Características de nuevos cultivos celulares derivados de tejidos embrionarios de Aedes aegypti (Diptera: Culicidae)

Ariosto Ardila, Jesús Escovar, Felio Bello

Laboratorio de Investigaciones en Entomología, Biología Celular y Genética, Departamento de Ciencias Básicas, Universidad de La Salle, Bogotá, D. C., Colombia

Introducción. Los cultivos celulares de insectos son una metodología útil en estudios biomédicos y tecnológicos.

Objetivo. El propósito principal del presente trabajo fue obtener y caracterizar cultivos celulares derivados de tejidos embrionarios de Aedes aegypti.

Materiales y métodos. Se emplearon huevos embrionados para los explantes de tejidos en los medios de cultivos MM/VP12 y L-15/Grace, con suplemento de 20% de suero fetal bovino y una mezcla al 1% de antibiótico y antimicótico, con un rango de pH entre 6,8 y 7,0. Los cultivos se incubaron a una temperatura de 28oC sin atmósfera de CO₂.

Resultados. El crecimiento celular se obtuvo en el medio L-15/Grace, 3 semanas después de haber sido sembrados los tejidos embrionarios; sin embargo, se necesitaron 6 meses para la formación de la monocapa confluente. Desde agosto de 2003 hasta junio de 2004, se habían realizado 28 subcultivos. Las células se caracterizaron morfológicamente; predominaron las formas epitelioides en subcultivos de pases altos. También se reconocieron las particularidades morfométricas del cariotipo y, además, se determinaron los perfiles isoenzimáticos y moleculares de los cultivos celulares, los cuales se compararon con muestras de adultos de la especie tomadas de la misma colonia y con líneas celulares derivadas de otros insectos.

Discusión y conclusiones. Estas células representan, potencialmente, un importante sistema in vitro en investigaciones básicas y aplicadas.

Palabras clave: Aedes aegypti, cultivos celulares, vesículas, cariotipos, isoenzimas, RAPDPCR.

Introduction. Cell cultures from insects are a useful methodology in technological and biomedical studies.

Objective. The present work was aimed at obtaining and characterizing cell cultures derived from Aedes aegypti embryonic tissues.

Materials and methods. Embryonated eggs were used for embryonic tissue explants in L-15/ Grace and MM/VP12 culture media, supplemented with 20% fetal bovine serum and a mixture of 1% antimycotic and antibiotics, at a pH ranging from 6.8 to 7.0. The incubation temperature was 28oC; a CO₂ atmosphere was not required.

Results. Cell growth was obtained in L-15/Grace medium three weeks after embryonic tissues explants. Six months were required for achieving a confluent monolayer. Twenty-eight serial cell subcultures were carried out from August 2003 to June 2004. Cell morphology was characterized as epithelial in the later subcultures. Karyotype morphometry as well as molecular and isozymatic profiles were established. The cultures were compared with adult samples from the species taken from the same colony and with cell lines derived from other insects.

Discussion and conclusions. These cells are an important in vitro system in applied and basic research.

Keywords: Aedes aegypti, cell cultures, vesicles, karyotypes, isozymes, RAPD-PCR.

Aedes aegypti es un mosquito doméstico, principal vector de la fiebre amarilla urbana, del dengue clásico y hemorrágico, de otros arbovirus y de la filariasis linfática humana (1).

En Colombia, los primeros brotes de dengue - asociados con los serotipos 2 y 3- se presentaron en la década de los setenta y, desde 1984 hasta nuestros días, han estado circulando en el país los cuatro serotipos, originando periódicamente brotes de la enfermedad, todos los cuales han sido transmitidos por Ae. aegypti (2,3) (datos de la vigilancia en salud pública del dengue, Laboratorio de Virología, Centro Control de Enfermedades, Instituto Nacional de Salud).

Aunque los brotes de fiebre amarilla que se han presentado en Colombia son principalmente selváticos, y el mayor número de casos -superiores a 100- se registraron en el 2003 y el 2004 (4,5), existe el riesgo latente de la urbanización de la enfermedad debido a la presencia de Ae. aegypti en la cercanía de algunas áreas enzoóticas (4).

La primera línea celular de mosquitos fue establecida por Grace en 1966 (9), a partir de larvas próximas a la pupación de Ae. aegypti; posteriormente, se establecieron otras líneas celulares de esta misma especie obtenidas, en orden cronológico, por Singh en 1967 (10), Peleg en 1968 (11,12) y Varma y Pudney en 1969 (13). Se han reportado, aproximadamente, 50 líneas celulares de la familia Culicidae, que corresponden a 22 especies diferentes y, de éstas, 3 han sido establecidas a partir de tejidos embrionarios de mosquitos colonizados en Colombia: Aedes taeniorhynchus, Anopheles albimanus y Psorophora confinnis (14-17).

Los cultivos celulares de insectos se utilizan, comúnmente, como sustratos para el aislamiento e identificación de arbovirus (18); sin embargo, existe en la actualidad una amplia gama de aplicaciones de esta técnica en investigaciones biomédicas y tecnológicas (19), entre las cuales sobresalen: la expresión de genes exógenos a partir de moléculas de ADN recombinante para el análisis de procesos genéticos de regulación, los cuales son difíciles de medir en el organismo entero (20); los estudios de cocultivos con parásitos (21); los estudios de entomopatógenos, reguladores del crecimiento o de compuestos bioquímicos usados contra insectos (22); la detección y dosis de entomopatógenos o sus toxinas de muestras ambientales (23); la respuesta hormonal in vitro (24); la fisiología celular (25), y el aislamiento y la caracterización de bioinsecticidas (26).

En el presente trabajo se describen las características de crecimiento, morfológicas, citogenéticas, de perfiles isoenzimáticos y moleculares de nuevos cultivos celulares, obtenidos de tejidos embrionarios del mosquito Ae. aegypti.

Material entomológico. Los huevos embrionados del mosquito Ae. aegypti se tomaron de una colonia establecida en el Laboratorio de Entomología de la Universidad de La Salle, la cual se inició con adultos recolectados en Riohacha (La Guajira, Colombia), en julio de 2002, y se ha mantenido durante 2 años, aproximadamente, a una temperatura promedio de 27oC con una humedad relativa del 80% y 12 horas de fotoperiodicidad, y con un total de 25 generaciones sucesivas.

Cultivos celulares primarios. Para cada uno de los explantes se utilizaron de 650 a 700 huevos de 3 a 4 días de incubación, en estado avanzado de embriogénesis. Las posturas se realizaron en recipientes con agua limpia de donde se tomaron directamente para el desarrollo del procedimiento de esterilización. Los huevos se retiraron de la superficie del agua por adherencia a un papel de filtro y, luego, se desprendieron mediante el arrastre con agua, cuya presión fue ejercida por la propulsión del líquido contenido en un frasco lavador y, simultáneamente, se recibieron en un tubo de centrífuga de 50 ml. Previa centrifugación a 1000g durante 5 minutos, se retiró el agua y se adicionó a los huevos una solución de hipoclorito de sodio al 1,6%, la cual se dejó actuando sobre su superficie con agitación continua durante 15 minutos; al final, se repitió la centrifugación, se descartó el sobrenadante y se vertió una solución de etanol al 70% sobre el precipitado, se resuspendieron los huevos y se volvió a repetir el procedimiento anterior. Finalmente, los huevos se lavaron tres veces con agua destilada estéril (27). Después de la esterilización, los huevos embrionados se enjuagaron con el medio de crecimiento seleccionado. Se llevó 1 ml de la masa de huevos a un homogenizador, donde se rompieron mecánicamente. La solución resultante se sembró en un frasco plástico para cultivos de tejidos de 25 cm2 de superficie, que contenía 10 ml del medio de crecimiento; en algunas ocasiones se utilizó MM/VP12 (28) y en otros explantes, una mezcla de partes iguales del medio L-15 (29) y del medio Grace (30), con suplemento de suero fetal bovino (SFB) al 20% y una solución de antibiótico y antimicótico al 1%; el pH de los medios se ajustó en el rango de 6,8 a 7,0. Los frascos de cultivos se llevaron a incubación a 280C sin atmósfera de C0₂, y se observaron diariamente mediante la ayuda de un microscopio invertido Olympus CK-2.

Subcultivos. El primer subcultivo exitoso se realizó en agosto de 2003 y, hasta la fecha (junio de 2004), se han efectuado 28. La remoción de las monocapas confluentes se hizo mecánicamente con un policía de goma; no obstante, también se ensayó con tripsina al 1%. Después de resuspendidas las células, se procedió a la dispersión de éstas mediante pipeteo vigoroso y, a continuación, la solución celular se trasladó a un frasco que previamente contenía 5 ml de medio fresco. Los primeros 5 subcultivos se desarrollaron en una proporción de 1:1, con un promedio de duración de 30 días. A partir del subcultivo 6 hasta el 12 se hicieron en una relación de 1:2 con intervalos de 15 días. De aquí en adelante, los subcultivos se realizaron gradualmente hasta llegar a proporciones de 1:3 cada 10 días.

Características morfológicas. En el proceso de crecimiento de los cultivos primarios y subcultivos, las formas celulares se determinaron mediante observación diaria, usando un microscopio invertido Olympus con contraste de fase y sistema microfotográfico, en aumentos de 100 a 400; las mejores imágenes se fotografiaron. Se procesaron células en monocapa semiconfluente de un cultivo primario avanzado mediante la técnica de microscopía electrónica de transmisión, según el procedimiento descrito por Cali et al. (31).

Preparación de cromosomas. Se emplearon muestras de cultivos primarios y subcultivos para la obtención de cromosomas metafásicos. Se agregó a los cultivos una concentración de 0,016% de colchicina en un periodo de 3 horas; las células se removieron y la solución resultante se centrifugó a 1.000g por 10 minutos. Se descartó el sobrenadante y al precipitado se le adicionó solución de KCl al 0,56%, se agitó con una pipeta de Pasteur y se dejó actuando por 30 minutos; al cabo de este tiempo, se volvió a centrifugar y, siguiendo el procedimiento anterior, se agregó solución de Carnoy (metanol y ácido acético 3:1) durante 15 minutos. Se hicieron 3 lavados seguidos con la misma sustancia; finalmente, en un volumen de 1 ml de Carnoy se goteó la suspensión celular sobre láminas limpias y desengrasadas. La coloración se efectuó con Giemsa al 2% (32,33). Se fotografiaron las mejores metafases. Se seleccionaron 20 cariotipos y en cada uno de ellos se efectuaron las siguientes mediciones: brazo corto (p), brazo largo (q), relación de brazos (p/q) (q/p), longitud total (LT) y longitud relativa (LR); este dato se obtuvo dividiendo el valor de la longitud de cada cromosoma por la longitud total del genoma; el índice centromérico (IC) se encontró midiendo la relación del brazo corto de cada cromosoma sobre la longitud total del mismo y, finalmente, la longitud relativa promedio de los cromosomas (LRPC) se registró al relacionar la longitud total de cada cromosoma con la longitud del cromosoma más pequeño del genoma (34,35).

RAPD-PCR. Para la extracción del ADN genómico se tomaron células en monocapas confluentes. Después de la remoción mecánica de las células se centrifugó el contenido para retirar el medio de cultivo y, luego, se procedió a efectuar tres lavados consecutivos del sedimento celular con PBS; con el propósito de eliminar los residuos del medio de cultivo sobre la superficie de las células, el precipitado se ajustó a una concentración de 2x106 células/ml. Se utilizó, a continuación, el método modificado de Landry et al. (38), el cual consistió en adicionar, manteniendo las muestras sobre hielo, al precipitado celular 480 µl de una solución tampón de lisis (200 mM Tris-HCl pH 8,0, 70 mM de EDTA, 2 mM de NaCl, 20 mM de metabisulfito de sodio). El tubo Eppendorf con el contenido se agitó varias veces y, luego, se agregaron 120 µl de solución acuosa de sarcosil de sodio. Luego, se llevó a incubación en un baño de agua a 55ºC durante 2 horas y, posteriormente, se centrifugó a 14.000g a temperatura ambiente durante 15 minutos. El sobrenadante se transfirió a otro tubo Eppendorf y, a continuación, se agregaron 270 µl de acetato de amonio 10 M y 600 µl de isopropanol. Previa agitación del tubo, se llevó a - 80oC por 20 minutos. Entonces, la muestra se descongeló a temperatura ambiente y se centrifugó. El sobrenadante se removió y se enjuagó el sedimento con 1.000 µl de etanol al 70%; luego de retirar la solución anterior, previa centrifugación, el tubo se colocó en posición invertida sobre un papel de filtro hasta que se secara completamente el precipitado. Éste, finalmente, fue disuelto en 50 µl de solución tamponada TE (10 mM Tris HCl, pH 8,0; 1 mM Na₂ EDTA) y se almacenó a una temperatura de 4oC hasta su uso.

Para la extracción del ADN de especímenes adultos de Ae. aegypti, se utilizó el protocolo de Coen et al. (39).

La técnica de la PCR se estandarizó teniendo en cuenta las sustancias variables en la mezcla de reacción que pudieron incidir más directamente en el proceso de amplificación. La mezcla de reacción tuvo la siguiente composición: 2,5 µl de tampón A (10X), 1 µl mezcla de dNTP (10 mM), 1,25 µl de MgCl2 (50 mM), 1 µl del iniciador (10 µM), 0,2 µl de Taq ADN polimerasa (1 U/µl), 5 µl de ADN (10 ng/µl) y 14,05 µl de H₂0 ultrapura, para un volumen final, por muestra, de 25 µl. Los cuatro iniciadores (A2=5’-TGCCGAGCTG-3’; A10=5’-ACGGCGTATG-3’; A20=5’-GTTGCGATCC-3’; y E07=5’- AGATGCAGCC- 3’), sintetizados por Invitrogen^TM, se seleccionaron teniendo en cuenta su nivel de polimorfismo en los estudios previos sobre identificación y diferenciación de subespecies de Ae. aegypti (40), y también en análisis de variabilidad genética en poblaciones de este insecto (41) y de otras especies de mosquitos (42,43). La mezcla de reacción se llevó a cabo en un termociclador Eppendorf Mastercycler; el programa utilizado en la corrida fue: 1 preciclo a 95oC de 5 minutos, seguido de 45 ciclos, cada uno de ellos desarrollados durante 1 minuto a 94, 55 y 72o C; la extensión final fue a 72o C por 5 minutos.

Los productos amplificados a partir de muestras de ADN de células de Ae. aegypti, adultos de la misma especie y de las células Lulo se corrieron en un sistema electroforético sobre agarosa al 1,5%, durante 90 minutos a 150 V; las bandas, teñidas con bromuro de etidio (0,5 µg/ml), se visualizaron y fotografiaron bajo luz ultravioleta. Para los análisis se tuvieron en cuenta tanto la presencia de bandas como su ausencia.

Cultivos celulares primarios. El crecimiento celular se inició a las 3 semanas, después de que los tejidos embrionarios se sembraron en los frascos de cultivo, en el medio L-15/Grace. No se presentó crecimiento en el medio MM/VP12. Aunque no hubo uniformidad en el crecimiento y proliferación celular de los cultivos primarios, en aquéllos con mayor avance en el crecimiento se observó la presencia de partículas, relativamente de gran tamaño, en el citoplasma de las células, que hicieron sospechar la presencia de microsporidios de transmisión transovárica, motivo por el cual se le adicionó albendazol al medio de cultivo, a una concentración de 5,2 µg/ml, complementado con el cambio periódico del medio, inicialmente cada 2 días y, luego, semanalmente. Con la técnica de microscopía electrónica de transmisión se descartó contaminación de las células y después de los 2 primeros subcultivos, las partículas no se volvieron a observar.

Para cada uno de los iniciadores utilizados, el procedimiento de amplificación de todas las muestras y las correspondientes corridas de electroforesis en agarosa, se repitieron tres veces, y se originaron los mismos resultados señalados anteriormente.

Uno de los factores críticos importantes para el éxito en la iniciación de cultivos celulares de mosquitos a partir de tejidos embrionarios es el tiempo de incubación de los huevos, el cual se debe seleccionar en el momento en que el desarrollo del embrión, por lo menos, alcance las dos terceras partes (23), y es necesario definir para cada especie de mosquito y, de acuerdo con los parámetros ambientales y nutricionales en que se mantiene la colonia en el insectario, el rango óptimo, expresado en días, para tomar los huevos embrionados y proceder a efectuar el procedimiento de maceración y siembra en el medio de cultivo. Con los huevos de Ae. aegypti, cepa Riohacha, La Guajira-Colombia, utilizados en el presente trabajo para la obtención de cultivos primarios, el tiempo óptimo de incubación fue de 3 a 4 días; sin embargo, en los días anteriores o posteriores a este rango, hubo dificultades para lograr la adaptación y el crecimiento celular.

Otros factores tenidos en cuenta en la obtención de cultivos celulares primarios, no menos importantes que el anterior, para lograr crecimiento celular a partir de los tejidos embrionarios, fueron el número de huevos utilizados en cada explante y las condiciones físico-químicas adecuadas de los medios de cultivos, donde éstos -después de macerados- se sembraron. En los primeros dos meses de experimentos, el número de huevos empleados fue de 450, aproximadamente, en cada explante, debido a la poca eficiencia que registraba la colonia en ese período; se observó dispersión de los tejidos en la superficie del frasco en la evolución de los cultivos primarios y limitadas posibilidades de las colonias celulares en su crecimiento para alcanzar la confluencia de la monocapa; sin embargo, al aumentar la densidad de la población del mosquito, en condiciones de laboratorio, las posturas se incrementaron y fue posible tomar 650 a 700 huevos, en promedio, para cada explante de tejidos, lo cual está en concordancia con las cantidades utilizadas en trabajos previos (17,44).

Aunque el crecimiento celular se inició a las tres semanas después de la siembra de los tejidos embrionarios en el medio L-15/Grace, la primera monocapa confluente en los cultivos primarios sólo se obtuvo a los 6 meses. Si bien, esta característica de crecimiento lento de las células, en la etapa de iniciación de los cultivos, ha sido común al utilizar otras especies de mosquitos (14,16,17,45,46), probablemente, también contribuyó a la interferencia del crecimiento celular la adición de albendazol al medio de cultivo, usado durante un tiempo prolongado. Esta droga fue empleada porque previamente había demostrado actividad contra microsporidios, tanto en ensayos in vitro de infecciones inducidas (47-49), como en infecciones naturales de embriones utilizados en explantes para obtener cultivos celulares (16). Sin embargo, después de descartar contaminación de los cultivos con parásitos, el fármaco disuelto en dimetilsulfóxido (DMSO) fue suspendido. Se asumió que estas partículas correspondieron a subproductos metabólicos, secretados por las células en respuesta, probablemente, a deficiencias nutritivas; varios meses después de que las células se adaptaron y pudieron asimilar todos los requerimientos aportados por el medio, no se volvieron a formar.

Los cultivos celulares, en el presente trabajo, tuvieron una lenta evolución, los cuales, aunque se han mantenido a través de 28 subcultivos y se han congelado algunos de ellos, no permiten señalar con certeza que estamos en presencia de una línea celular establecida. Es posible que en los próximos subcultivos se acelere el crecimiento o, por el contrario, como se ha registrado en otros cultivos celulares de mosquitos (15), se presente una fase crítica, en la cual haya un gran porcentaje de muerte celular y, luego, las que sobrevivan, por selección y transformación genética a través de varias generaciones de subcultivos, entren a la etapa de crecimiento continuo para, finalmente, establecer la línea.

En los cultivos primarios, las formas de las células fueron variadas, lo cual se explica por los diversos tipos de tejidos disponibles a partir de los huevos embrionados utilizados en los explantes, quedando configurados de esta manera cultivos mixtos. En forma similar, en trabajos previos, se ha registrado la heterogénea morfología celular en la iniciación de cultivos in vitro en esta misma especie (8-10), al igual que en otros mosquitos (14,17,22,23,45). Sin embargo, en los cultivos celulares de insectos, después de muchos subcultivos en serie existe la tendencia al predominio de una determinada forma celular, la cual se mantiene indefinidamente en la línea. En el presente trabajo, las formas dominantes fueron epitelioides y fueron diferentes a las establecidas en las líneas celulares Mos. 20 y 29, derivadas de tejidos larvarios de Ae. aegypti, en las cuales la morfología celular mayoritaria en ambas fue fibroblastoide (13).

El cariotipo obtenido a partir de cultivos primarios y subcultivos celulares de Ae. aegypti, presentó en el 65% un número diploide de 6 (2n=6), en los cuales el par 1 fue el sexual, de menor tamaño y metacéntrico, el par 2 de mayor tamaño y metacéntrico, en tanto que el par 3 fue de tamaño intermedio y ligeramente submetacéntrico, lo cual está de acuerdo con la nomenclatura del cariotipo de la especie, establecida por Rai (51) y McDonald y Rai (52). También se registraron poliploidías (16%) y aneuploidías (19%). Las primeras fueron identificadas como triploidías y tetraploidías, en tanto que las aneuploidías correspondieron a monosomías y trisomías. Los anteriores porcentajes de anormalidades cromosómicas fueron altos, si se tiene en cuenta que se obtuvieron de cultivos primarios y de subcultivos en la serie baja, en la cual no hubo evidencia de un acelerado crecimiento celular; es probable que esta situación se haya presentado como consecuencia de la adición de DMSO a los cultivos, el cual se caracteriza como un agente alquilante y mutágeno (53).

Los resultados de los patrones electroforéticos con base en cuatro sistemas mostraron coincidencias entre los cultivos celulares y las formas adultas de Ae. aegypti, pertenecientes a la colonia, en los sistemas PGI, 6-PGDH e ICDH y, contrariamente, fueron diferentes en PGM. Lo anterior se explica porque en los tres primeros sistemas los cultivos celulares continuaron siendo representativos de la especie y no sufrieron ninguna variación genética con respecto a los tejidos originarios, en tanto que para PGM, las muestras de adultos presentaron cambios en este marcador, y mostraron la forma homocigota, probablemente, debido a las fuertes presiones selectivas ocurridas durante el proceso de la colonización, con pérdida y fijación de alelos (54); mientras los cultivos celulares retuvieron la heterocigocidad inicial, que se supone tenían las muestras de huevos embrionados, tomados 14 meses antes del uso de los adultos de la misma cepa en la técnica de electroforesis. Por otra parte, la comparación entre los cultivos celulares y las líneas celulares Lulo y PC-0199, con base en los cuatro sistemas isoenzimáticos, produjo resultados diferentes y característicos para cada una de ellos, lo cual permitió descartar contaminación cruzada de los cultivos celulares analizados.

La caracterización molecular, desarrollada con la técnica RAPD-PCR, generó perfiles de AND idénticos entre los cultivos celulares y muestras de adultos de Ae. aegypti en la amplificación de tres iniciadores (A10, A20 y E07) y sólo en A2 hubo diferencias en el número de fragmentos obtenidos; sin embargo, coincidieron en el tamaño de éstos donde fueron comunes. De acuerdo con Léry et al. (55), los cultivos celulares de insectos no están sujetos a pérdida en la evolución de los cultivos primarios de material genético y reflejan la diversidad alélica de las poblaciones naturales de la cual se derivan; por esta razón, la técnica empleada es útil para distinguir líneas celulares obtenidas de especies filogenéticamente relacionadas y aun entre líneas celulares de la misma especie. La comparación de los perfiles de RAPD entre los cultivos celulares del presente trabajo con la línea Lulo mostró diferencias en el número de fragmentos amplificados como también en el tamaño de los mismos, lo que corrobora de esta forma la diversidad genética existente entre ellas.

Los cultivos celulares derivados de Ae. Aegypti descritos en el presente trabajo representan un sistema in vitro importante, potencialmente útil en aplicaciones biomédicas, los cuales se utilizarán, en una primera fase, en ensayos de susceptibilidad a infecciones con arbovirus, principalmente dengue y fiebre amarilla, también en cocultivos con parásitos para el mantenimiento o desarrollo del ciclo biológico de patógenos.

A Gilberto Torres, auxiliar del Laboratorio de Entomología de la Universidad de La Salle, por el suministro del material entomológico utilizado en esta investigación. A Gloria Patricia Barrera, directora del Laboratorio de Microscopía Electrónica de Corpoica-Ceisa, por el apoyo brindado en el procesamiento de las muestras con la técnica de microscopía electrónica de transmisión. A Jairo Tovar, investigador del Laboratorio de Biología Celular y Neurociencias de la Pontificia Universidad Javeriana, por la colaboración en el desarrollo de la tesis de maestría del primer autor, cuyos resultados se presentan en este artículo.

El presente trabajo fue financiado por la Universidad de La Salle (PIN-07-2002).

Correspondencia:

Felio J. Bello, Departamento de Ciencias Básicas,

Universidad de La Salle, Carrera 2 No. 10-70, Torre A, piso 5, Bogotá, D.C., Colombia.

Teléfono: (571) 353 5360, extensión 2504; fax: (571) 2868391.

Recibido: 23/06/04; aceptado: 20/01/05

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