Vigilancia molecular de aislamientos invasores de Streptococcus pneumoniae resistentes a la penicilina en niños colombianos menores de 5 años
Jaime Moreno, Vienvilay Phandanouvong, Elizabeth Castañeda
Grupo de Microbiología, Instituto Nacional de Salud, Bogotá, D.C., Colombia.
El incremento de aislamientos de Streptococcus pneumoniae resistentes a la penicilina se favorece por la presión selectiva del antibiótico y la dispersión clonal. Como parte del programa de vigilancia molecular, por medio del uso de la electroforesis en campo pulsado (PFGE), se determinaron las relaciones genéticas de 190 aislamientos invasores de S. pneumoniae con susceptibilidad disminuida a la penicilina recuperados de niños colombianos menores de 5 años durante los años 2000-2003. Se identificaron 42 diferentes patrones electroforéticos; cuatro patrones agruparon el 76% de los aislamientos, los cuales se encontraron relacionados con los clones internacionales 1-España 23F , 2-España 6B , 3-España 9V y 26-Colombia 23F . Nuestros resultados indican que la diseminación de S. pneumoniae resistente a la penicilina es el resultado de la dispersión de clones internacionales, especialmente, del clon 3-España 9V .
Palabras clave: Streptococcus pneumoniae, susceptibilidad disminuida a la penicilina, PFGE, clones, relaciones genéticas.
Molecular surveillance of invasive penicillin-resistant Streptococcus pneumoniae Colombian isolates recovered from children less than 5 years of age
The rapid increase of penicillin-resistant Streptococcus pneumoniae isolates could be a consequence of the spread of clones or due to the antimicrobial selective pressure. The genetic relatedness of 190 invasive isolates S. pneumoniae with reduced susceptibility to penicillin recovered from Colombian children less than 5 years old during a surveillance study from 2000 to 2003 was determined by the use of pulsed-field electrophoresis (PFGE). Overall, 42 different PFGE patterns were identified, but 4 of them included 76% of all isolates. They were related with international clones 1-Spain 23F , 2-Spain 6B , 3-Spain 9V and 26-Colombia 23F . Our results indicated that the dissemination of penicillin-resistant S. pneumoniae was the result of the spread of international clones, specially, the 3-Spain 9V clone.
Key words: Streptococcus pneumoniae, diminished susceptibility to penicillin, PFGE, clone, genetic relatedness
Streptococcus pneumoniae es una de las principales causas de morbilidad y mortalidad en el mundo que, asociado con el desarrollo de resistencia a los antibióticos, se constituye en uno de los principales problemas de salud pública (1).
]]> La implementación de programas de vigilancia en combinación con la aplicación de técnicas de tipificación molecular han permitido la identificación y el seguimiento de diversas líneas clonales de S. pneumoniae resistentes a la penicilina y a otros antibióticos, las cuales tienen amplia dispersión geográfica tanto regional como internacional (2-4).En Colombia, en 1994, a través del proyecto del Sistema Regional de Vacunas (SIREVA) de la Organización Panamericana de la Salud, se inició un proyecto regional para la vigilancia de la distribución de los tipos capsulares y de la susceptibilidad antimicrobiana de los aislamientos de S. pneumoniae, causantes de enfermedad invasora en niños menores de 5 años (5). Los estudios moleculares de los aislamientos invasores con susceptibilidad disminuida a la penicilina (SDP) demostraron la circulación en Colombia de los clones internacionales 1-España 23F , 2-España 6B , 3-España 9V y 26- Colombia 23F (6,7). El objetivo de este trabajo fue continuar la vigilancia molecular de los aislamientos invasores de S. pneumoniae con SDP recuperados de niños colombianos menores de 5 años procedentes de diferentes regiones del país durante los años de 2000 a 2003 para determinar los tipos clonales prevalentes y circulantes en esta población y relacionarlos con los serotipos, patrones de resistencia a los antibióticos y diagnóstico clínico.
Materiales y métodos
Aislamientos y características de los pacientes.
Se estudiaron 190 aislamientos invasores de S. pneumoniae con SDP recuperados de niños menores de 5 años, procedentes de diferentes regiones del país y remitidos al Grupo de Microbiología como parte de los programas de meningitis bacteriana (MBA) e infección respiratoria aguda (IRA) de enero de 2000 a diciembre de 2003.
Los aislamientos se obtuvieron de hemocultivos (53%), líquido cefalorraquídeo (35%), líquido pleural (6%) y de otros líquidos corporales (6%). El 44% de los pacientes tenía diagnóstico de neumonía, 39% de meningitis y 17% de otros procesos invasores (sepsis, peritonitis). La mayoría de los aislamientos procedían de niños (57%) y menores de 2 años (67%).
Los aislamientos estaban serotipificados con la reacción capsular de Quellung. El serotipo 14 fue el predominante (65%), seguido por los serotipos 23F (15%) y 6B (9%); 6% de los aislamientos presentaron el serotipo 9V y 3% el 6A; los serotipos 19F y 34 se presentaron en 1%. A los aislamientos estudiados también se les había determinado la susceptibilidad antimicrobiana, expresada como la concentración inhibitoria mínima (CIM) en mg/ ml a penicilina, ceftriaxona, eritromicina, cloranfenicol, trimetroprim-sulfametoxazol, vancomicina y tetraciclina. La metodología e interpretación se había realizado de acuerdo con las recomendaciones del Comité Nacional de Estándares para el Laboratorio Clínico ( National Committee for Clinical Laboratory Standards, NCCLS) (8). En 50 aislamientos (26%) se determinó resistencia intermedia a la penicilina (CIM=0,125 - 1,0 mg/ml) y en 140 (74%) resistencia alta (CIM>2,0 mg/ml).
PFGE. Se realizó según el protocolo de Soares et al. (9) y las modificaciones de Vela et al. (7). Brevemente, los aislamientos se cultivaron en caldo Todd-Hewitt suplementado, hasta alcanzar la fase logarítmica de crecimiento. Las células fueron embebidas en discos de agarosa de bajo punto de fusión (Bio-Rad), digeridas con la enzima de restricción SmaI (Promega) y los fragmentos de restricción se separaron en geles de agarosa al 1% (Bio-Rad) por electroforesis en campo pulsado usando el equipo CHEFF II (Bio-Rad). Los geles se colorearon con bromuro de etidio y se visualizaron con luz ultravioleta. Los patrones de las bandas se asignaron visualmente y se clasificaron según los criterios de Tenover (10); igualmente, se analizaron con el programa de cómputo Diversidad (Bio-Rad) para determinar el porcentaje de similitud genética de los aislamientos y obtener los dendrogramas correspondientes. Como cepas de control y referencia se emplearon la cepa R6, acapsular y sensible a antibióticos (donada por Alexander Tomasz de Rockefeller University, New York), los clones 1-España 23F , 2-España 6B y 3-España 9V (suministrados por el Centro Nacional de Streptococcus, NCS, Alberta, Canadá) y los aislamientos colombianos INS Spn E-147 (representante del clon 26-Colombia 23F ) y Spn 1206, serotipo 14 con patrón de PFGE relacionado con el clon 3-España 9V (7).
Análisis estadístico. Con el fin de determinar una posible relación entre los grupos clonales y el diagnóstico clínico de los pacientes, se utilizó el programa EpiInfo 6.04 para la comparación de porcentajes determinando el valor de p. Se consideró una diferencia estadísticamente significativa un valor de p<0,05.
Resultados
]]> Con la técnica de electroforesis en campo pulsado y teniendo en cuenta la distribución por serotipos, los 190 aislamientos se agruparon en 42 patrones electroforéticos. Los patrones asignados como A, B, C y D agruparon el 76% de los aislamientos, 6 patrones (J-Ñ) (7%) tenían 2 o más aislamientos y los 32 restantes (17%) un solo aislamiento.Serotipo 23F
De los 29 aislamientos con tipo capsular 23F, 9 fueron multirresistentes y conformaron el patrón A relacionado por fenotipo y genotipo (relación genética >89%) con el clon 1-España 23F . El patrón A se subdividió en 8 subtipos, de los cuales A, A1 y A3 se habían informado previamente (6,7). Además, 17 aislamientos con resistencia intermedia a la penicilina y variable a trimetroprim-sulfametoxazol y tetraciclina (
cuadro 1) y un aislamiento con serotipo 19F integraron el patrón C con 11 subtipos, que incluían C1 a C5 observados anteriormente en la población infantil colombiana (6,7); los aislamientos con patrón C tenían una relación genética mayor del 82% con el clon 26-Colombia 23F . Los 3 aislamientos restantes presentaron patrones electroforéticos denominados E, F y G y no se asociaron con clones internacionales.Serotipos 14 y 9V
Los aislamientos con serotipos 14 (n=123) y 9V (n=11) se analizaron conjuntamente debido a que entre estos serotipos es un evento relativamente frecuente el intercambio de genes capsulares (11). 97 aislamientos con serotipo 14 y 9 con tipo capsular 9V conformaron el patrón B con 39 subtipos y se encontraron relacionados fenotípica y genotípicamente con el clon 3-España 9V (similitud genética >76%). Los aislamientos se distribuyeron en los subtipos B (n=4), B1 (n=12), B3 (n=31), B4 (n=12), B13 (n=6), B32 (n=3), los subtipos B6, B12, B18, B26 y B37 con 2 aislamientos cada uno, y los restantes 28 subtipos tenían sólo un aislamiento. El subtipo B13 se observó solamente en los aislamientos recuperados en Bogotá. A diferencia de 3 aislamientos serotipo 14 con resistencia intermedia a la penicilina que integraron el patrón H, los restantes aislamientos serotipo 14 (n=23) y 9V (n=2) tenían patrones electroforéticos no relacionados entre sí, ni con clones internacionales.
Serotipo 6B
De los 17 aislamientos con serotipo 6B, 14 integraron el patrón D con 8 subtipos, fenotipo multirresistente (
cuadro 1) y relacionados con el clon 2-España 6B con un porcentaje de similitud genética mayor del 81%. Los otros 3 aislamientos presentaron diversos patrones de PFGE.
Otros serotipos
]]> Los 5 aislamientos con tipo capsular 6A se distribuyeron en 3 patrones electroforéticos; J (n=2), AK (n=1) y L (n=2); los serotipo 19F, uno se agrupó en el patrón C y los otros 2 conformaron el patrón AL; por último, los aislamientos con tipo capsular 34 (n=2) integraron el patrón AM.Diagnóstico y clonalidad
Los aislamientos relacionados con los clones internacionales 1, 2, 3 y 26 se recuperaron en el 82% de los pacientes con neumonía y en el 70% de los pacientes con meningitis. En el
cuadro 2 se observa la distribución de los aislamientos según el diagnóstico y sus relaciones clonales.
La mayoría de los aislamientos se encontraron relacionados genéticamente con el clon 3- España 9V y al comparar su distribución según el diagnóstico de neumonía o meningitis no presentaron diferencias significativas ( p= 0,146). Contrario a lo observado en los aislamientos relacionados con el clon 2-España 6B , que se recuperaron principalmente de pacientes con neumonía ( p=0,052) y en los aislamientos relacionados con el clon 26-Colombia 23F , los cuales en su mayoría se aislaron de pacientes con diagnóstico de meningitis ( p= 0,001).
Discusión
En Colombia, la resistencia a la penicilina en aislamientos invasores de S. pneumoniae recuperados de niños menores de 5 años se ha incrementado a través del tiempo; es así como en el periodo de 1994 a 1996 fue del 12% (6) y aumentó hasta el 47,4% en el 2003 (12). En el mundo, el incremento en la prevalencia de aislamientos de S. pneumoniae resistentes a la penicilina se ha asociado con la naturaleza clonal de ciertas cepas resistentes, las cuales se han establecido como clones endémicos (1,13), o con la evolución local de aislamientos resistentes que, por medio de transformación genética y recombinación homóloga, adquieren marcadores de resistencia y por el efecto de la presión selectiva del antibiótico pueden proliferar y establecerse como una población clonal (11,13).
Desde 1998, Castañeda et al. establecieron la circulación de los clones internacionales 1 y 3 en la población pediátrica colombiana, con alta resistencia a la penicilina, y un grupo clonal de tipo capsular 23F con resistencia intermedia a este antibiótico (6), reconocido actualmente como el clon 26-Colombia 23F por la red de epidemiología molecular del neumococo ( The Pneumococcal Molecular Epidemiology Network, PMEN)(14); posteriormente, Vela et al. demostraron la circulación en Colombia del clon multirresistente 2-España 6B (7). En este estudio, estos 4 clones representaron el 76% de los aislamientos resistentes a la penicilina, lo cual demuestra su permanencia en el tiempo y su asociación directa con la prevalencia de la resistencia a la penicilina en nuestro medio (
figura 1), de forma similar a lo observado en otras regiones del mundo (2,15).
Al comparar la distribución de los aislamientos de S. pneumoniae relacionados con clones internacionales con los dos estudios previos de vigilancia molecular realizados en Colombia (6,7), se observa un aumento de los aislamientos relacionados con el clon 3-España 9V , el cual agrupaba el 12% de los aislamientos estudiados en el periodo de 1994-1996 (6) y, en la actualidad, comprende el 56% de los aislamientos resistentes a la penicilina (figura 1). Además, dentro de este grupo clonal sobresalen algunas subpoblaciones con tendencia a predominar, como el subtipo B3 que pasó de agrupar el 7% de los aislamientos recuperados entre 1994 a 1996 (6) al 28% de los aislamientos del presente estudio, posiblemente, como resultado de eventos genéticos que modificaron su contenido genético y, al mismo tiempo, facilitaron su proliferación y dispersión (16).
Previamente se había informado el serotipo 34 como variante capsular del clon 26-Colombia 23F (6,7); no obstante, ninguno de los aislamientos estudiados con este serotipo se encontraron relacionados genéticamente con este clon. Sin embargo, un aislamiento con serotipo 19F se relacionó genotípicamente con el clon 26, posiblemente debido al intercambio de genes capsulares por recombinación homóloga que reemplaza parte del locus capsular cps del serotipo 23F por una región cps del tipo capsular 19F, de forma similar a lo observado con las variantes de serotipo 19F del clon 1-España 23F (4,17).
Los aislamientos relacionados con los clones 1-España 23F y 3-España 9V se recuperaron en similar proporción tanto de pacientes con meningitis como con neumonía, a diferencia de los aislamientos del clon 2-España 6B que se recuperaron con mayor frecuencia de pacientes con neumonía y del clon 26-Colombia 23F que en su mayoría procedían de pacientes con meningitis, pero no es posible establecer una relación entre un clon y una determinada entidad clínica debido al bajo número de aislamientos estudiados.
Los estudios de vigilancia molecular de los aislamientos de S. pneumoniae indican que la dispersión clonal es una de las principales causas de la prevalencia de resistencia a la penicilina en nuestro país, como resultado de la circulación de los clones internacionales 1-España 23F , 2-España 6B , 3-España 9V y 26-Colombia 23F , en particular del clon 3 que es resistente a penicilina, ceftriaxona y trimetroprim-sulfametoxazol, y del clon 26 que se asocia con la dispersión de la resistencia intermedia a la penicilina. No obstante, no son la única causa debido a que el 23% de los aislamientos no se encontraron relacionados con clones internacionales; esto indica la posible transferencia horizontal de genes pbp que codifican para proteínas de unión a la penicilina con afinidad disminuida por el antibiótico (12,13) o el surgimiento de nuevas líneas clonales resistentes que evolucionaron a partir de aislamientos locales en respuesta a la presión selectiva ejercida por la penicilina en nuestro país (14,18).
Los estudios de vigilancia molecular han contribuido al mejor conocimiento de la epidemiología de las enfermedades infecciosas y son importantes para el control de la dispersión de la resistencia a los antibióticos que, además, de establecer la situación actual, también permiten evaluar el impacto de cualquier medida de intervención dirigida a disminuir la infección. Una de ellas es la inmunización de la población infantil con la vacuna heptavalente, la cual ha comprobado ser efectiva en la reducción de las infecciones invasoras en niños causadas por aislamientos resistentes a la penicilina y disminuir en los portadores nasofaríngeos los serotipos contenidos en la vacuna (19). Por consiguiente, la vacunación puede tener consecuencias en la distribución y prevalencia de grupos clonales, una consideración adicional que enfatiza la necesidad de mantener activa la vigilancia molecular de los aislamientos invasores de S. pneumoniae.
Correspondencia:
Elizabeth Castañeda, Grupo de Microbiología, Instituto Nacional de Salud, Avenida calle 26 No. 51-60, Bogotá, D.C., Colombia.
Teléfono: (571) 220 7700, extensión 445
]]> Recibido: 16/07/04; aceptado: 08/09/04Referencias
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