DNA Repair: A Link Between Folate Deficiency and Neuronal Cell Death

NELSON J. RAMÍREZ¹, B.Sc.; GONZALO ARBOLEDA², MD., Ph. D.; HUMBERTO ARBOLEDA³, MD., M.Sc. ¹Grupo de Neurociencias. Universidad Nacional de Colombia. Sede Bogotá, ciudad universitaria, Carrera 30 No. 4503. AA. 14490. Bogotá, Colombia. Autor Correspondencia: njramirezs@unal.edu.co ²Departamento de Patología Grupo de Neurociencias, Facultad de Medicina. Universidad Nacional de Colombia. Sede Bogotá, ciudad universitaria, Carrera 30 No. 4503. AA. 14490. Bogotá, Colombia. ³Departamento de Pediatría Grupo de Neurociencias, Facultad de Medicina. Universidad Nacional de Colombia. Sede Bogotá, ciudad universitaria, Carrera 30 No. 4503. AA. 14490. Bogotá, Colombia. Teléfono: 316 50 00, ext.11613. Fax: 316 55 26

Presentado 6 de diciembre de 2006, aceptado 28 de marzo 2007, correcciones 22 de mayo de 2007.

RESUMEN

El presente artículo explora el papel que desempeña el folato como conocido metabolito del ciclo de un carbono (OCM, del inglés onecarbon metabolism) en la alteración de la integridad de las células nerviosas. Aquí se discute evidencia reciente de la literatura que muestra la reparación del ADN como un proceso relacionado con la apoptosis neuronal inducida por ausencia de folato.

Palabras clave: apoptosis, metabolismo, ADN glicosilasas, deficiencia de ácido fólico, reparación del ADN.

ABSTRACT

This essay explores the role of folate in disruption of neural cell integrity. Here, it is discussed recent evidence which shows DNA reparation as a process related to neuronal apoptosis induced by folate depletion.

Key words: Apoptosis, metabolism, DNA glycosylases, Folic Acid, DNA Repair.

El folato es la materia prima en el metabolismo de un carbono (OCM, del inglés onecarbon metabolism), proceso implicado en la síntesis y reparación del ADN y diversas reacciones de metilación. El folato adquirido en la dieta es la única fuente para los requerimientos del OCM, por lo tanto variaciones en su ingesta afectan el balance de productos intermediarios, entre ellos el aminoácido homocisteína conocido por sus efectos tóxicos en las células a altas concentraciones. Se cree que las alteraciones en el OCM conducen a apoptosis neuronal por diferentes vías: (i) incrementando los niveles de homocisteína extracelular (Lipton, 1997; Ho et al., 2002); (ii) alterando el proceso de metilación (Ulrey et al., 2005) y (iii) influenciando la síntesis de ADN a través de un desequilibrio en la proporción de los precursores (Fenech, 2001). Los dos primeros representan procesos patológicos bien documentados en disfunción neuronal y muerte celular. Sin embargo, en un estudio reciente (Krumann et al., 2004) es reportado el papel del desequilibrio en los precursores del ADN que ocurre en la alteración del OCM y su relación con apoptosis. Este desajuste consiste en el bloqueo de la síntesis de purinas y timidina, lo cual conduce a la acumulación de dUTP y al mismo tiempo a un incremento en la incorporación errada de dUMP durante la replicación y reparación. El estudio examina si la supresión específica de una glicosilasa de ADN (UracilDNA glicosilasa, UNG EC 3.2.2.3) que corrige estos errores en el ADN, induce apoptosis neuronal.

En el primer conjunto de experimentos se muestra como el knockdown para la expresión de UNG induce muerte celular en neuronas hipocampales embrionarias de rata. Es interesante como después del uso de Oligonucleotidos Antisentido (ASO, del inglés antisense oligonucleotide) para disminuir la expresión de la UNG humana por pocas horas (39 h), el número de neuronas continúa disminuyendo aún cuando los niveles de proteína (immunoblot) y mRNA (RTPCR) fueron recuperados después de 12 h. Esto quizás indica que las caspasas fueron inducidas y así la muerte celular ocasionada fue un proceso irreversible. El uso de la técnica de ARN de interferencia (RNAi) como una aproximación alterna a la técnica ASO debería ser considerada. A pesar de que no hay diferencias significativas entre metodologías para la regulación a la baja de un gen (Scherer y Rossi, 2003; Tachikawa et al., 2006), el RNAi presumiblemente toma ventaja de la maquinaria celular específicamente diseñada para una inhibición selectiva del proceso de trascripción del gen escogido; en contraste, ASO actúa por difusión hacia su blanco lo que implica un incremento en la sonda a usarse y en la probabilidad de efectos inespecíficos.

El segundo conjunto de experimentos investiga la validez de la siguiente hipótesis: “la inhibición de la expresión de la UNG causa muerte celular del tipo apoptosis en estos mismos cultivos neuronales”. De los experimentos con el inhibidor de caspasas de amplio espectro zVADfluorometil cetona (zVAD), es posible verificar la implicación de estas proteínas efectoras del proceso apoptótico ya que el inhibidor produce una atenuación considerable en los efectos tóxicos de los antisentidos (AS) para UNG.

Estos resultados sugieren que la apoptosis es el mayor evento involucrado en neuronas UNGsuprimidas. Adicionalmente, la toxicidad de los AS debido a unión con blancos inespecíficos no es apreciable cuando las caspasas son inhibidas o al menos esa toxicidad está bajo el control de caspasas.

La evaluación de la acumulación de p53 en neuronas después de la inhibición de la expresión de UNG fue el objetivo en el siguiente grupo de experimentos. Modificaciones posttrasduccionales son responsables de la estabilización de p53, que juega un papel crítico en la mediación del arresto del ciclo celular, la reparación del ADN y el proceso apoptótico. La fosforilación de p53 en la serina 15 es el evento de estabilización analizado en este conjunto de experimentos, mostrando que la apoptosis inducida por AS para UNG es inducida por un mecanismo dependiente de p53. A este respecto un análisis complementario acerca de las diferentes formas de regulación de p53 (metilación, acetilación, sumoilación o fosforilación en otros residuos) podría ser interesante (Appella y Anderson, 2001). Por ejemplo la metilación de p53 es un buen candidato, resaltando que la adición de grupos metilo es un proceso que se encuentra alterado cuando hay anomalías en el OCM. La actividad de metiltransferasas sobre p53 afectando de manera positiva su estabilidad fue reportada recientemente (Chuikov et al., 2004). Un knockout transgénico para p53 confirmó que la proteína es necesaria para inducir apoptosis neuronal bajo la supresión de UNG; pero sin embargo el knockout y los experimentos de inhibición de p53 no evalúan la estabilización adicional de p53 previamente discutida. Adicionalmente, existe controversia al respecto de la efectividad de la inhibición de p53 por Pifithrin (Komarova et al., 2003; Murphy et al., 2004; Walton et al., 2005), compuesto utilizado en los experimentos de inhibición. A pesar de estas observaciones es claramente demostrada la mediación de p53 en la apoptosis producida por regulación a la baja de UNG.

El ensayo del cometa y el ensayo de inhibición de la poliADPribosa polimerasa (PARP, EC2.4.2.30) fueron las técnicas usadas para la evaluación en el daño del ADN como una causa de la apoptosis neuronal en neuronas reguladas a la baja para UNG. El daño en el ADN es evidente al microscopio debido a la apariencia similar a un cometa del ADN en neuronas expuestas a AS. En otro artículo (Kruman et al., 2000), el mismo grupo de investigación había reportado previamente una secuencia de eventos cuando ocurre activación de las vías apoptóticas por homocisteína; esta progresión tiene diferentes etapas comenzando con daño en el ADN, activación de PARP, activación de caspasas y activación de p53 siguiendo con una disminución en el potencial de membrana mitocondrial y terminando con desintegración nuclear. Allí es reportado un incremento en la muerte por necrosis, cuando hay inhibición de caspasas, en neuronas hipocampales tratadas con homocisteína. Este hecho fue explicado por un incremento en la activación de PARP, enzima que es clivada por caspasas en la muerte celular apoptótica, produciendo depleción de ATP y necrosis. Sin embargo, no se puede excluir que la homocisteina puede causar la muerte de las neuronas por un mecanismo apoptótico independiente de caspasas. En neuronas suprimidas para UNG la sobrevida no estuvo afectada significativamente por el mismo inhibidor de caspasas (zVAD), lo cual es acorde con un papel neurotóxico de la homocisteína.

La demostración de como la alteración del OCM afecta la expresión de UNG in vivo fue llevada a cabo usando un knockout para la CistationinaBetaSintasa (CBS, EC 4.2.1.22), un modelo de hiperhomocisteinemia asociado con incremento en incorporación anómala de dUMP en el ADN vía disminución de las reservas de dTTP. Cambios en la expresión de la UNG en cerebro y timo comparando ratones CBS silvestres y knockouts representan las observaciones más interesantes. La UNG, que es normalmente expresada a altos niveles en timo debido a su alto potencial proliferativo, fue indetectable en el knockout para CBS. En contraste, la expresión de la UNG en el cerebro fue alta en el mutante e indetectable en el silvestre. En células mitóticas, la interpretación de los resultados es que la hiperhomocisteinemia severa y la alteración del OCM bloquean la síntesis de precursores de ADN, lo cual resulta en la inhibición de la actividad de proliferación en los tejidos del ratón knockout. Ya que la expresión de la UNG está bajo el control del ciclo celular y está asociada con la maquinaria de replicación del ADN la supresión de esta maquinaria puede regular a la baja la expresión de la UNG. En el caso de las células postmitóticas, entre ellas las neuronas, la regulación a la alta de la UNG en estos knockouts es posible si este proceso sirve como un mecanismo compensatorio en el cual las células intentan activar un mecanismo de reparación específico cuando la incorporación anómala de uracilo es elevada. Otro estudio en neuronas embrionarias de rata (Vinson y Hales, 2002) mostró que la exposición de estas a metotrexato, una sustancia que inhibe el OCM e incrementa los niveles de homocisteína, incrementa los transcriptos de UNG (3040%) después de 6h de cultivo con 0,5 µM de metotrexato; sin embargo, la expresión y la actividad de la proteína no fue afectada. Con esta evidencia, los experimentos deben ser probados en otros modelos con alteración del OCM (Ernest et al., 2002), con el fin de verificar si existe un cambio real en el nivel de la proteína UNG o en su actividad. La exposición a metotrexato de células progenitoras neurales C17.2 mostró el impacto sobre el OCM y sobre el balance de los precursores del ADN, y adicionalmente muestra una conexión entre alteración del OCM e inhibición de la actividad proliferativa de las células in vitro. El resultado puede ser un poco confuso debido a que el metotrexato incrementa los niveles de homocisteína y desencadena vías apoptóticas y no apoptóticas en las células como fue previamente discutido, enmascarando así el efecto sobre la síntesis de ADN y la proliferación.

La importancia de la UNG en la sobrevida neuronal es demostrada por al menos otros dos estudios (Endres et al., 2004; Imam et al., 2006), pero hay algunas preguntas aún sin responder relacionadas al papel de la UNG y otras glicosilasas en el cerebro. El knockout para UNG sobrevive hasta la adultez y no exhibe un incremento desmesurado en la frecuencia de mutaciones espontáneas (Nilsen et al., 2000); esto podría ser explicado por la presencia de SMUG1 (del inglés, singlestrand selective monofunctional uracil DNA glycosylase EC 3.2.2.) otra uracilo ADN glicosilasa que substituye la actividad en ratones deficientes en la UNG (Nilsen et al., 2001; An et al., 2005). Entonces, ¿Qué ocurre con SMUG1 en neuronas hipocampales?, ¿Existe otra ADN glicosilasa, aparte de aquellas identificadas hasta ahora (Lindahl y Wood, 1999) que puedan sustituir la actividad de UNG en el cerebro?, ¿Están las demás uracilDNA glicosilasa reguladas a la baja en neuronas?

Los estudios acerca de la UNG complementan el punto de vista de los autores con respecto a la asociación entre la neurodegeneración y la activación de la maquinaria del ciclo celular en neuronas postmitóticas (Kruman et al., 2004). Una de las premisas sobre la cual esta tesis está basada, es la interacción entre los factores involucrados en la reparación del ADN y las proteínas que se conoce están asociadas con la maquinara de replicación del ADN. Esta teoría y otras, tales como la que plantea neurogénesis en el cerebro (Scott y Hansen, 1997), han comenzado a descubrir un nuevo campo de investigación cuyo estudio explora el ciclo celular en el sistema nervioso central adulto.

AGRADECIMIENTOS

Agradecemos a la International Brain Research Organization y al Venezuela Neuroscience Course 2005: “BrainEnvironment Interactions” por brindar el contexto académico para desarrollar las ideas acá plasmadas.

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