1Departamento de Ciencias Básicas, Escuela de Medicina, Facultad de Salud, Universidad Industrial de Santander, Bucaramanga, Colombia
2 Â Grupo de Investigación Cáncer en Santander, Universidad de Santander, Bucaramanga, Colombia
3 Â Grupo de Investigación Genética Humana, Universidad Industrial de Santander, Bucaramanga, Colombia
Recibido: 19/05/08; aceptado:16/10/08
Introducción. El cáncer de mama es un problema de salud pública a nivel mundial y en Santander es la primera causa de morbimortalidad por cáncer en mujeres. Todo cáncer se considera una enfermedad genética y las mutaciones en los genes BRCA confieren un riesgo de 60% a 80% para el cáncer de mama. Este estudio consistió en buscar las dos mutaciones BRCA1 más frecuentes según la base de datos Breast Cancer Core Information.
]]> Objetivo. Determinar la presencia de mutaciones específicas (185delAG, exón 2, y 5382insC, exón 20) en el gen BRCA1 en mujeres con cáncer de mama heredo-familiar, atendidas en los diferentes servicios de oncología de Bucaramanga, Colombia.Materiales y métodos. La muestra incluyó 30 pacientes, de las cuales se obtuvo un consentimiento informado, un cuestionario dirigido y sangre venosa para los estudios moleculares. El análisis molecular se realizó mediante PCR-mismatch, para introducir o eliminar sitios de restricción, y digestión enzimática (HinfI o DdeI).
Resultados. No se detectaron dos de las mutaciones más frecuentes en el gen BRCA1 en las 30 pacientes estudiadas.
Conclusión. Se requieren más estudios en la región que abarquen la tamización de la totalidad del gen BRCA1, para hacer una mayor contribución al conocimiento de la epidemiología molecular del cáncer de mama en Bucaramanga, Santander, Colombia.
Palabras clave: neoplasias de la mama/genética, genes relacionados con las neoplasias, genes supresores, genes BRCA1, mutación de línea germinal, predisposición genética a la enfermedad.
Mutations in the BRCA1 gene (185delAG and 5382insC) are not present in any of the 30 breast cancer patients analyzed from eastern Colombia
Introduction. Breast cancer is considered a worldwide public health problem, and, in Santander Province, Colombia, it is the first leading cause of morbidity and mortality by cancer in women. All cancers are considered genetic diseases, and mutations in BRCA (BReast CAncer) genes raises the risk for breast cancer by 60%-80%. The current study searched for the two most frequent BRCA1 mutations reported in the Breast Cancer Core Information database.
Objective. The presence of specific mutations (185delAG, exon 2 and 5382insC, exon 20) was determined for the BRCA1 gene in women with familial/hereditary breast cancer.Â
Materials and methods. The sample included 30 female patients using the oncology services in Bucaramanga, eastern Colombia; an informed consent, a questionnaire and a blood sample were obtained from each. The molecular analysis was done with PCR-Mismatch, to detect the insertion or eliminatation of a restriction site, and enzymatic digestion methods (HinfI or DdeI).
Results. Two of the most frequent BRCA1 mutations in the international database were not found in the 30 patients studied.
]]> Conclusion. Additional mutation screening techniques are necessary involving the entire BRCA1 gene, are necessary in order to better characterize the molecular epidemiology of breast cancer in Bucaramanga, Santander, Colombia.Key words: Breast neoplasms/genetics; genes, neoplasm; genes, suppressor; genes, BRCA1; germ-line mutation, genetic predisposition to disease.Â
El cáncer de mama se considera un problema de salud pública en el mundo y constituye la primera causa de morbilidad por cáncer, 22% (1), y la segunda causa de mortalidad, 15%, en mujeres (2). En Santander, entre el 2000 y el 2004, la incidencia de cáncer de mama fue de 32,6 por 100.000 mujeres y la de cuello uterino fue de 19,8 por 100.000 mujeres (3).
El cáncer es una enfermedad multifactorial de base genética y para el cáncer de mama se ha identificado una serie de alteraciones genéticas en genes de baja y alta penetrancia. Los genes de alta penetrancia BRCA1 (4) y BRCA2 (5) son responsables de la mayoría de los cánceres de mama familiares/hereditarios; estos últimos constituyen del 5% al 10% del total de cánceres de mama (6) y en este grupo de pacientes la enfermedad se manifiesta en edades tempranas, de forma bilateral y asociada a cáncer de ovario (7).
La frecuencia de mutaciones BRCA1 en cánceres de mama hereditarios depende del número de afectados y de la presencia adicional de cáncer de ovario en las familias; Ford et al. determinaron que 32% de las familias con cuatro afectados de cáncer de mama estaban ligadas al gen BRCA1 y que, cuando se adiciona al menos un caso de cáncer de ovario, este valor aumenta hasta 69% (8). Las mutaciones en los genes BRCA1 y BRCA2, aumentan la probabilidad de sufrir cáncer de mama en 60% a 85% (8).
Se han identificado más de 600 mutaciones en cada uno de estos genes, lo que se debe a su gran tamaño; están conformados por 24 regiones (22 codificantes y 2 no codificantes), el gen BRCA1, y 27 regiones (26 codificantes y uno no codificante), el gen BRCA2. Según la base de datos de mutaciones BRCA en cáncer de mama, Breast Cancer Information Core (BIC) del National Human Genome Research Institute/Nacional Institutes of Health (NHGRI/NIH, Bethesda), en total, las mutaciones más reportadas en este gen son la 185delAG, exón 2, con una frecuencia de 16,4% (1,980/12,014) y la 5382insC, exón 20, con una frecuencia de 8,8% (1,063/12,014); las demás mutaciones que les siguen en frecuencia se presentan en menos de 2% cada una (9).
El origen de las mutaciones 185delAG y 5382insC se ha calculado en 46 y 38 generaciones, respectiva-mente, en judíos ashkenazi’s, sefarditas y del Medio Oriente (Irán e Irak) desde antes de la primera dispersión judía, los cuales comparten un ancestro común. En la segunda dispersión judía, aquéllos establecidos en España (sefarditas) que migraron hacia el continente americano, podrían haber sido ya portadores de estas mutaciones; es similar el caso de los judíos que se asentaron en Alemania y más tarde en otros países de Europa Oriental (ashkenazi’s) (10-12).
Las inmigraciones de españoles a Colombia desde el descubrimiento de América y de alemanes a partir del siglo XIX a Santander junto con Geo von Lengerke, han sido bien documentadas y podrían indicar la presencia de estas mutaciones en nuestra población. Estas dos mutaciones se han encontrado como fundadoras en población judía ashkenazi (13,14) con unas frecuencias de 32,3% (185delAG) y 6,5% (5382insC) en familias con cáncer de mama heredo-familiar (15). Además, la mutación 185delAG se ha hallado en Estados Unidos (16,17), España (11,18) y Chile (19,20), mientras que la mutación 5382insC se ha encontrado en Alemania (21), Italia (22,23) y Polonia (24), entre otros países europeos (es la mutación más frecuente en este continente), y en población latina en Brasil (25).
En Colombia el único reporte publicado a la fecha consistió en el estudio de 53 familias colombianas con cáncer de mama u ovario hereditarios, en las cuales las mutaciones 3450delCAAG y A1708E del gen BRCA1 representaron el 100% de las mutaciones halladas en este gen, pero no se encontró ninguna de las dos mutaciones más frecuentes, según el BIC (26).
Mediante estudios sobre variabilidad genética en poblaciones de los departamentos de Santander y de Norte de Santander, usando marcadores haplotípicos, se determinó a partir del ADN mito-condrial (mtADN) que la contribución femenina está dada principalmente por mujeres nativas de Santander (92,9%); mientras que, a partir del cromosoma Y, se determinó que el aporte masculino está representado en su mayoría por linajes europeos (86,6%). En esa contribución europea se encontraron marcadores genéticos judíos en 12,7%, de los cuales, 7% correspondió al haplotipo Cohen, perteneciente al apellido judío más antiguo, Cohanim, que se encuentra tanto en judíos ashkenazi como en judíos sefarditas (comunicación personal, María Mercedes Torres).
]]> Los orígenes de estas mutaciones y su gran frecuencia, la historia migratoria de nuestra región y los estudios de linajes mediante la tipificación haplotípica, motivaron el desarrollo de esta investigación.En este estudio se buscaron las dos mutaciones reportadas con más frecuencia en el gen BRCA1 según la base de datos BIC, en un grupo de mujeres con cáncer de mama de Bucaramanga, Santander, con antecedentes familiares de cáncer de mama, ovario u otro tipo de cáncer relacionado con mutaciones en el gen BRCA1.
Materiales y métodos
Pacientes
Se llevó a cabo un estudio descriptivo de 30 casos de cáncer de mama en mujeres provenientes del departamento de Santander, Colombia, atendidas en cinco centros oncológicos.
La recolección se hizo entre marzo del 2006 y marzo del 2007, con los siguientes criterios de inclusión: i) mujeres de cualquier edad con diagnóstico clínico e histopatológico de cáncer de mama; ii) tener, al menos, un antecedente familiar en primero o segundo grado de cáncer de mama, ovario u otro tipo de cáncer relacionado con este gen como: cáncer de estómago, próstata, colon, útero o vía biliar (hígado, vesícula biliar, páncreas) (27-30), y iii) pacientes con cáncer de mama diagnosticado a los 36 años o antes, aun sin antecedentes familiares de cáncer en general. El criterio de exclusión fue el parentesco entre las participantes.
El proyecto fue aprobado por el Comité de Ética de la Universidad Industrial de Santander-Hospital Universitario de Santander y todas las pacientes firmaron un consentimiento informado.
Se diseñó un cuestionario dirigido para recopilar datos personales relacionados con factores sociodemográficos, antecedentes clínicos y antecedentes familiares.
Análisis genético
El análisis consistió en determinar la presencia o ausencia de las dos mutaciones más frecuentes en el gen BRCA1. El ADN se extrajo por salting out a partir de 4 ml de sangre periférica anticoagulada con EDTA (31).
]]> PCR-mismatch: esta técnica molecular se ha usado previamente para la búsqueda de las mutaciones específicas de interés en este estudio (15,21), que consiste en usar un cebador con un cambio de base en su secuencia (cuadro 1) para incluirlo en los amplificados, creando o eliminando un sitio de restricción para una enzima determinada. La amplificación de ambos exones se hizo por separado en una mezcla de reacción con volumen final de 50 µl, que contenía una concentración final de ADN 50 ng/µl, MgCl2 (1,5 mM), dNTP (0,2 mM cada uno), cebadores (0,4 µM cada uno) y 0,2 U de Tucan Taq polimerasa (Corporación Corpogen, Bogotá, Colombia). Los ciclos de amplificación fueron para el exón 2:desnaturalización inicial a 94 °C durante 3 minutos, 30 ciclos (desnaturalización a 94 °C durante 30 segundos, hibridación a 55 °C durante 30 segundos y extensión a 72 °C durante 30 segundos), seguido de una extensión final a 72 °C durante 10 minutos y temperatura final de 4 °C. Las condiciones para el exón 20 fueron similares a las usadas para el exón 2, pero con una temperatura de hibridación de 61 °C durante 30 segundos.Digestión enzimática: esta técnica complementa la anterior (PCR-mismatch) y consiste en que los amplificados obtenidos con el mismatch se someten a un proceso de digestión con determinadas enzimas para el reconocimiento del sitio de restricción, lo que permite diferenciar un alelo normal de uno mutado. Para la mutación 185delAG, se usó la enzima HinfI (37 °C durante 20 horas) y, para la mutación 5382insC, la enzima DdeI (37 °C durante 16 horas).
Los fragmentos se analizaron en gel de agarosa de bajo punto de fusión (LMP, low melting point) al 4%. Para el alelo normal del exón 2, se observó un fragmento digerido de 150 pb y, para el alelo mutado, un fragmento de 168 pb (15) (cuadro 1). Para el alelo normal del exón 20 se observó un fragmento digerido de 214 pb y, para el alelo mutado, un fragmento de 235 pb (21) (cuadro 1). La actividad de las enzimas se probó con la digestión del plásmido PUC18 y del ADN directo. Como controles positivos se usaron muestras con las respectivas mutaciones, donadas por el Laboratorio NE Thames, UK. Como control negativo se usó el ADN extraído a partir de la línea celular MCF-7 (ATCC Nº HTB-22TM) (32). Para confirmar los hallazgos negativos del exón 2, cuatro muestras elegidas al azar se analizaron mediante secuenciación directa en el Laboratorio de la Universidad de Porto, IPATIMUP, Portugal. La secuenciación de la totalidad del gen, incluyendo el exón 20 en esta cohorte, está pendiente para futuros trabajos.
Resultados
Se incluyeron 30 pacientes, con un promedio de edad al momento del diagnóstico de 49,6 años, de las cuales, 16,7% (5/30) eran menores de 37 años (27 a 36 años). El 43,3% (13/30) de las pacientes pertenecía a estrato socioeconómico bajo. Tres pacientes refirieron una edad de la menarquia a los 11 años o menos. La tercera parte consumió hormonas exógenas, como anticonceptivos orales o terapia de reemplazo hormonal, por un periodo comprendido entre ocho meses y 18 años (6,52 años en promedio). Un porcentaje significativo de mujeres tuvieron su primer parto antes de los 20 años (43,3%). El número de embarazos a término más frecuente entre las pacientes fue de tres y cuatro (14/30; 46,6%) y dos pacientes de 27 y 59 años refirieron ser nulíparas.
Con respecto a la historia familiar, cuatro de las cinco pacientes menores de 37 años no reportaron familiares afectados por ningún tipo de cáncer. El 86,7% (26/30) de las pacientes tenían, al menos, un antecedente de cáncer de mama, ovario u otros cánceres relacionados con mutaciones en el gen BRCA1; de éstas, 20% (6/30) tenía sólo antecedentes familiares de cáncer de mama, 26,7%(8/30) tenían familiares afectadas por cáncer de mama y por otros tipos de cáncer relacionados y 40% (12/30) de las pacientes refirieron sólo familiares afectados por otros tipos de cáncer diferente al de mama, relacionados con mutaciones en el gen BRCA1, como: cáncer de estómago, próstata, colon, útero o vía biliar (hígado, vesícula biliar, páncreas), algunos de los cuales incluyeron, además, otros cánceres como leucemias, cáncer de nariz, cuello uterino, sistema nervioso central, tiroides, pulmón, tejidos blandos-piel, y otros no especificados. Sólo una paciente (número 17), de 52 años al momento del diagnóstico, presentó un familiar afectado con cáncer de ovario (cuadro 2).
En cuanto a las características clínicas, el reporte mamográfico BIRADS IV, indicador de sospecha para malignidad de la mama, fue el más frecuente (66,7%) y en 43,3% de las pacientes el estadio al momento del diagnóstico fue E IIIB.
De acuerdo con los resultados correspondientes al análisis molecular del exón 2, no se evidenciaron mutaciones; en todos los casos se observó una banda a la altura de 150 pb correspondiente al alelo normal (figuras 1A y 1B). La negatividad de la muestra 004 (flecha roja) se corroboró mediante secuenciación directa (figura 2). En el análisis correspondiente al exón 20, tampoco se encontró mutación y en todos los casos se observó una banda de 214 pb correspondiente al alelo normal (figuras 3A y 3B).
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Discusión
Debido al alto riesgo para cáncer de mama y ovario asociado a mutaciones en los genes BRCA1-2, su análisis molecular se ha popularizado, especialmente en los grupos de alto riesgo para la enfermedad que son, principalmente, aquéllos con múltiples antecedentes familiares de cáncer de mama u ovario, pero también en los casos de cáncer de mama de aparición temprana, bilateralidad del tumor primario, y cáncer de mama y ovario en la misma persona (33).
En esta cohorte de pacientes con cáncer de mama, 86,7% tenían, al menos, un familiar en primero o segundo grado afectado por cáncer de mama, ovario u otro tipo de cáncer relacionado con BRCA1 (27-30) y 13,3% correspondía a pacientes con cáncer de mama diagnosticado antes de los 37 años, sin historia familiar; todos los anteriores se tomaron como indicadores de una posible susceptibilidad heredo-familiar (cuadro 2).
En otros estudios se han usado criterios similares, por ejemplo, Ikeda et al. (34) incluyeron pacientes con cáncer de mama con, al menos, un familiar en primer grado con cáncer de mama o cáncer de ovario, para el análisis de genes BRCA en población japonesa, y encontraron mutaciones BRCA1 en 13,3% (15/113) de las pacientes; en otros, como el realizado en el Reino Unido por Peto et al. (35), se analizaron 254 pacientes con cáncer de mama de aparición temprana, antes de los 36 años, y encontraron mutaciones BRCA1 en 3,5% (9/254), de los cuales, la mutación 5382insC correspondió a 0,4% (1/254). A su vez, en el estudio realizado por Ruiz-Flórez et al. (36) se incluyó a 32 mujeres mexicanas con cáncer de mama diagnosticado a los 35 años o antes y se encontraron mutaciones BRCA1 en 3,13% (1/32).
En términos de resultados del análisis molecular, en nuestra cohorte de pacientes no se encontró la mutación de interés (185delAG) en el exón 2. En otro estudio realizado por Trincado et al. en Chile (37), en el que incluyeron 15 pacientes con cáncer de mama familiar y 40 de tipo esporádico, tampoco se encontró esta mutación. Sin embargo, en estudios más recientes en esta misma población, se logró identificar la mutación en bajas frecuencias. Jara et al. (20) analizaron esta mutación en 382 mujeres sanas con, al menos, dos familiares afectados por cáncer de mama, y encontraron una frecuencia de 0,26% (1/382) y, posteriormente, Jara et al. (19) la encontraron en 3,12% (2/63) de familias seleccionadas por criterios de alto riesgo para la enfermedad.
La mutación 5382insC del exón 20, BRCA1, tampoco se encontró en las 30 pacientes incluidas en este estudio. En Latinoamérica se han llevado a cabo algunos estudios en su búsqueda, como lo hicieron Jara et al. (38) quienes no encontraron la mutación en 382 mujeres sanas con, al menos, dos familiares afectados por cáncer de mama. Por su parte, Dufloth et al. (25), en una muestra de 31 pacientes de Brasil, con cáncer de mama e historia familiar, encontraron la mutación en 3,2% (1/31).
En Colombia, el estudio realizado por Torres et al. evidenció dos mutaciones fundadoras en el gen BRCA1 en 8/53 familias de alto riesgo para cáncer de mama (según el análisis de haplotipos), previamente reportadas en el BIC en poblaciones europeas y latinoamericanas; sin embargo, ninguna de éstas corresponden a las más frecuentes en esta base de datos. De otra parte, los hallazgos del presente trabajo muestran que las mutaciones más frecuentemente reportadas en el BIC no se encontraron, lo que apoya la necesidad de realizar tamizaciones genéticas que abarquen la totalidad del gen BRCA1.
Con respecto a las características histopatológicas y clínicas de esta cohorte, se encontró que el tipo histopatológico más frecuente fue el carcinoma ductal (76,7%), acorde con el 77,6% reportado en la literatura (39). El 60% de las pacientes analizadas fueron diagnosticadas en E IIIA (16,7%) y IIIB (43,3%), lo cual indica que, lastimosamente, en nuestro medio se sigue detectando el cáncer de mama en etapas muy avanzadas, cuando las posibilidades de supervivencia y curación están reducidas; lo anterior corresponde con el 71,5% reportado en estudios locales (39).
Con respecto a los receptores hormonales, se observó que en 46,7% de los tumores los receptores de estrógenos y progestágenos fueron negativos y que en 30% fueron positivos. Esto habría sido interesante verlo desde la perspectiva de la presencia de mutaciones en los genes BRCA1 o BRCA2, ya que estudios como el llevado a cabo por Palacios et al. lograron relacionar de forma significativa los tumores BRCA1 positivos con la negatividad de los receptores hormonales (receptores de estrógenos, p=0,001, y progestágenos, p=0,002) mediante análisis inmunohistoquímicos de tejidos de cáncer de mama (40); esto corresponde con las características fenotípicas de tumores BRCA1 ya descritas como de tipo epitelial basal y de alto grado.
]]> Aunque en este estudio en particular el grado histológico Bloom-Richardson más frecuente fue moderado (46,7%), valdría la pena extender el análisis mutacional en esta cohorte de pacientes, no sólo a la totalidad del gen BRCA1 sino también al BRCA2, dadas las características inmunohistoquímicas ya referidas.Teniendo en cuenta que las edades promedio de diagnóstico (49,6 años) y de la menopausia (49,8 años) coinciden en esta cohorte, es decir, que el diagnóstico se hizo alrededor de los 50 años o antes, y que la mayoría de cánceres de mama en general se desarrollan en la posmenopausia (el riesgo aumenta con la edad), se puede apoyar con nuestra muestra que cuando existe una historia familiar de cáncer de mama o de otros tipos, la edad de presentación es más temprana en los nuevos afectados; esto estaría a favor de una susceptibilidad genética de tipo hereditaria.
La prevalencia de mutaciones en los genes BRCA depende de la población estudiada, los criterios de selección de las pacientes y los métodos de análisis moleculares empleados. Para la realización de este estudio, se empleó el método de PCR-mismatch, ya descrito en otras poblaciones como Chile, Alemania y ashkenazis (15,20,21,38); el método de PCR-mismatch en este estudio resultó ser sencillo de realizar y de analizar, más aun, fue reproducible y se pudo validar para el exón 2 mediante secuenciación directa. Otros métodos pueden usarse en el abordaje de los genes BRCA y su elección debe basarse en el tipo de mutación que se quiera buscar y en la sensibilidad que se quiera obtener en el proceso.
En los estudios realizados hasta la fecha no se han identificado otros genes de alta penetrancia diferentes a los BRCA; teniendo en cuenta que estos genes explican sólo una proporción de los cánceres de mama heredo-familiar, se propone que este cáncer es poligénico y que existirían muchos loci involucrados en su desarrollo, de los cuales, cada uno tendría un pequeño efecto en el riesgo para la enfermedad.
Easton et al. (41) identificaron cinco loci relacio-nados con el cáncer de mama en un estudio de asociación mediante polimorfismos de nucleótido único (single nucleotide polymorphisms, SNP), en el que se determinaron posibles genes causales, en su mayoría relacionados con mecanismos de control del crecimiento celular y señalización, en familias con dos o más casos de cáncer de mama en primer grado; este hallazgo genera nuevas expectativas con respecto a la investigación en genética del cáncer de mama, pues, a diferencia de este estudio, los anteriores se centraron en analizar genes de reparación y síntesis, y del metabolismo de hormonas sexuales.
Este estudio pretende motivar a la comunidad científica para continuar con la investigación de los aspectos moleculares del cáncer de mama, dirigida especialmente a la población de riesgo para la enfermedad, con el objeto de ofrecer un abordaje más integral y brindar mayores posibilidades de supervivencia y una mejor calidad de vida e, incluso, de curación.
Para el desarrollo de próximos estudios, se recomienda que se tengan en cuenta los criterios de inclusión de alto riesgo para ser portador de mutaciones en estos genes, como los manejados por U.S. Preventive Services Task Force (42) y por Stoppa-Lyonnet (43); la U.S. Preventive Services Task Force considera “al menos dos familiares en primer grado con cáncer de mama y/o cáncer de ovario†y, Stoppa-Lyonnet, “dos familiares en primer grado afectados: uno o más con cáncer de mama antes de los 41 años o con cáncer de ovario a cualquier edad; tres o más familiares en primer o segundo grado con cáncer de mama u ovarioâ€.
Asimismo, se sugiriere lo siguiente: i) ampliar el tamaño de la muestra con el objetivo de obtener resultados con mayor significancia estadística; ii) estudiar una mayor proporción del gen BRCA1 e incluir el gen BRCA2, con el fin de lograr la caracterización de su perfil genético en la población de riesgo, y iii) contemplar, en los análisis moleculares en familias de cáncer de mama, el estudio no sólo de genes de alta penetrancia (BRCA, PTEN, ATM, P53), sino de nuevos genes identificados como asociados a esta patología en familias de alto riesgo.
Según nuestro conocimiento, éste es el primer estudio sobre cáncer de mama heredo/familiar en Bucaramanga, Santander, que pretende indagar sobre los aspectos genéticos relacionados.
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AgradecimientosAgradecemos a David Cregeen del NE Thames Regional Molecular Genetics Lab, London, UK, por su colaboración en cuanto a las técnicas de laboratorio y donación de controles positivos; a Adriana Castillo y al personal del Laboratorio de Genética de la Universidad Industrial de Santander, a la Junta Médica-Oncológica del Hospital Universitario de Santander y a todas las pacientes que participaron en el estudio y a sus familias.
Los autores declaramos que no existe conflicto de intereses.
Maestría en Ciencias Básicas Biomédicas y Laboratorio de Genética de la Universidad Industrial de Santander
Correspondencia: María Carolina Sanabria, Departamento de Ciencias Básicas, Escuela de Medicina, Facultad de Salud, Universidad Industrial de Santander, Carrera 32 No. 29-31, Bucaramanga, Santander, Colombia. Teléfax: (577) 645 5693 mariakmd24@yahoo.com
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