Agronomía

Propagación in vitro de semillas de la orquídea Comparettia falcata Poepp. & Endl. (Orchidaceae) mediante técnicas simbióticas y asimbióticas

In vitro propagation of Comparettia falcata Poepp. & Endl. (Orchidaceae) seeds using symbiotic and asymbiotic techniques

Héctor Karol Chávez¹, Ana Teresa Mosquera-Espinosa^1,2, Joel Túpac Otero Ospina^1,3,4

¹1Grupo de investigación en Orquídeas, Ecología y Sistemática Vegetal. ²Programa de Ingeniería Agronómica, Universidad Pedagógica y Tecnológica de Colombia. ³Departamento de Ciencias Biológicas, Universidad Nacional de Colombia, Sede Palmira. ⁴Instituto de Estudios Ambientales IDEA Palmira, Universidad Nacional de Colombia, Sede Palmira. Autor para correspondencia: jtoteroo@unal.edu.co

Rec.: 01.09.2014 Acep.: 13.09.2014

Resumen

Para su germinación, las orquídeas dependen de hongos micorrízicos y muchas de las características únicas de estas plantas están asociadas con el hongo que las coloniza. En este trabajo se evaluó la germinación de semillas de la orquídea Comparettia falcata en condiciones de laboratorio utilizando los métodos simbióticos: dos hongos micorrízicos de orquídeas de diferentes especies y un aislamiento patogénico de Rhizoctonia solani obtenido de arroz, y los asimbioticos: formulación de Knudson C y MS (Murashie & Skood). Se encontraron diferencias (P < 0.05) entre tratamientos, resultando mejor el método asimbiótico con la formulación Knudson C y el simbiótico con R. solani, patógeno de arroz. Además, se observó que los tratamientos donde se implementó la metodología simbiótica tuvieron menor porcentaje de contaminación por microorganismos que los tratamientos de tipo asimbiótico.

Abstract

Orchids depend on mycorrhizal fungi for seed germination and many unique characteristic of orchids are related to this interaction. In this paper, the seed germination of Comparettia falcate (Orchidaceae) was evaluated using both symbiotic (with two mycorrhizal fungi isolated from orchids and a Rhizoctonia solani strain isolated from rice) and asymbiotic techniques (with two growing media Knudson C and MS - Murashie & Skood) in laboratory conditions. There were significant differences among treatments. The best treatments for C. falcata seed germination was the asymbiotic method with Knudson C media and the symbiotic method with the rice pathogenic R. solani. Additionally, the symbiotic treatments had lower contamination than asymbiotic ones.

Key words:Ceratobasidium, Colombia, germination, Orchidaceae, orchid conservation, orchid mycorrhiza, symbiosis.

Introducción

La familia botánica Orchidaceae (orquídeas) es una de las que mayor número de especies posee en el reino vegetal, con cerca de 27,135 en todo el mundo y 900 géneros (Zotz, 2013), sin contar que día tras día se encuentran nuevas especies e híbridos naturales. Las orquídeas son plantas extremadamente diversificadas predominantes en las regiones de climas tropicales y subtropicales, en zonas localizadas entre 300 y 4500 m.s.n.m. (Calderón- Sáenz, 2007). Estas plantas producen flores que pueden tardar largo tiempo para desarrollarse, además, sus semillas son muy pequeñas y poseen escasa reserva de nutrientes para germinar (Arditti y Ghani, 2000). Por esta razón, en condiciones naturales requieren una relación simbiótica con hongos que cumplen una actividad micorrízica, proporcionando a las plantas jóvenes azúcares y nutrientes necesarios para desarrollarse y crecer lo suficiente para fabricar sus propios nutrientes (Rasmussen, 1995, 2002).

Las orquídeas dependen de hongos micorrízicos para germinar y muchas de las características únicas que las distinguen están asociadas con el hongo que las coloniza (Otero et al., 2002, 2004). Según Bayman y Otero (2006) y Otero et al. (2005, 2007) las relaciones micorrízicas pueden ser formadas por selección natural, afectar la distribución de las orquídeas e inclusive determinar la diversificación de las orquídeas.

En un comienzo, se consideró que las orquídeas obtenían hidratos de carbono sólo a partir de hongos (Hadley, 1982), pero se ha comprobado que también reciben aminoácidos y nutrientes minerales (Hyner y Arditti, 1973). Knudson (1922) demostró que en ausencia de hongos era posible la germinación de semillas de orquídeas en un medio simple, rico en minerales y azúcares. Este investigador además encontró que las semillas de algunos géneros, entre las que se encuentran Cattleya y Epidendrum, germinaban en forma asimbiótica en condiciones in vitro; no obstante se estimó que no siempre es posible desarrollar un medio de cultivo en el cual una determinada orquídea pueda germinar y desarrollarse (Arditti, 1982). La gran diversidad de orquídeas probablemente significa una fuerte diversidad de requerimientos para la germinación de cada especie; de hecho, se han desarrollado varios medios nutritivos para diferentes géneros y especies de orquídeas (Arditti 1967, 1982; Arditti y Ernest, 1993).

La interacción micorrízica-orquídeas es un tema de estudio en el ámbito mundial (Clements, 1987). Algunos autores afirman que en este sentido existen orquídeas generalistas (Curtis, 1939; Hadley, 1970; Masuhara et al., 1993) y otros, argumentan que son específicas (Clements, 1988; McKendrick et al., 2002). No obstante, algunos estudios como los de Taylor y Bruns (1997) demostraron que algunas orquídeas, generalmente las epifitas, son específicas en su interacción micorrízica. La especificidad del hongo micorrízico en orquídeas epifitas tropicales puede ser variable (Otero et al., 2002; 2004; 2007). En el caso de Epidendrum nocturnum Jacq., una orquídea epifita, se encontró que puede germinar con un hongo aislado de otra orquídea (Zettler et al., 2007) y que la especificidad de los hongos micorrízicos varía entre especies de orquídeas epifitas (Otero et al., 2002, 2004). Otero et al. (2002) aislaron un único clado fúngico (clado B) de varias especies de orquídeas; pero debido al tamaño de la familia, es posible la ocurrencia de un amplio espectro de especificidad (Clements, 1988).

Hasta el presente, la sistemática de hongos micorrízicos de orquídeas es pobremente entendida (Otero et al., 2002). La mayoría de estos se encuentran clasificados dentro del género-forma Rhizoctonia, siendo un grupo artificial muy diverso (Harley y Smith, 1983; Vilgalys y Cubeta, 1994; Cubeta y Vilgalys, 1997). La taxonomía del hongo está basada en la morfología de estructuras sexuales (teleomorfo), pero es difícil inducir a estos hongos para que produzcan tales estructuras en el laboratorio.

La determinación del nivel de especificidad micorrízica es un factor que debe ser tenido en cuenta para la conservación de orquídeas mediante la germinación simbiótica de las semillas (Otero et al., 2013). Una especie de orquídea es considerada específica cuando interactúa de forma estrecha con un grupo de hongos filogenéticamente emparentados; por el contrario, se le considera generalista cuando sus hongos micorrízicos incluyen una gran variedad de orígenes filogenéticos. En orquídeas existe un gradiente de niveles de especificidad y las diferentes especies varían dentro de estos niveles (Taylor et al., 2003; Otero et al., 2002, 2004; Otero y Bayman, 2009). En este caso es importante diferenciar entre especificidad ecológica (in situ) y especificidad potencial (in vitro) (Masuhara y Katsuya, 1994; Rasmussen, 2002).

La especie Comparettia falcata Poepp. & Endl., es una orquídea epifita, caracterizada por un ciclo de vida muy corto y flores de tamaño mediano polinizadas por colibríes (Pedroza-Manrique et al., 2005). La especie es cultivada por floricultores aficionados y también es un componente en algunos ecosistemas. En el presente estudio se evaluó la germinación de semillas de C. falcata en condiciones simbióticas con dos aislados del género-forma de Rhizoctonia sacados de raíces de orquídeas y un aislado patogénico de R. solani obtenido de arroz; igualmente se evaluó la germinación asimbiótica utilizando medios de cultivos artificiales comerciales. Como el conocimiento sobre micorrizas de C. falcata es escaso, con base en resultados previos obtenidos en investigaciones con orquídeas epifitas se plantea la hipótesis de que las semillas germinarían mejor al usar métodos asimbióticos que simbióticos (Otero y Bayman, 2009).

Materiales y métodos

Especie de orquídea. Comparettia falcata es una orquídea epifita de ramita, perenne, perteneciente a la subtribu Oncidinae y polinizada por colibríes (Ackerman et al., 1994; Rodríguez-Robles et al., 1992). Se encuentra distribuida en las Antillas mayores, México, Centroamérica y Suramérica tropical. Frecuentemente se halla asociada con árboles de guayabo (Psidium guajava L.) y otros árboles frutales. Económicamente tiene mucho potencial como planta ornamental, sus flores rojizas son llamativas, aunque relativamente pequeñas (Ackerman et al., 1994).

Recolección y procesamiento de semillas. Las semillas de C. falcata fueron obtenidas a partir de cápsulas maduras, recolectadas en el departamento del Cauca, corregimiento de Pescador (2° 47' 32'' N, 76° 32' 51'' O), con temperatura, promedio anual de 19ºC, a 1900 m.s.n.m. Una vez recolectadas las cápsulas fueron tratadas con etanol a 70% y almacenadas en bolsas plásticas con sílica-gel para su traslado al Laboratorio de Cultivo de Tejidos Vegetales de la Universidad Nacional de Colombia sede Palmira. Los frutos fueron esterilizados en condiciones asépticas según la metodología propuesta por Otero (2004), en la cual, antes de la dehiscencia de la cápsula, esta se desinfecta con hipoclorito de sodio al 1% por 10 min, luego se enjuaga con agua destilada estéril y posteriormente se sumerge en alcohol a 70% durante 5 min (Arditti, 1982); finalmente es flameada superficialmente.

A continuación, la cápsula fue colocada en una caja Petri con papel filtro en la base y con un bisturí se abrió longitudinalmente. El 80% de las semillas fueron extraídas con una pinza estéril de donde se tomó una submuestra para el análisis de viabilidad utilizando la prueba de tetrazolio. Una vez confirmada la viabilidad, las semillas seleccionadas fueron sumergidas en 10 ml de agua destilada estéril agitando lentamente para lograr su dispersión.

Para la inoculación uniforme sobre los medios de cultivo evaluados, se tomaron alícuotas de 100 µl con una pipeta de precisión y se colocaron sobre las cajas Petri correspondientes a los tratamientos. La dispersión de las semillas sobre los medios se hizo siguiendo la metodología propuesta por Arditti (1982), antes de colocarlos en sala de incubación con ciclos de 12 h y luz artificial, a 23 ± 2 ºC. De la misma solución que contenía semillas se tomaron 10 alícuotas de 100 µl sobre porta-objetos para determinar al estereoscopio el promedio correspondiendo a 110 ± 10 semillas por alícuota.

Viabilidad de las semillas. Para esta prueba, en una solución de tetrazolio contenida en un tubo Eppendorf se colocó una pequeña muestra de semillas de cada cápsula. Cuando la muestra se expuso a condiciones de oscuridad y durante 12 h el tejido embrionario tomó tonalidad rojiza indicando su viabilidad (Vujanovic et al., 2000). Para esta prueba, de una misma planta de orquídea se tomaron dos cápsulas maduras con semillas.

Evaluación de hongos en la prueba de germinación simbiótica. Los tres aislamientos de hongos evaluados en este estudio pertenecían al género-forma Rhizoctonia y fueron obtenidos de estudios previos (Mosquera- Espinosa, 2010) y conservados en el Cepario de Hongos Micorrízicos de Orquídeas del Grupo de Investigación en Orquídeas, Ecología y Sistemática Vegetal en la Pontifica Universidad Javeriana sede Cali, Colombia, (Mosquera et al., 2010, 2013a, 2013b). Se utilizaron los aislamientos: Q1.1M16 (teleomorfo: Ceratobasidium) obtenido de raíces de la orquídea litofítica Epidendrum melinanthum Schltr. en el municipio de Palmira; Q1M19 (teleomorfo: Ceratobasidium) obtenido de raíces de la orquídea epifita Maxillaria sp. en el municipio de Felidia; y Rhizoctonia solani patógeno de arroz obtenido del cepario del Programa de Patología en Arroz del CIAT-Palmira, Colombia. (Foto 1).

En este ensayo se aplicaron dos tratamientos control sin inóculo de aislamientos de Rhizoctonia: (1) se utilizó el mismo medio para inocular sólo la semilla (Control 2); y (2) semillas y fungicida (Benomyl, 35 ppm) para inhibir el posible crecimiento de hongos contaminantes (Control 3). Ocho días después de la inoculación de los aislamientos de Rhizoctonia y cuando el micelio cubrió 2/3 de la caja Petri, se sembraron las semillas de orquídeas suspendidas en agua destilada estéril, tomando alícuotas de 100 µl. Los ensayos se montaron siguiendo normas de asepsia bajo cámara de flujo laminar. Se realizaron ocho repeticiones por cada tratamiento, con un diseño experimental completamente al azar donde cada caja Petri correspondió a una unidad de muestreo independiente. Las cajas Petri se mantuvieron en sala de incubación con 12 h luz natural a 23 ± 2 ºC durante 60 días.

Germinación asimbiótica. Para evaluar la germinación asimbiótica de las semillas de C. falcata se prepararon los medios nutritivos: (1) Knudson C. modificado (KC.m) (Arditti, 1992) y (2) Murashie & Skood (MS) (Arditti, 1992) versión comercial enriquecidos con Gelrite, sucrosa. Los reactivos y suplementos utilizados fueron definidos con base en los estudios de Arditti (1992).

Las evaluaciones de la germinación simbiótica y asimbiótica de las semillas se realizaron a los 25 días, considerando la presencia de germinación cuando se observó hinchamiento del embrión acompañado de coloración verde del tejido. Se contó el total de semillas dispuestas en cada caja Petri y se identificaron y cuantificaron aquellas que presentaban germinación. Para estos tratamientos se utilizaron 50 ppm de antibióticos (Otero et al., 2002) a razón de 10 a 50 mg/l (Arditti, 1992). Los antibióticos empleados fueron paquetes de tres discos de penicilina G y tetraciclina de la empresa Oxoid Ltda, que fueron adicionados en la solución de semillas para dispensar 250 ml de medio. El control 1 consistió en medio enriquecido con Gel rite, sucrosa, BAP, ANA y antibiótico.

Las observaciones se hicieron durante diez semanas para determinar el desarrollo de los embriones de la semilla de la orquídea sembrada en los diferentes tratamientos, además de la colonización de los hongos donde fueron inoculados. Al momento de las observaciones se tomaron dos muestras aleatorias de los tratamientos simbióticos y se llevaron a microscopio con aumento 4X para observar el desarrollo embrionario, la colonización y la posible penetración del hongo en las semillas de la orquídea. En la semana diez las cajas Petri se colocaron en estereoscopio para determinar el porcentaje de germinación de las semillas y la posible presencia de microorganismos contaminantes en los diferentes tratamientos.

Prueba de contaminación. Para evaluar la incidencia de microorganismos contaminantes entre tratamientos simbióticos y asimbióticos, se compararon los porcentajes de placas afectadas de los tratamientos con antibiótico y sin él.

Análisis estadístico. Los datos fueron analizados estadísticamente con la prueba de Anova de una vía, utilizando las herramientas de análisis de datos de Excel 2007 (Microsoft). Las unidades experimentales correspondieron a las cajas Petri. Se incluyeron ocho tratamientos: dos asimbióticos (Knudson C y MS), tres simbióticos (Q1.1M16, Q1M19, y R. solani) y tres controles (Control 1, Control 2 y Control 3). Ya que la variable de respuesta correspondía al porcentaje de germinación de semillas y que las varianzas entre los tratamientos no eran homogéneas, se realizó la transformación de datos utilizando el arcoseno de la raíz cuadrada de la proporción de semillas germinadas (Zar, 1999). La proporción de unidades experimentales contaminadas se evaluó usando la prueba de Chi-cuadrado (Zar, 1999).

Resultados

En la prueba con tetrazolio se encontró que la viabilidad de las semillas varió entre 72.8% y 75.7%, lo cual garantizaba su uso para los ensayos de germinación. La germinación de semillas en medio Muraashie & Skoog (MS) fue de 56.6%, en medio Knudson C de 71.5% y en el medio control de 20.25% (Figura 1).

Se encontraron diferencias significativas en los porcentajes de germinación entre los tratamientos evaluados (F8, 63 = 102.03, P = 4.38E-33). En el tratamiento con R. solani se presentó el mayor porcentaje de germinación de las semillas (70.5%) seguido del tratamiento Q1M19 (Ceratobasidium de la epifita Maxillaria sp.) con 67.1% de germinación (Figura 1). Los tratamientos control presentaron valores similares de los porcentajes de germinación, 22.6% para el control 1 (medio enriquecido con Gel-rite, sucrosa, BAP, ANA y antibiótico) y 21.8% en Control 3 (Benomyl). (Figura 1).

Los niveles de contaminación se observaron a partir del cuarto día después de la siembra, siendo estos de 50% en los ensayos de germinación asimbiótica, en el tratamiento con medio Murashie & Skoog (MS) y de 25% en el medio Knudson C modificado (KC); mientras que en el control 1 se observó 25% de contaminación. Ni en el ensayo de germinación simbiótica ni en el control 3 (Benomyl) se observaron indicadores de microorganismos fungosos contaminantes; no así en el tratamiento control con medio de celulosa sin aislamientos de Rhizoctonia (control 2) que presentó una contaminación de 50% (X² = 6.40, P = 0.01).

Discusión

En el presente estudio se observó que uno de los mejores métodos para la germinación de semillas de C. falcata fue la metodología asimbiótica con el medio Knudson C. Sin embargo, este método presentó una mayor incidencia de microorganismos contaminantes que los demás tratamientos del método simbiótico. Además, el tratamiento con el aislamiento patogénico de R. solani proveniente de arroz indujo porcentajes de germinación en semillas de C. falcata comparables con el método asimbiótico Knudson C. Este resultado no era esperado, ya que la condición de patogenicidad del aislamiento de R. solani conlleva esperar baja germinación o deterioro del tejido de la semilla de la orquídea en estudio. No obstante, existen estudios donde se demuestra que aislamientos de Rhizoctonia patogénica han inducido germinación de las semillas de Dactylorchis purpur (Stephenson y Stephenson) Verm., una orquídeas terrestre de zonas templadas (Smith, 1966). Igualmente de especies de Vanilla y de Epidendrum melinanthum se ha aislado Thanatephorus, que es el género del teleomorfo de R. solani (Mosquera-Espinosa et al., 2013a; Porras y Bayman, 2007). Lo anterior puede ocurrir, aunque es poco frecuente, indicando la actividad de Rhizoctonia en cualquier expresión como micosimbionte. (Carling et al., 1999).

En relación con la presencia de microorganismos fungosos contaminantes, se observó que los tratamientos que incluyeron hongos simbióticos presentaron una menor proporción de dichos contaminantes, que aquellos tratamientos donde no se aplicaron. Por esta razón, se apoya la hipótesis de que la utilización de técnicas simbióticas disminuye significativamente la contaminación en los procedimientos de germinación de semillas de orquídeas, como ha sido propuesto en otros estudios sobre este tema (Otero y Bayman, 2009; Porras-Alfaro y Bayman, 2007). En experimentos de germinación simbiótica con Ionopsis utricularioides (Sw.) Lindl. (Otero et al. 2004, 2007) y Tolumnia variegata (Sw.) Braem (Otero et al., 2005) en Puerto Rico, los controles sin hongos simbióticos, mostraron mayor contaminación que los tratamientos con hongos simbióticos.

Este estudio sustenta la idea de que en caso de no conocer los hongos micorrízicos que inducen germinación de semilla sexual de especies de orquídeas, la germinación asimbiótica es una opción viable (Otero y Bayman, 2009). No obstante, dada la presencia de hongos que inducen dicha germinación, es preferible utilizar la metodología simbiótica ya que estos no solo contribuyen al proceso de germinación sino también a evitar la contaminación por microorganismos contaminantes.

Conclusión

La germinación asimbiótica con medios Knudson C induce altos niveles de germinación de semillas de Comparetia falcata. En el método simbiótico, las semillas también germinaron adecuadamente con Rhizoctonia solani, patógeno de arroz, y con una micorriza de la orquídea epifita Maxillaria sp., por tanto, algunos hongos reportados como patógenos de cultivos podrían ser evaluados y utilizados para la conservación de orquídeas.

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