadas sobre una lámina porta-objetos con PDA con diferentes diluciones de los AEs (200 a 1000 µg/ml). La esporulación se determinó por recuento microscópico cada 6 h durante 48 h. Como espora germinada se consideró aquella que mostraba la presencia de un tubo germinal incipiente o completamente desarrollado. Como control se realizaron preparaciones sin AE. El porcentaje de germinación se determinó al dividir la cantidad de esporas germinadas por el total de esporas encontradas, que fue de 300 esporas. El porcentaje de inhibición de la germinación se calculó utilizando la ecuación siguiente: 100-[(Tx100)/C], donde T son los valores del tratamiento y C los valores del control (Saldarriaga y Pineda, 2001). Cada ensayo se repitió dos veces.
]]> La inhibición del crecimiento micelial se determinó de forma macroscópica, colocando en cajas Petri un fragmento de la colonia del hongo sobre medio PDA que contenía diferentes diluciones de AEs (200 a 500 µg/ml), y en un experimento adicional se evaluaron concentraciones inferiores (25 y 50 µg/ml) pero sólo con la cepa ATCC. El crecimiento micelial fue determinado midiendo el diámetro (en cm) de las colonias durante 21 días. Como control negativo se realizaron preparaciones sin AE. La inhibición del crecimiento micelial se calculó usando la misma fórmula anterior —100-[(Tx100)/C]]/i>— donde T son los valores del tratamiento y C los valores del control Saldarriaga y Pineda (2001). Cada ensayo se repitió dos veces.Análisis de resultados
Para medir la actividad fúngica, cada concentración de AE se evaluó por triplicado y los ensayos fueron realizados por duplicado. Para medir las diferencias entre tratamientos se utilizó la prueba ’t’ de Student a un nivel de significancia de 5%.
Las características morfológicas y de crecimiento entre los aislados de Moniliophthora roreri obtenidos directamente de los frutos enfermos de cacao mostraron una alta variabilidad, lo que concuerda con los hallazgos de Grisales y Afanador (2007). Las colonias presentaron aspecto pulverulento con colores beige a marrón (Foto 1). En microscopio se observaron hifas hialinas septadas y conidias catenuladas ovoides o redondas (Barnet et al., 2002). Se encontraron diferencias significativas en el crecimiento micelial de los hongos en ambos medios de cultivo (P < 0.05); 21 días después de la inoculación, los aislados en MEA presentaron un rango de crecimiento radial entre 4.2 y 5.0 cm y en PDA entre 3.7 y 4.5 cm (Cuadro 1).
Todos los AE evaluados mostraron actividad antifúngica e inhibieron totalmente la germinación de las esporas, cuando fueron utilizados en concentraciones altas (600 - 1000 µg/ml). Los AEs obtenidos de L. origanoides (AE2 y AE3) fueron los más activos cuando se aplicaron en concentraciones de 200 µg/ml, e inhibieron la germinación del aislado M2 en más del 90% (Cuadro 3, Figura 1). El grado de inhibición presentada por los AEs en el aislado M2 fue similar al presentado en la cepa ATCC (P > 0.05), excepto el AE3 que en concentraciones de 200 µg/ml fue siete veces más activo en la cepa M2 (Cuadro 3). La actividad similar de los AEs en las cepas evaluadas evidencia la conservación de las características de susceptibilidad del hongo, a pesar de la adaptación de los aislamientos en condiciones de laboratorio. Por otra parte, la fuerte actividad del AE de L. origanoides sobre la germinación de las esporas de M. roreri posiblemente está relacionada con el efecto del timol como componente mayoritario de este AE. Estudios previos demostraron que este componente afecta principalmente la pared celular de las conidias impidiendo su germinación y crecimiento (Svircev et al., 2007).
Todos los AEs incluidos en el estudio inhibieron 100% el crecimiento del hongo, cuando fueron utilizados en concentraciones de 800 y 1000 µg/ml, exceptuando el AE4 que en las mismas concentraciones inhibió 53.43 y 76.47% del hongo, respectivamente. De forma similar al efecto mostrado en la inhibición de la germinación, los AEs obtenidos de L. origanoides (AE2 y AE3) en concentraciones de 200 µg/ml fueron los más activos e inhibieron 100% del crecimiento micelial (Cuadro 3). Se encontraron diferencias (P < 0.05) en la capacidad inhibitoria de los AEs entre las cepas M2 y ATCC, siendo los AE1, AE2 y AE3 más activos para el aislado M2 que para la cepa ATCC (Cuadro 3). Cuando se aplicaron concentraciones menores que 25 y 50 µg/ml, la inhibición del crecimiento de la cepa ATCC sólo fue de 20% (Figura 2); para el aislado M2 no se evaluaron concentraciones menores que 200 µg/ml de AE.
La AmB en concentración de 200 µg/ml presentó un nivel de inhibición de 100% en la germinación y el crecimiento micelial tanto del aislado como de la cepa de referencia. La actividad inhibitoria de este producto ha sido ampliamente demostrada para hongos que afectan humanos o plantas (Mesa-Arango et al., 2009).
Los componentes principales de los AE utilizados en este trabajo aparecen en el Cuadro 2. Los aceites más activos (AE2 y AE3) de L. origanoides muestran una composición química similar, aunque en porcentajes diferentes, así, timol, carvacrol y p-cimeno están en proporción de 54.5, 1.7 y 10.0% en el AE2 y de 43.8, 17.3 y 12.1% en el AE3. Estos componentes se encuentran puros o como constituyentes principales en AE obtenidos de plantas como Origanum vulgare, Thymus vulgaris, Thymbra spicata, Satureja thymbra, Salvia fruticosa, Lavandula sp., Mentha piperita y han mostrado previamente actividad contra hongos fitopatógenos (Muller-Riebau et al., 1995; Zambonelli et al., 1996; Lee, 2007). El timol ha sido utilizado en forma de vapores sobre frutos infectados por Monilinia fructicola para reducir la viabilidad de las esporas alterando la membrana celular, así como la formación de tubos germinales y apresorios estructuras indispensables para el inicio de la infección en los tejidos vegetales (Svircev et al., 2007).
]]> En este trabajo los AE4 y AE5 de L. alba, compuestos principalmente por carvona y limoneno, aunque también inhibieron la germinación y el crecimiento del hongo, fueron menos activos. El AE de L. scaberrima, compuesto también principalmente por carvona y linomeno, han mostrado actividad contra hongos fitopatógenos cuando se usan en concentraciones de 2000 mg/ml (Regnier et al., 2010).
Se agradece el apoyo logístico de los doctores Fabio Aranzazu y Darwin Martínez del Departamento de Investigación de la Federación Nacional de Cacaoteros, Fedecacao. El presente trabajo fue financiado por la Vicerrectoría de Investigación y Extensión de la Universidad Industrial de Santander (Proyecto Código 5648) y el Centro Nacional de Investigaciones para la Agroindustrialización de Especies Vegetales Aromáticas Medicinales Tropicales (Cenivam), Contrato RC-245-2011 Colciencias (Patrimonio Autónomo del Fondo Nacional de Financiamiento para la Ciencia, la Tecnología y la Innovación, Francisco José de Caldas).
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