Evaluación de métodos fenotípicos y genotípicos para la detección de farmacorresistencia de Mycobacterium tuberculosis

Tania Bibiana Porras ¹, Clara Inés León ¹, Martha Inírida Guerrero ¹, Anandi Martin ²,

FranÁoise Portaels ², Juan Carlos Palomino ²

1 Grupo de Micobacterias, Instituto Nacional de Salud, Bogotá, D.C., Colombia.

Introducción. La dificultad en el diagnóstico temprano y oportuno de la susceptibilidad a los medicamentos de Mycobacterium tuberculosis hace necesario el diseño y la evaluación de nuevas técnicas que superen la efectividad, reduzcan el costo y el tiempo que toman los métodos tradicionales.

Objetivo. Evaluar y comparar dos metodologÍas fenotÍpicas y una genotípica, ÿtiles en la determinación rápida de susceptibilidad de M. tuberculosis, teniendo el método de las proporciones mÿltiples como referencia.

Materiales y métodos. Se incluyeron 21 cepas de M. tuberculosis para la evaluación de las metodologías fenotípicas de oxidación y reducción de Alamar azul (Maba) y el bromuro de 3-(4-5-dimetiletiazol-2-il)-2,5-difenil tetrazolio (MTT o Tema), frente a estreptomicina, isoniacida, rifampicina y etambutol. Mediante análisis ROC (receiver operative characteristic curves) se determinó el desempeño de las pruebas y se determinaron los valores pronósticos y el punto de corte para cada antibiótico. Además, mediante tablas de contingencia se determinó el desempeño y los valores predictivos de la metodología genotípica de PCR e hibridación reversa o rifoligotyping, versión 3, en la determinación de las cepas multirresistentes.

Resultados. Los perfiles de susceptibilidad por las pruebas colorimétricas se obtuvieron a los 7 días, con valores de área bajo la curva menores de 0,9, sensibilidad de 100% y especificidad mayor de 80%. La metodología de rifoligotyping resultó eficaz en la detección de mutirresistencia, con sensibilidad de 100% y especificidad de 93%.

Palabras clave: Mycobacterium tuberculosis/efecto de drogas, Alamar azul, MTT, rifoligotyping, resistencia a mÿltiples drogas, tests de sensibilidad microbiana.

Background. Expeditious charactization of drug susceptibility in Mycobacterium tuberculosis is difficult and, calls for the design and evaluation of faster, cheaper and more effective new techniques.

Objective. The aim of the current study was to compare one genotypic and two phenotypic methods for rapid susceptibility detection of M. tuberculosis.

Material and methods. Twenty-one M. tuberculosis strains were evaluated by phenotypic methodologies of oxidation and reduction of Alamar blue and MTT in the presence of streptomycin, isoniazid, rifampin and ethambutol. In all tests, the proportion method was applied as the comparison standard. By means of receiver operative characteristic (ROC) analysis, the performance, predictive values and threshold values for all drugs were determined. In addition, the performance of PCR and reverse line blot hybridization in establishing predictive values for sensitivlity and resistance were compared in contingency tables.

Results. The susceptibility patterns established by colorimetric techniques were obtained after seven days of incubation. The performances of these tests were excellent for all drugsó the areas under curves were >0.9, 100% of sensitivity (S) and specificity (E) >80%. The genotypic method of RFLP oligotyping detected multidrug resistance with S of 100% and E of 93%.

Conclusion. The results indicated that Alamar blue, MTT and RFLP methodologies are rapid and useful tools for characterizing multidrug resistance in M. tuberculosis, particularly for those patients with high risk of developing multidrug resistant tuberculosis.

Keywords: Mycobacterium tuberculosis, susceptibility testing, multidrug resistant, Alamar azul, MTT, rifoligotyping.

La infección con cepas resistentes y multirresistentes de Mycobacterium tuberculosis, dada la facilidad en la transmisión del bacilo además del impacto social, trae consigo elevados costos en cuanto a la implementación de nuevos esquemas terapéuticos. Por esta razón, es necesario detectar rápidamente estos casos para cortar oportunamente con la cadena de transmisión de estos bacilos (1).

La actual metodología de referencia para la detección de susceptibilidad a los medicamentos es el método de las proporciones mÿltiples diseñado en 1961 (4); es costoso, laborioso y requiere un tiempo prolongado para emitir el resultado. Por ello, es indispensable implementar nuevas técnicas que reduzcan el tiempo y el costo para la detección de la susceptibilidad a los medicamentos. Ejemplo de ello es el sistema radiométrico Bactec que ofrece resultados en poco tiempo, pero sus mayores inconvenientes son el uso de material radioactivo y su elevado costo. El tubo indicador de crecimiento (Mycobacteria Growth Indicator Tube, MGIT) que usa un indicador fluorescente sensible a los cambios de presión de oxígeno es otra alternativa pero aÿn no está totalmente evaluado y registra altos porcentajes de contaminación dada la riqueza del medio y el uso de tubos con taparrosca. Este ÿltimo parámetro ha sido mejorado en el nuevo sistema BACTEC MGIT 960 (5,6).

Así mismo, las técnicas basadas en la difusión del antibiótico en placas de agar como el E-test ayudan en la determinación rápida de farmacorresistencia (7).

Los indicadores de viabilidad celular, como el alamar azul^TM resazurin, permiten detectar crecimiento, viabilidad y susceptibilidad de M. tuberculosis a los medicamentos (8-10). Para detectar esta susceptibilidad de M. tuberculosis a los medicamentos se emplean microplacas con medio líquido, y de acuerdo con el indicador utilizado se conocen estas pruebas como Rema (resazurin microtiter assay) (11,12) y Maba (microdilution alamar blue assay) (13,14). Otro colorante usado es la sal de tetrazolio MTT (bromuro de 3(4,5-dimetiltizol-2-i)-2,5-difenil tetrazolio) ÿtil en ensayos de proliferación y citotoxicidad de células eucariotas (15,16). Su incorporación en cultivos líquidos de M. tuberculosis, realizados en microplacas, permite determinar rápidamente la susceptibilidad a los diferentes agentes antibacterianos (17-23).

El conocimiento de las bases genéticas de la resistencia de M. tuberculosis a los fármacos, en especial a rifampicina, ha sido la base del desarrollo de técnicas moleculares que amplifican por PCR la región determinante de resistencia a rifampicina localizada en el gen rpoB que codifica el blanco del fármaco. En ella se localiza cerca del 90% de las mutaciones que confieren resistencia a este medicamento (24,25).

Las técnicas moleculares como PCR-SSCP (single strand conformational polymorphism), determinación de secuencias y técnicas de hibridación, como INNO-LipA, PCR-PHL o rifoligotyping y PCR-ELISA ayudan a determinar en forma rápida y eficaz la susceptibilidad a rifampicina e isoniacida (26-32). La técnica basada en la hibridación reversa de productos amplificados rifoligotyping en su tercera versión incluye una mutación adicional a las incluidas en las versiones 1 y 2; Èsta se ha evaluado y ha resultado ÿtil en la determinación rápida de resistencia a la rifampicina, parámetro importante dado que este medicamento constituye la columna vertebral del esquema terapéutico antituberculoso.

El presente trabajo se realizó con el objetivo de evaluar dos técnicas fenotípicas basadas en la reducción de alamar azul^TM y MTT (Maba y Tema) para la determinación de susceptibilidad de M. tuberculosis frente a agentes antibacterianos de primera línea, dada su facilidad en el montaje y lectura de los resultados, rapidez, bajo costo y a no requerir de equipos ni personal especializado y la técnica de PCR e hibridación reversa o rifoligotyping (PCR-PHL), versión 3, para la detección de mutaciones asociadas con la resistencia a rifampicina la cual es una metodología genotípica fácil de aplicar, rápida y poco costosa comparada con pruebas comerciales como la InnoLipA y menos laboriosa que la PCR- ELISA y la PCR-SSCP, usando como método de referencia la técnica de las proporciones múltiples.

Materiales y métodos

Se incluyeron 20 cepas de M. tuberculosis y la cepa de referencia H37Rv enviadas por la profesora FranÁoise Portaels del International Reference Laboratory, Antwerp, Belgium; de acuerdo con los criterios establecidos por la Red Supranacional de Laboratorios, se tuvo en cuenta la inclusión de una proporción similar de cepas sensibles y resistentes a los cuatro medicamentos estudiados (comunicación personal, A. Laszlo).

Se utilizó una placa de poliestireno de 96 pozos (FalconÆ) para el montaje de las dos pruebas, para una misma cepa. Se añadieron 200 µl de agua destilada estéril a los pozos externos con el fin de evitar la evaporación del medio durante la incubación.

Se prepararon soluciones madre de 1 mg/ml en agua destilada estéril para isoniacida, etambutol y estreptomicina, y de 10 mg/ml en dimetilsulfóxido (DMSO) para la rifampicina. Posteriormente, se prepararon soluciones de trabajo de 32 µg/ml, 4 µg/ml, 128 µg/ml en medio Middlebrook 7H9 para la estreptomicina, la isoniacida y el etambutol, respectivamente, y de 8 µg/ml para la rifampicina.

Se dispuso una columna con 6 pozos para el ensayo con cada antibiótico en los que se adicionaron 100 µl de Middlebrook 7H9 y 100 µl de las soluciones de trabajo de cada fármaco. Directamente dentro de la placa se realizaron diluciones seriadas en base dos de cada medicamento para lo cual se tomaron 100 µl y se transfirieron al pozo siguiente de forma tal que en cada pozo quedó un volumen final de 100 µl con concentraciones finales de los antibióticos entre 0,25 y 8 µg/ml para la estreptomicina; 0,031 y 1 µg/ml para la isoniacida; 0,061 y 2 µg/ml para la rifampicina y 1 y 32 µg/ml para el etambutol. Posteriormente, se adicionaron 100 µl de inóculo consistente en una dilución 1:20 obtenida a partir de una suspensión bacteriana igual a la del tubo nÿmero 1 de la escala de McFarland.

Además, para cada prueba se dispuso un control de medio con 200 µl de Middlebrook 7H9 para comprobar su esterilidad; también, un control del inóculo diluido 1:100 para garantizar el crecimiento sólo del 1% de la población bacilar, así como cuatro controles de crecimiento en los que se adicionó el inóculo bacteriano sin antibiótico.

Se incubaron las placas a 37°C en ambiente hÿmedo. A los 5 días se evidenció el crecimiento por la incorporación de 32 µl de una solución de alamar azul^TM (Trek Sistemas Diagnóstico Ltd., U.K) y Tween 80 al 20% para Maba, y 22 ml de una solución de MTT (SigmaÆ) de 5 mg/ml y Tween 80 al 20% para Tema. Luego, se incubaron nuevamente las placas por 24 horas y se observó el cambio de color de los colorantes. La reducción del alamar azul^TM fue evidente por el cambio de azul a rosa y la de MTT por el cambio de amarillo a pÿrpura, indicativa Èsta de crecimiento bacteriano; en este caso, se añadió la solución de los colorantes a los demás pozos de la placa (controles de crecimiento y pozos con antibióticos) para la determinación posterior de la concentración inhibitoria mínima (CIM) (33).

Prueba de PCR e hibridación reversa o rifoligotyping, tercera versión

Las cepas se sembraron nuevamente en medio Lˆwenstein-Jensen durante 15 días y, luego, se suspendió la masa bacilar en solución tampón TE 1X (Tris-HCl, EDTA) para la recuperación del AND cromosómico. Para ello, se siguió la metodología descrita por Kremer et al. (28), usando lisozima, CTAB, extracción con cloroformo y alcohol isoamílico y, finalmente, precipitación con isopropanol. El ADN se reconstituyó en solución amortiguadora TE 0,1X.

Posteriormente, se amplificó por PCR una región de 156 pb del gen rpob, que incluyó la región determinante de resistencia a la rifampicina, con los iniciadores: TR10a (5¥-CGCCGCGATCAAGGA GT-3¥) y TR11a (5¥-ACGTCGCGGACCTCCA-3¥), este ÿltimo marcado con biotina en el extremo 5¥ (28).

La detección de la hibridación se evidenció por la incorporación inicial de conjugado de estreptavidina marcado con peroxidasa de RocheTM; luego, los reactivos de detección ECLô (peróxido de hidrógeno y luminol) (Amersham Pharmacia Biotech) y, finalmente, la señal de quimioluniniscencia se detectó por impresión de la misma en una película fotosensible de rayos X (FujiMedical).

Análisis de resultados

El método de las proporciones mÿltiples en su variante simplificada de Canetti, Rist y Grosett (4) se usó como prueba de oro para la evaluación y la comparación de las metodologías fenotípicas Maba y Tema. Una vez obtenidos los valores de CIM para cada medicamento, se determinó el rendimiento de las pruebas en términos de la sensibilidad, especificidad y área bajo la curva obtenidos con análisis con curvas ROC usando el programa MedCalc® versión 7.2.0.0 para Windows, así como el punto de corte y su valor p.

Se tuvieron en cuenta los valores del área bajo la curva (ABC) para la determinación de la eficiencia de las técnicas y fueron catalogadas como excelentes cuando dicho valor se encontró entre 1 y 0,9; buenas, entre 0,9 y 0,8; regulares, entre 0,8 y 0,7; malas, entre 0,7 y 0,6 e imperfectas, entre 0,6 y 0,5 (10,34).

Mediante tablas de contingencia se determinó el valor de la sensibilidad, la especificidad, los valores pronósticos de resistencia, sensibilidad y eficiencia, para el análisis de la metodología rifoligotyping.

Pruebas de oxidorreducción Maba y Tema

El tiempo total que se tardó en la prueba de referencia para obtenerse el resultado fue de 42 días, aproximadamente, mientras que las pruebas colorimétricas tomaron sólo 19 días, luego de haber tenido el cultivo de la cepa. En cuanto al montaje de la prueba como tal, las placas de Maba o Tema requirieron 10 minutos luego de haber preparado las soluciones de antibióticos, inóculo bacteriano y el caldo de cultivo. Del mismo modo, se necesitaron 24 minutos para el montaje de la prueba de proporciones mÿltiples luego de haberse preparado el inóculo y el medio con medicamentos y sin ellos.

La CIM para cada antibiótico se obtuvo a los 7 días de incubación de las placas y mediante análisis por ROC se determinaron los valores de sensibilidad de 100% para las dos técnicas frente a los cuatro antibióticos. Así mismo, la especificidad fue de 100% para la estreptomicina y la rifampicina, y para la isoniacida y el etambutol de 80 y 93,7%, respectivamente.

El valor pronóstico de la sensibilidad mostrado por Maba y Tema fue de 100% para cada antibiótico, al igual que el valor pronóstico de resistencia frente a estreptomicina y rifampicina. La eficiencia de las pruebas, dada por los valores de ABC, fue superior al 0,9 por lo que se clasificaron como pruebas excelentes en la detección de resistencia comparadas con el método de referencia.

Luego del cultivo de las cepas, la técnica solo tomó tres días para la obtención del resultado. La técnica solamente identificó 12 de las 13 cepas sensibles, las cuales mostraron ausencia de hibridación con los oligonucleótidos mutados; se obtuvo un resultado discrepante para una cepa que, siendo sensible, mostró resistencia a la rifampicina por esta técnica. A las 7 cepas resistentes a la rifampicina se les detectó alguna mutación en el gen rpob por esta metodología.

Discusión

La determinación de la resistencia a fármacos de primera línea, en especial a la rifampicina y la isoniacida, ha sido la base del diseño de técnicas de susceptibilidad, dada la importancia que estos dos medicamentos tienen dentro del esquema de tratamiento, y sabiendo que las cepas resistentes a la rifampicina lo son generalmente a la isoniacida, lo que se conoce como multirresistencia; se destaca la detección de la resistencia a la rifampicina para predecir la multirresistencia.

Los resultados de las pruebas Maba y Tema se obtuvieron a los 19 días; tiempo que comparado con los 42 días que toma el método de referencia, representó un ahorro significativo. Lo anterior se destaca ya que los pacientes, en los que fuere necesario ajustar e implementar un nuevo esquema, pueden verse beneficiados a partir del segundo mes de tratamiento.

Este tiempo de obtención del patrón de susceptibilidad fue menor al compararlo con los estudios en los que se ha obtenido a los 8, 10 o 14 días (8-10,13-23). Esto se logró gracias a que en nuestro estudio utilizamos un inoculo más concentrado que favoreció el crecimiento de las cepas en un menor tiempo.

La sensibilidad y especificidad mostradas por Maba y Tema fueron similares para los cuatro medicamentos. Se obtuvieron resultados excelentes para la rifampicina por las dos técnicas, razón por lo cual resultan igualmente bondadosas en la detección de multirresistencia de M. tuberculosis. La eficiencia, dada por el ABC, permitió catalogarlas como pruebas excelentes, ÿtiles en la detección eficaz de farmacorresistencia a medicamentos de primera línea. Al comparar este hallazgo con el reportado en estudios previos, encontramos que la eficiencia de las pruebas para la rifampicina y la estreptomicina fue superior, mientras que fueron similares para la isoniacida y el etambutol (10).

Los puntos de corte establecidos para cada antibiótico fueron similares a los reportados en estudios basados en la reducción de alamar azul como indicador de crecimiento (10). La diferencia en la concentración crítica establecida para el etambutol por las dos metodologías puede deberse a la dificultad que se tiene al estandarizar las pruebas de susceptibilidad a este fármaco, dada la naturaleza bacteriostática del medicamento (35).

La buena correlación de las pruebas Maba y Tema con el método de referencia es comparable con otros estudios en los que se han evaluado metodologías también realizadas en medio líquido como MGIT automatizado y MGIT manual, teniendo como referencia el método radiométrico Bactec 460 (36), en los que se reportan sensibilidades y especificidades similares para la isoniacida y la rifampicina, e incluso menores para la estreptomicina y el etambutol que las reportadas en nuestro estudio.

Destacamos algunas bondades de las pruebas fenotípicas como la rapidez en la emisión de los resultados y en el montaje de las mismas, traducidas en el significativo ahorro de tiempo comparado con el método de las proporciones mÿltiples; estos parámetros son importantes en la detección rápida y temprana de resistencia en aislamientos clínicos, lo cual tiene un impacto positivo en la comunidad derivado del tratamiento adecuado y oportuno de los pacientes. Además, porque se pueden incorporar diferentes antibióticos a los de primera línea empleados para el tratamiento de la tuberculosis, lo cual es ÿtil en el diagnóstico de susceptibilidad de otras micobacterias diferentes a M. tuberculosis, con importancia en pacientes coinfectados con VIH como Mycobacterium avium intracellulare, Mycobacterium fortuitum, Mycobacterium chelonae y otros.

De igual forma, la determinación de la concentración inhibitoria mínima resulta ÿtil para micobacterias con niveles intermedios de sensibilidad o "sensibilidad moderada" y en casos en los que se requiera ajustar las dosis terapéuticas de los medicamentos teniendo en cuenta las concentraciones séricas y la farmacocinética de cada uno, aspectos cruciales en el momento de tratar a los pacientes.

Así mismo, la no utilización de material radioactivo y el ahorro sustancial de reactivos dado el formato de microplacas utilizado constituyen ventajas frente a los métodos convencionales.

A pesar de que el rendimiento observado por las dos técnicas fue igual, tuvimos cierta dificultad al interpretar los resultados de Maba debido a que la tonalidad del colorante no fue exclusivamente azul o rosa, sino que se presentaron tonos violetas lo que constituye una desventaja de la técnica. Así mismo, la baja bioseguridad que se tiene al usar placas con medio líquido por la posible generación de aerosoles que aumenta el riesgo biológico (13,20,37), obligan a pensar a futuro que la implementación de estas técnicas se debe centralizar en los laboratorios que cuenten con la infraestructura y el volumen de muestras necesarios para emplear estas pruebas, por lo que no se justifica la implementación de ellas en muchos de los laboratorios con escaso volumen de muestras.

A las cepas resistentes a la rifampicina incluidas en este estudio se les determinó por esta técnica alguna mutación asociada con resistencia a este medicamento. Dichas mutaciones, asociadas con altos niveles de concentración mínima inhibitoria, son las comÿnmente reportadas no sólo en Colombia sino a nivel mundial (24-27,29-32).

El hecho de que a cuatro cepas resistentes a la rifampicina no se les identificó la mutación exacta responsable de la resistencia, por ausencia de hibridación con las secuencias mutadas, no constituye un hallazgo exótico en esta prueba ya que estudios previos han reportado un nÿmero significativo de cepas resistentes que no hibridizan con las secuencias mutadas incluidas en la membrana de rifoligotyping (32). Lo anterior debido a la presencia de mutaciones diferentes a las incluidas en esta membrana o cambios que, a pesar de localizarse en el mismo codón, constituyen otro diferente a los incluidos, pero igualmente responsables de la resistencia a este medicamento (25,26,29,31,32). Cabe destacar la importancia que tendría en un estudio posterior, la inclusión de mutaciones propias de cepas colombianas como las reportadas previamente (30), ya que se podrían captar aquéllas que poseen otras mutaciones además de las incluidas en este estudio.

Llamó la atención el caso de una cepa (CL-015) sensible a rifampicina que por rifoligotyping fue resistente y mediante la metodología de INNOLipA obtuvo un resultado igual (no se muestran los datos). Al analizar el resultado de la prueba de oro se observó que se le calculó un porcentaje de 0,18% de bacilos mutantes resistentes y, gracias a la alta sensibilidad de la PCR, se pudo amplificar e identificar esta pequeña poblaciÓn. Se han reportado hallazgos similares en Colombia por Cohen et al. (30), quienes al usar la técnica de PCR-SSCP detectaron porcentajes entre 0,5 y 0,99% de bacilos resistentes en cepas catalogadas como sensibles por el método de referencia. Por esta razón, planteamos la posibilidad de considerar una cepa sensible a la rifampicina cuando no registre crecimiento alguno por el método de las proporciones mÿltiples o con una proporción crítica de 0% y no del 1%, como se usa actualmente.

Por lo anterior, destacamos el método molecular de rifoligotyping, versión tres, por su eficacia en la detección de multirresistencia, resaltando bondades como la rapidez, la sensibilidad, la especificidad, los altos valores pronósticos, el bajo riesgo biológico que significa el trabajo con material genético y no con bacterias viables, además de la posible inclusión de mutaciones propias de cepas colombianas. Así mismo, la futura aplicación directa en muestras clínicas reduciría significativamente el tiempo de diagnóstico de multirresistencia. Además, este tipo de pruebas genéticas son útiles en ensayos epidemiológicos que pueden darnos una idea de la transmisibilidad y circulación de clones de M. tuberculosis en una región determinada.

Igualmente, con este trabajo destacamos las metodologías fenotípicas Maba y Tema por su rapidez, facilidad en el montaje e interpretación de los resultados, bondades que las convierten en herramientas ÿtiles en la determinación rápida de farmacorresistencia en M. tuberculosis.

Teniendo en cuenta los resultados de este estudio, se sugiere para un estudio posterior la inclusión de aislamientos clínicos de pacientes colombianos, diagnosticados con tuberculosis, con el objeto de determinar la utilidad de las pruebas en la detección de resistencia en grupos con alto riesgo de desarrollar tuberculosis multirresistente.

Agradecimientos

A Carlos Arturo Hernández del Instituto Nacional de Salud por su acertada orientación en la escritura y presentación de este artículo. A Dick van Soolingen del Mycobacteria Reference Department, National Institute of Public Health and Environment, Bilthoven, The Netherlans, por la donación del estuche de rifoligotyping, versión 3.

Conflicto de intereses

Los autores manifiestan que no existe ningún conflicto de interés.

Financiación

El presente estudio se desarrolló gracias a la financiación del Instituto Nacional de Salud de Colombia, proyecto INS 39-2001, y al apoyo de Colciencias dentro del Programa de formación y capacitación de recursos humanos para la ciencia y la tecnología, convenio 24-2002. Además, gracias al soporte de la Comisión Europea, CE, Programa INCO Upgrade Diagno MDR-TB ICA4- CT 2001- 10087.

Clara Inés León, Avenida Calle 26 Nº 51-60, Bogotá, D.C., Colombia.

Teléfono: (571) 220 7700, extensión 436; fax: (571) 220 7700, extensión 255.

Recibido: 01/07/04; aceptado: 09/12/04

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