1Maestría en Bosques y Conservación Ambiental, Universidad Nacional de Colombia sede Medellín. 2Departamento de Ciencias Biológicas, Facultad de Ciencias Agropecuarias, Universidad Nacional de Colombia sede Palmira. 3Departamento de Ciencias Forestales, Facultad de Ciencias Agrarias, Universidad Nacional de Colombia sede Medellín.
*Autor para correspondencia: fiorela.oc@gmail.com
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Rec.: 01.12.11 Acept.: 10.09.12
Los endófitos son microorganismos que crecen dentro de los tejidos vegetales sin causar síntomas de enfermedad. Aquellos asociados a las raíces tienen, entre otros posibles beneficios la defensa contra patógenos y un aumento en la disponibilidad de nutrientes. En el presente estudio se aislaron hongos endófitos de raíces de orquídeas del género Vanilla en estado silvestre, con el fin de determinar su efecto sobre el crecimiento de plantas de V. planifolia cuando se inocularon en el sustrato. Los resultados mostraron que variables como biomasa aérea, longitud de raíces y altura de la planta son afectadas por la inoculación de estos endófitos. La efectividad de estos hongos sobre la protección de plantas o la estimulación en el crecimiento contribuye a la generación de herramientas para el uso de bioinoculantes. De esta forma se reduce el uso de insumos químicos y se promueven prácticas amigables con el ambiente en sistemas de cultivo de vainilla.
Palabras clave: Ceratobasidium, crecimiento, hongos endófitos, inóculo, Vanilla planifolia, Xylaria.
Endophytes are microorganisms that grow inside plant tissues without causing symptoms of disease. Those roots are associated with, among others, potential benefits in the defense against pathogens and increased nutrient availability. In the present study, endophytes from roots of orchids of the genus Vanilla in wild state were isolated, in order to determine their effect on plant growth of V. planifolia when inoculated into the substrate. The results showed that variables such as biomass, root length and height of the plant are affected by the inoculation of these endophytes. The effectiveness of these fungi on the plant protection or growth stimulation contributes to the generation of tools for the use of bio-inoculants. This will reduce the use of chemical inputs and promote environmentally friendly practices in farming systems of vanilla.
Key words: Ceratobasidium, fungal endophytes, growth, inoculum, Vanilla planifolia, Xylaria.
]]> Introducción
La literatura sobre hongos endófitos y hongos formadores de micorrizas en orquídeas se encuentra muy ligada entre sí y a veces es imposible discutir estas asociaciones por separado. Los hongos endófitos son microorganismos que crecen dentro de los tejidos vegetales sin causar síntomas de enfermedad y, recientemente, han empezado a ganar reconocimiento (Bayman y Otero, 2006; Brundrett, 2006; Stone et al., 2000). La asociación endofítica describe dónde vive un microorganismo (Brundrett, 2006; Stone et al., 2000), sin asumir o excluir la posibilidad de beneficio para ambas partes. Por el contrario, el concepto de micorrizas es funcional y describe una relación comúnmente mutualista (Smith y Read, 1997; Rasmussen, 2002; Cameron et al., 2006, 2007).
Estudios recientes (Bayman y Otero 2006; Chen et al., 2011, 2012; Singh et al., 2011; Xing et al., 2011) demostraron la gran diversidad de hongos endófitos no formadores de micorriza asociados con las raíces y partes aéreas de orquídeas. Estos estudios resaltan el papel que cumplen estos microorganismos en la protección de la planta frente a ataques de patógenos, ya sea por la síntesis de metabolitos secundarios o por el mejoramiento en la nutrición a través de la disponibilidad de los nutrientes (Schulz, 2006). Igualmente mencionan, no sólo los beneficios generados para las plantas, sino también el potencial que poseen estos organismos endófitos y su batería de enzimas y metabolitos secundarios, por ejemplo, en la industria de los combustibles (Singh et al., 2011) y como antibióticos (Xing et al., 2011).
No obstante, estas investigaciones dejan al descubierto la carencia de conocimiento en las implicaciones que tienen estas asociaciones y ponen en discusión la necesidad de conocer más a fondo estas interacciones y la importancia del papel que cumple en la fisiología tanto de la planta hospedera como del endófito (Bayman et al., 1997) y su significancia funcional. Por tanto un mejor entendimiento de las funciones de estos organismos en la naturaleza puede conducir a desarrollar tecnologías para aspectos como conservación de especies, cultivos competitivos y métodos amigables con el ambiente (Yuan et al., 2009). Bayman et al. (2011) y Schulz y Boyle (2006) proponen la posibilidad de que las micorrizas y los hongos endófitos puedan proteger las plantas hospedantes contra el ataque de patógenos o la generación de algún tipo de resistencia a factores generadores de estrés.
Algunas especies del género Vanilla tienen importancia económica siendo la segunda especia más costosa, después del azafrán, y el aromatizante más utilizado en la industria alimenticia (Havkin-Frenkel et al., 2011; Bucellato, 2011). En Colombia se ha registrado la presencia de V. planifolia Andrews, especie de alta importancia económica en varios departamentos del país como Antioquia, Chocó, Valle del Cauca y Bolívar (Ledezma et al., 2006; Misas, 2005; Ordóñez et al., 2012); sin embargo, existe muy poco conocimiento sobre los requerimientos nutricionales y asociaciones que presenta esta especie con microorganismos endófitos. Por esta razón, en este estudio se plantearon como objetivos determinar las asociaciones de hongos endófitos presentes en Vanilla sp. y estudiar el potencial de estos en el crecimiento de plántulas de V. planifolia en condiciones de invernadero basados en la inoculación de hongos aislados de otras orquídeas y de vainilla silvestre.
Las plantas de Vanilla sp. para el aislamiento de los hongos endófitos fueron recolectadas en la Costa Atlántica en sectores del golfo de Morrosquillo y Montes de María (Sucre), estribaciones de la Sierra Nevada de Santa Marta (Magdalena), San Pedro de Urabá; San Luis; San Jerónimo y Porce (Antioquia); Yopal (Casanare); Serranía de la Macarena (Caquetá); Buenaventura y alrededores (Valle del Cauca) (Cuadro 1). En cada sitio se seleccionaron por lo menos tres plantas de vainilla con buen desarrollo, que no mostraban enfermedades ni síntomas visuales de deficiencias nutritivas. De cada una de ellas se tomaron muestras de raíces de aproximadamente 20 cm de longitud colocadas en 10 g de suelo adyacente a la raíz. Las raíces fueron descubiertas tratando de evitar su alteración, cortadas con tijeras podadoras, empacadas en bolsas plásticas de cierre hermético, debidamente marcadas y trasladadas rápidamente a laboratorio en neveras de icopor, donde fueron lavadas con agua corriente, luego desinfectadas superficialmente con etanol a 70% por 1 min con hipoclorito de sodio a 3% por 30 s y, finalmente, enjuagadas tres veces con agua destilada estéril (Otero et al., 2002). Para la siembra se realizaron cortes de 2 mm, aproximadamente, con cuchillas quirúrgicas estériles. En cajas de Petri se sembraron por triplicado ocho fragmentos de raíces. El medio que se utilizó para el aislamiento fue agar papa dextrosa (PDA), suplementado con 50 ug/ml de penicilina y sulfato de estreptomicina antes de incubarlas a 28 °C en oscuridad durante ocho días.
Elaboración de inóculos
A partir de las cajas de Petri, donde previamente se aislaron los hongos endófitos, se tomó un trozo de 0.5 x 0.5 cm de inóculo y se llevó a un Erlenmeyer que contenía medio de cultivo papa-dextrosa líquido. Luego se colocó en un agitador a 120 r.p.m. a temperatura ambiente en oscuridad. Después de ocho días de crecimiento, el hongo fue licuado hasta obtener partículas finas con una licuadora casera previamente desinfectada con alcohol al 70% por 1 hora e hipoclorito de sodio al 4% por 30 min. Se obtuvieron 250 ml de licuado y se completó el volumen hasta 600 ml en un recipiente de plástico.
Para el proceso de inoculación, se tomaron por matera un total 500 cm3 de madera (chips) y vermicompost en relación 1:1, que fueron trasferidos a un recipiente y sometidos a autoclave a 15 psi con una temperatura de 120 °C por 60 min. Estas materas posteriormente fueron llenadas con 500 cm3 del sustrato y se agregó 20 ml del inóculo sobre la parte superior. Finalmente, las materas fueron cubiertas con papel periódico estéril y dejadas a temperatura ambiente por siete días hasta que el hongo creciera en este sustrato.
Aplicación de inóculo en las plantas
Las plantas de V. planifolia fueron obtenidas a partir de esquejes en el vivero ubicado en San Pedro de Urabá (Antioquia) y propiedad de la empresa Bioandes C.I Ltda. Cada planta se escogió por lo menos con siete entrenudos (20 cm de longitud total aproximadamente), que fueron desinfectadas previamente de hongos patógenos y no patógenos preexistentes en la raíz y en la parte aérea. Este procedimiento se realizó mediante la fumigación de la parte aérea con el fungicida Antracol® 2% (Propined 700g/Kg) y Mertec® 1% (Tiabendazol 500g/l) una vez por semana durante 3 semanas.
Después de ocho días de la aplicación del inóculo el hongo ya había crecido, por tanto en cada matera se sembró un esqueje de planta colocando por lo menos un entrenudo dentro del sustrato. Las plantas fueron amarradas con cuerdas de fique al tutor artificial que consistió en trozos de madera de 70 x 4 x 1 cm. Finalmente, las materas fueron cubiertas con cuarzo picado hasta obtener una capa protectora contra la entrada de insectos y otros agentes. El proceso de inoculación se repitió dos veces: al comienzo del montaje y después de 45 días.
Se usaron seis hongos forma-género Rhizoctonia procedentes de plantas de orquídeas del Valle del Cauca, obtenidas por Valadares (Valadares, 2009): P-17, P-18, P-19 y P-20 de Psigmorchis pusida y I-1, I-2 de Ionopsis utricularoides; 12 hongos endófitos aislados de este estudio a partir de plantas de Vanilla spp. silvestre y un control donde el suelo era estéril pero sin inoculación (Cuadro 2). El ensayo se estableció en el invernadero bajo techo sombra de la empresa Bioandes C.I Ltda. en el municipio de Sopetrán (Antioquia) con una temperatura aproximada de 25 °C y una luminosidad relativa de 9% - 11%.
Biomasa y crecimiento
Para medir la biomasa y el crecimiento total, se cosecharon cuatro plantas de seis meses de edad por cada tratamiento. La biomasa –masa aérea total (MA -g) y masa de raíces terrestre (MR -g)– se obtuvo mediante el pesaje del material vegetal secado en horno a 60 °C por cuatro días. La longitud de raíces (LR -cm) se determinó midiendo la raíz principal y todas la raíces secundarias y terciarias. Para determinar el área foliar (AF -cm2) se utilizó el medidor portátil LI-3000C, y para la altura total (AL -cm) se midió la longitud de la planta en el momento de la cosecha, desde la base hasta el ápice de crecimiento.
]]> Diseño experimentalLos tratamientos se dispusieron en un arreglo completamente al azar con cuatro repeticiones. Las variables dependientes fueron evaluadas para el cumplimiento de los supuestos (Hoshmand, 2006) y los análisis fueron realizados con el programa SAS 9.2 para Windows.
La información recopilada sobre los puntos de distribución de la Vanilla sp. silvestre en Colombia permitió identificar y visitar nueve sitios distribuidos en varios departamentos (Cuadro 2). Las raíces de las plantas recolectadas correspondieron a individuos silvestres que no presentaban señales visibles de enfermedad.
Mediante la secuenciación de las regiones ITS (datos no mostrados), realizada bajo los protocolos del Laboratorio de Biología Celular y Molecular de la Universidad Nacional sede Medellín, fue posible identificar los hongos inoculados que correspondieron a géneros típicos endófitos de orquídeas y otras plantas (Foto 1). No fue posible la identificación de los aislados V-10 y V-13 por contaminaciones repetidas en el ADN.
En el Cuadro 3 se observan los valores netos para cada una de las variables de biomasa. Después de validar los supuestos, los resultados indicaron la existencia de diferencias significativas, así: para las variables altura de la planta (P = 0.0002), longitud de raíces (P = 0.0213), masa de raíces (P = 0.0173) y masa aérea (P = 0.0431); mientras que para la variable área foliar no se presentaron diferencias (P = 0.1148).
Además de los hongos formadores de micorriza, el grupo de hongos endófitos asociados a todos los órganos de las plantas ha ganado gran interés debido a sus múltiples funciones ecológicas (Brundrett 2006; Yuan et al., 2009; Bayman y Otero, 2006). No obstante, la mayoría de los estudios se ha centrado más en la identificación de estos hongos que en sus posibles efectos sobre la nutrición de las orquídeas, la defensa contra patógenos, o los procesos adaptativos a factores generadores de estrés (Gamboa-Gaitán, 2006; Ordóñez, 2012).
]]> Los hongos utilizados en este experimento (I-1, I-2, P-17, P-18, P-19 y P-20), obtenidos de Valadares (2009), pertenecen al grupo Ceratobasidium de la forma-género Rhizoctonia considerados como endófitos formadores de micorriza en orquídeas en Australia (Warcup y Talbot, 1967; Otero et al., 2011), Escocia (Warcup y Talbot, 1967) Puerto Rico (Otero et al., 2002, 2004, 2007; Porras-Alfaro y Bayman, 2007), y Colombia (Mosquera-Espinosa, 2010). El aislamiento P-18, proporcionado por Valadares (2009), tuvo un efecto significativo en la variable longitud de planta; en contraste, el resto de los aislados no resultaron sobresalientes en las demás variables de biomasa. Esto indica que posiblemente para el resto de los hongos el aporte de nutrientes no es suficiente para aumentar las tasas de crecimiento o que para estas etapas de edad de la planta la asociación no es fundamental, como sí lo es en la germinación de semillas, y es facultativa para etapas donde ya la planta es fotosintéticamente activa (Porras-Alfaro & Bayman 2007).En variables de biomasa como longitud de planta y de raíces, y masa de raíces, los mejores tratamientos fueron V-13, V-11 y V-9, los dos últimos miembros de la familia Xylariaceae. Este grupo fue identificado por Bayman et al. (1997); Chen et al. (2011, 2012); Xing et al. (2011); y Yuan et al. (2009) como endófito en orquídeas y aislado principalmente de hojas y raíces. Esta familia se caracteriza por poseer organismos comúnmente saprófitos y endófitos de orquídeas como Lephantes, Dendrobium, Sobralia, Maxillaria, Psychilis y Epidendrum (Bayman y Otero, 2006) al igual que de otras plantas como en Guarea guidonia Meliaceae (Gamboa-Gaitán y Bayman 2001), entre otras, (Davis et al., 2003). Igualmente son habitantes comunes de la madera y de sustratos en descomposición (Whalley, 1996). Estudios in vitro demostraron que tanto Xylaria como especies del género Hypoxilon son capaces de producir enzimas como calasas, celulasas, celulobiohidrolasas y celulo-deshidrogenasas, involucradas en la degradación de celulosa y lignina, principales componentes de sustratos usado en el cultivo de orquídeas (Whalley 1996; Pointing et al., 2003). De esta forma, la degradación de materiales leñosos como chips de madera y hojarasca, sustratos en los que crece la vainilla, contribuye a la solubilización y disponibilidad de nutrientes para la planta, mejorando la nutrición de los medios de crecimiento.
Son escasos los estudios en los que se muestra que especies de la familia Xylariaceae puedan proporcionar beneficios al vivir como endófitos. La aplicación de inóculos con endófitos del género Xylaria reduce de manera efectiva los daños causados por patógenos en Theobroma cacao (Yuan et al., 2009). Los estudios de Davis et al. (2003) muestran y caracterizan metabolitos secundarios que incluyen antimicóticos y antibióticos controladores de patógenos de plantas y humanos. Whalley y Edward (1998) caracterizaron como metabolitos principales los siguientes: dihidroisocumarinas y derivados, ácido succínico y derivados, alcoholes sesquiterpenos, butirolactonas, citocalasinas, derivados del naftaleno y ácidos grasos de cadenas largas.
Los grupos Phomopsis (V-3, V-6, y V-14), Bipolaris (V-16), Phoma sp. (V-12) y Trichoderma (V-15) no presentaron comportamiento sobresaliente en las variables evaluadas y corresponden a endófitos anteriormente reportados para orquídeas en los géneros Dendrobium (Chen et al., 2012), Stelis, Lepanthes, Maxillaria, Epidendrum (Bayman y Otero, 2006) y Odontoglossum (Singh et al., 2011).
No obstante los hallazgos sobre la posibilidad de algunos hongos inoculados como potenciales patógenos, las plántulas de vainilla en este experimento no presentaron sintomatología de daños en sus órganos (raíces, tallo u hojas), probablemente porque en este caso los hongos inoculados funcionaron como agentes de descomposición del sustrato utilizado, chips de madera y vermicompost, típico en sitios donde se encuentran las raíces de vanilla. Así mismo, la inoculación de organismos de este grupo pueden no sólo favorecer a la planta en la disponibilidad de nutrientes en el sustrato sino también en la secreción de enzimas o metabolitos secundario que puedan evitar o biocontrolar patógenos (Ordóñez, 2012).
Mosquera-Espinosa (2010) demostraron por primera vez el uso de aislamientos de Rhizoctonia binucleada (Ceratobasidium) obtenidos a partir de orquídeas como un posible biocontrolador de R. solani, patógeno de arroz, y otros patógenos como Fusarium spp., Phytophthora spp. y Pythium sp., alternativa promisoria en estrategias de biocontrol dentro de un programa de manejo integrado.
Por otra parte, los hongos endófitos pueden funcionar como agentes patógenos latentes durante largos periodos y constituir interacciones asintomáticas, por lo que los micro-organismos en tal situación se pueden considerar como endófitos temporales, tal como se ha observado en otras plantas (Schulz y Boyle, 2006; Gamboa-Gaitán, 2006). Sin embargo, por mutación, un cambio en el ambiente, el estado nutricional o la edad de la planta, un endófito latente puede convertirse en patógeno o viceversa (Ovando et al., 2005; Lana et al., 2011). Por esta razón, es importante reconocer los efectos fisiológicos de los hongos endófitos sobre las plantas y el potencial que puedan tener estos microorganismos en la protección o mejoramiento en la nutrición de las plantas.
Al Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural y la Universidad Nacional de Colombia por el apoyo financiero para la elaboración de este estudio a través del proyecto: Programa Cultivo e Industrialización de la Vainilla en Colombia 2008-2011. A la empresa Bioandes C.I Ltda. por el alquiler de sus instalaciones, personalmente a Rafael Valadares por el sumistro de los hongos, a los pares evaluadores y especialmente a todo el equipo del proyecto vainilla.
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