2 Instituto de Biología Molecular, Universidad El Bosque; Departamento de Farmacia, Facultad de Ciencias, Universidad Nacional de Colombia, Bogotá, D.C., Colombia.

Aunque las especies de enterococos son flora normal del tracto gastrointestinal humano, se encuentran entre los tres agentes patógenos microbianos que más se asocian con infecciones intrahospitalarias. Tradicionalmente, los enterococos se han considerado bacterias extracelulares. Sin embargo, es creciente la información que reporta su ingreso a través de líneas celulares epiteliales o macrófagos. A pesar de que estos microorganismos constituyen el tercer grupo de aislamientos obtenido de pacientes con bacteriemia o endocarditis, su interacción con la célula endotelial no se ha descrito completamente. En el presente trabajo evaluamos si el aislamiento intrahospitalario de Enterococcus faecalis (Ef2880) podía penetrar en células endoteliales de la vena de cordón umbilical humano (HUVEC) cultivadas in vitro. Nuestros resultados indican que los cultivos primarios HUVEC después de ser inoculados con Ef2890, incubados y tratados con antibióticos bactericidas para las bacterias extracelulares y adheridas a la cara externa de la membrana celular, exhiben bacterias intracelulares que pueden ser recuperadas vivas cuatro horas después de la inoculación. El modelo biológico desarrollado se puede constituir en una herramienta útil para el estudio de las interacciones que establecen los enterococos con el endotelio.

Palabras clave: endotelio, cultivo celular, Enterococcus sp., infección enterocócica de cultivos de HUVEC

Although enterococcus bacteria are normal human intestinal flora, they rank as the third most common pathogen involved in hospital acquired infections. Generally, these bacteria are considered extracellular pathogens; however, an increasing number of reports indicate invasiveness to epithelial cell lines and macrophages. Despite their importance as nosocomial infection agents in patients suffering bacteremias and endocarditis, their interaction with endothelial cells has not been fully described. Herein, the nosocomial Enterococcus faecalis isolate Ef2890 from a hospitalized patient was exposed to cultured human venous endothelial cells from the umbilical chord. When the primary cell cultures were inoculated with Ef2890 and treated with bactericidal antibiotics to kill extracellular and adhered bacteria, intracellular bacteria were recovered and plated 4 h post-infection. These observations indicate that cell cultures provide a valuable biological model to study interactions between endothelium and enterococci.

Key words: Enterococcus sp., endothelium, cell culture, enterococcal infection, nosocomial infections.

La endocarditis infecciosa es una patología del endotelio que afecta generalmente las válvulas normales, protésicas o patológicas del corazón (6). La lesión característica, denominada "vegetación", es una biopelícula que se forma cuando las bacterias circulantes se adhieren al endotelio lesionado y son cubiertas por una capa de plaquetas y fibrina. El microambiente proporcionado por la biopelícula esconde el microorganismo, y le permite evitar la acción defensiva del sistema inmune y sobrevivir (6).

Los estudios con bacterias Gram negativas y Gram positivas han mostrado su efecto regulador o de sus productos sobre la expresión por parte de las células endoteliales de moléculas de adhesión, factores de crecimiento y citocinas endoteliales en las infecciones sistémicas (7-11). Sin embargo, la investigación sobre los procesos de penetración de cepas de enterococos en células endoteliales no está muy desarrollada, en parte, porque estos organismos se consideran flora normal (3).

La emergencia de enterococos con niveles importantes de resistencia a los antibióticos ha hecho que aumente el interés por entender los mecanismos que estas bacterias usan para lesionar los tejidos de los sitios que colonizan. Ya se ha demostrado que las cepas de Enterococcus faecalis resistentes a los antibióticos son capaces de trasladarse a través del epitelio intestinal de ratones (12,13) y los estudios sobre los factores bacterianos involucrados en las interacciones célula-patógeno han identificado sustancias que desempeñan un papel importante en el ingreso de la bacteria en enterocitos y macrófagos cultivados (14-16). Como se cree que muchas infecciones enterocócicas del torrente sanguíneo tienen origen entérico (17), los estudios in vitro se han enfocado a entender los mecanismos empleados por los enterococos para superar la barrera epitelial y sobrevivir en los macrófagos. Recientemente, se reportó que los aislamientos nosocomiales de E. faecalis se adhieren e invaden células HeLa y que la endocitosis mediada por receptores puede ser uno de los mecanismos utilizados por la bacteria para invadir este tipo de célula epitelial (17).

A pesar de que en las vegetaciones características de la endocarditis los enterococos interactúan estrechamente con las células endoteliales, in vitro no se ha estudiado la relación que establecen las diferentes especies enterocócicas con las células endoteliales. Tampoco, si estas células en cultivo introducen enterococos ni el papel que este proceso puede jugar en la recurrencia de la infección.

El propósito de este trabajo fue establecer si un aislamiento intrahospitalario de enterococo, inoculado en cultivos primarios de células endoteliales aisladas de la vena del cordón umbilical humano (HUVEC) es capaz de invadir las células endoteliales. Con este fin, estandarizamos los procedimientos que se deben seguir para infectar cultivos HUVEC con aislamientos nosocomiales de E. faecalis. Encontramos que al exponer las células a las bacterias por dos horas y luego tratarlas con antibióticos para eliminar E. faecalis extracelulares o adheridos a la membrana, es posible encontrar bacterias en el interior de las HUVEC cultivadas.

Para este trabajo se utilizó el aislamiento clínico E. faecalis Ef 2890. La caracterización y los patrones de susceptibilidad antimicrobiana de este aislamiento se describieron previamente por el Instituto de Genética Molecular Bacteriana de la Universidad El Bosque (4). La cepa no invasiva Escherichia coli DH5a sirvió como control negativo en los experimentos de infección. Las bacterias se mantuvieron y crecieron en caldo o agar infusión cerebro-corazón (BHI) (Biomedics, Madrid, España). Para preparar los inóculos utilizados en la infección, se inocularon suspensiones de los aislamientos en agar BHI y se incubaron a 35°C por 24 horas. Luego de la incubación, se resuspendieron 4 o 5 colonias en 20 ml de caldo BHI y se incubaron a 35°C por 18 horas con agitación constante a 150 rpm en un baño de María (Shaker Bath, Lab-line, USA). Posteriormente, se tomó 1 ml de este cultivo, se resuspendió en 9 ml de medio RPMI (Gibco, Invitrogen Corporation, Grand Island, NY) y se incubó hasta alcanzar una OD625 de 0,08 a 0,1, equivalente a 1x10⁸ UFC/ml, aproximadamente. Los cultivos así obtenidos se utilizaron como inóculos en los ensayos de invasión.

Después de obtener el consentimiento informado firmado por las pacientes, se tomaron segmentos de cordón umbilical de 15 cm, aproximadamente, obtenidos de partos normales en el Servicio de Obstetricia de la Clínica El Bosque. Los segmentos de cordón se transportaron en solución tampón salina de fosfatos (PBS, pH 7,4) con suplemento de penicilina/estreptomicina (100 UI- 100mg) (GIBCO), se lavaron y se desinfectaron externamente con etanol al 70%.

En los cordones limpios y desinfectados, se localizaron y canularon ambos extremos de la vena umbilical con aguja roma 21 fr y se fijaron las agujas con pinzas de Kelly. La vena umbilical se lavó con PBS para eliminar rastros de sangre, se llenó con una solución de tripsina-EDTA (0,25%/ 0,02% p/v) (GIBCO) y se incubó por 15 minutos a 37°C. Pasado este tiempo, las células endoteliales fueron desprendidas lavando la vena con 10 ml, aproximadamente, de medio DMEM (GIBCO) con suplemento de 10% de suero fetal bovino (SFB) (GIBCO). La suspensión celular obtenida se centrifugó a 1.800 g por 10 minutos; el sedimento se resuspendió en medio DMEM co suplemento al 20% de SFB, penicilina-estreptomicina (100 UI-100mg), vitaminas (ICN, Biomedicals Inc.), aminoácidos no esenciales (GIBCO, Life Technologies) y piruvato de sodio al 1% (GIBCO, Life Technologies).

La cantidad de células viables presentes en la suspensión celular obtenida se determinó con una tinción vital (azul de tripano) y se escogieron suspensiones con viabilidades superiores al 80% para realizar las siembras. El inóculo empleado por frasco T de 12,5 cm² (Falcon) fueron las células endoteliales aisladas de venas umbilicales de tres segmentos de 10 cm. Los cultivos se incubaron en atmósfera controlada con 5% de CO₂ y temperatura de 37°C hasta observar confluencia. Para los ensayos de invasión, se utilizaron cultivos de segundo pasaje.

La expresión del factor VIII de la coagulación, factor von Willebrand (vW), en los cultivos HUVEC se detectó utilizando como anticuerpo primario un anticuerpo monoclonal de ratón anti-vW humano en dilución 1:25 (Dako, Dinamarca) y como anticuerpo secundario, un anticuerpo policlonal de cabra anti-ratón, conjugado con peroxidasa (Dako, Dinamarca) en dilución 1:100. Para la inmunotinción, se fijó el cultivo con metanol por 5 minutos y la placa sembrada se sometió a la siguiente serie descendente de baños con etanol para deshidratarla: 100% por 15 minutos, 95% por 10 minutos y 70% por 5 minutos. Después de lavar con PBS por 10 minutos, se bloqueó con gelatina al 1% por 1 hora, se volvió a lavar con PBS, se incubó con H₂O₂ por 5 minutos y se lavó con PBS. Se agregó el anticuerpo mouse anti-human von Willebrand factor, se incubó por una hora y se lavó varias veces con PBS. Luego, se incubó con el anticuerpo secundario peroxidase conjugated goat anti-mouse immunoglobulin por 30 minutos, se lavó con PBS y se incubó con el sustrato de la enzima por 5 minutos. Como tinción de contraste se empleó hematoxilina. Para controlar la especificidad de la tinción se incluyeron dos controles: un cultivo de células HUVEC al que no se le adicionó anticuerpo primario y un cultivo de fibroblastos, que no expresan el factor, con anticuerpos primario y secundario.

El ensayo utilizado para la detección intracelular de E. faecalis se adaptó del procedimiento seguido en los experimentos de protección a antibióticos (10,11). Se incubaron frascos T de 12,5 cm² con cultivos HUVEC confluentes con tripsina 0,25% por 20 minutos a 37°C en atmósfera húmeda con 5% de CO₂. Se adicionó DMEM con suplemento de SFB al 10% para neutralizar la enzima; se centrifugó y el sedimento obtenido se resuspendió en 1 ml de medio DMEM con suplemento de SFB al 20% y se sembró en platos de cultivo de 24 pozos (Falcon), utilizando una densidad de siembra de 5 x 10⁴ células por pozo. Los cultivos se incubaron por 24 horas o hasta alcanzar confluencia; luego, se lavaron tres veces con PBS; se adicionó medio RPMI sin suplemento y se incubaron por 3 horas en atmósfera húmeda con 5% de CO₂.

Transcurrido este tiempo, se agregó el inóculo bacteriano en medio RPMI a los pozos, utilizando una multiplicidad de infección de 2.000 bacterias por célula endotelial; se incubaron por 2 horas; se retiró el medio y las células se lavaron tres veces con PBS. Luego, se adicionó medio RPMI con suplemento de gentamicina-penicilina (500 mg-500 UI) y se incubaron por 2 horas (5% de CO2 y temperatura de 37°C) con el fin de matar las bacterias extracelulares y las adheridas a la cara externa de la membrana celular. Después de transcurrido tiempo, los cultivos se lavaron con PBS, se lisaron con una solución de Tritón X-100 al 1% (Sigma) y se realizaron diluciones seriadas del lisado que se sembraron por extensión en cajas de agar BHI, se incubaron y se realizó el conteo de UFC.

Paralelamente, se llevó a cabo un experimento en el cual la infección se hizo con E. coli DH5a,y se incluyó como control negativo. Los datos se presentan como porcentaje de invasión = 100 x (UFC recuperadas/UFC del inóculo inicial). Para comprobar la muerte de las bacterias extracelulares se sembraron 50 µl del sobrenadante de los cultivos tratados con la mezcla de antibióticos, se incubaron y se observaron para establecer la aparición de UFC en el agar.

Se hicieron pasajes de células HUVEC de cultivos confluentes en frascos T 12,5 a láminas de vidrio estériles con una densidad de 2 x 10⁴ células por lámina y se incubaron en ambiente húmedo con 5% de CO₂ y temperatura de 37°C por 24 horas. Después de la incubación, se lavaron tres veces con PBS, se agregó medio RPMI sin suplemento y se incubaron por 3 horas en las mismas condiciones; se adicionó el inóculo bacteriano en medio RPMI con una multiplicidad de infección de 2.000 y se incubaron por 2 horas. Después de la incubación, se retiró el medio, se lavaron tres veces las células con PBS, se adicionó medio RPMI con suplemento de gentamicina-penicilina (500 mg-500 UI) y se incubó por 2 horas en 5% de CO₂ y 37°C.

En este experimento se incluyeron cultivos infectados con la cepa de E. coli DH5a, como control negativo de la infección. Las láminas con los cultivos infectados se fijaron en metanol absoluto (Merck), se tiñeron con Gram o Giemsa y se observaron al microscopio.

Se prepararon e infectaron cultivos en láminas de vidrio estériles de la forma descrita en los ensayos de microscopia óptica. Los cultivos infectados se fijaron en glutaraldehído al 3% en PBS (v/v) (Eufar), y se posfijaron con tetróxido de osmio; se sometieron a deshidratación en series ascendentes de etanol, embebidos en Epón, cortados finamente con un ultramicrótomo (LKBPharmacia), teñidos con una solución acuosa saturada de acetato de uranilo y citrato de plomo.

Las observaciones de los cortes se hicieron en un microscopio electrónico Phillips CM10 a 21.000 y 28.500 aumentos.

En este trabajo encontramos que la digestión enzimática con tripsina de la lámina endotelial que recubre la vena del cordón umbilical humano y la agrupación de los productos digeridos provenientes de tres cordones umbilicales cada uno con longitudes aproximadas de 15 cm permiten establecer cultivos primarios HUVEC. En este paso, no se establece el número exacto de células endoteliales aisladas y sembradas por frasco T-25 debido a que se obtienen muchos agregados celulares lo cual hace muy inexacto el conteo. Establecido el cultivo, los subcultivos se hacen con densidades celulares de 5x10⁴ células por cm².