ESTUDIO MORFOLÓGICO DEL CULTIVO A LARGO PLAZO DE FOLÍCULOS AISLADOS Y CERRADOS DE TIROIDES DE CERDO.
Morphological Study of Long-term culture of closed isolated pig folicles
HERRERA M1, ONDO-MENDEZ A1,2, Est- Ph. D.; BERNAL E1,3, Est- MSc.; SPINEL C1,4, Ph. D.
1Laboratorio de Biofísica, Centro Internacional de Física,
2Departamento de Química, Facultad de Ciencias-Universidad Nacional de Colombia (FC-UN) y Unité CEA UNSA TIRO, Francia.
3 Unidad Ciencias Fisiológicas, Facultad de Medicina-UN.
4Departamento de Biología, FC-UN. Cr 30 No. 45-03, Bogotá, Colombia. cmspinelg@unal.edu.co
Presentado 22 de agosto de 2007, aceptado 18 de octubre de 2007, correcciones 24 de junio de 2008.
RESUMEN
]]> La unidad morfológica y funcional de la glándula tiroides es el folículo, estructura ovoide cerrada, constituida por una capa de células cúbicas (tirocitos) que encierran un lumen lleno del coloide secretado por ellas. En cultivo, tanto la estructura como la función del folículo se pierden rápidamente en las primeras 24 horas. Sin embargo, si se cultivan folículos cerrados de tiroides de rata conservan la arquitectura folicular, la morfología del tirocito y la función hasta la síntesis de hormonas tiroides de manera similar a la glándula in vivo. En este trabajo describimos el aislamiento y cultivo de folículos porcinos cerrados y su análisis morfológico. Los folículos se aíslan por digestión enzimática y disociación mecánica del parénquima tiroideo, luego se cultivan sobre agarosa con y sin hormona tirotrópica o tirotropina (1 mU/ml, TSH). El tejido de tiroides porcino obtenido tiene las mismas características de una glándula hipotiroidea in vivo, un epitelio casi plano, retículo endoplásmico rugoso (RER) exiguo, complejo de Golgi (CG), y microvellosidades escasas y cortas. Los folículos cultivados sin TSH conservan la forma ovoide y el coloide en su interior, y la misma ultra-estructura del tejido in vivo, RER y CG muy escasos, pero con el tiempo de cultivo aumenta la longitud de la microvellosidades y el espesor del epitelio. En presencia de TSH el epitelio se hipertrofia desde el primer día y las cavidades foliculares se reducen considerablemente. Se demuestra que folículos cerrados de tiroides durante ocho días (d) de cultivo conservan su morfología con y sin TSH. Además, estos responden al estímulo de TSH disminuyendo su cavidad folicular y aumentando el espesor del epitelio folicular.Palabras clave: folículo tiroideo cerrado, cultivo tridimensional, hormona tirotrópica o tirotropina.
ABSTRACT
The morphological and functional unit of the thyroid gland is the follicle - an ovoid closed-structure, constituted by a layer of cubical cells (thyrocytes) that lock up a full lumen of the colloid secreted by themselves. In culture, the structures as well as the function of the follicles are lost rapidly in the first 24 hours. However, if the rat thyroid follicles closed are seeded since the beginning of the culture, these conserve the follicular structure, the thyrocyte morphology and the function even as the thyroid hormone synthesis in a similar way to the gland in vivo. This work describes the isolation and the culture of closed swine thyroid follicles and its morphological analysis. The follicles are isolated by enzymatic and mechanic digestion of the thyroid, then they are cultured in agarose with and without thyrotropin (1 mU/ml, TSH). The swine thyroid tissue obtained has the same characteristics of an in vivo hypothyroid gland, an almost flat epithelium, low quantity of Rough Endoplasmic Reticulum (RER) and Golgi complex (GC), short and very scarce microvillus. The isolated and closed follicles cultivated without TSH preserve the ovoid form and the colloid in the lumen, and the same ultrastructure of the thyroid tissue in vivo, RER and GC, but the length of the microvillus as well as the thickness of the epithelium were increased with the culture time. In the presence of TSH the thickness of the epithelium increases from the first day and the follicular cavities reduce considerably. The isolated and closed follicles preserve their morphology in the long term (8 days) of culture with and without the TSH. Besides, they responded to the stimulus of the TSH reducing the follicular cavity.
Key words: Closed thyroid follicle, three-dimensional culture, thyrotrophic hormone.
INTRODUCCIÓN
La tiroides es una de las glándulas endocrinas más importantes del organismo, tiene múltiples efectos en el desarrollo y el metabolismo de los vertebrados. Regula la tasa metabólica basal y es esencial para mantener alta y constante la temperatura corporal en los animales homeotérmicos. El efecto de las hormonas tiroideas sobre el metabolismo de las proteínas y de los lípidos es de naturaleza bifásica: a bajas concentraciones fisiológicas son anabólicas y a altas concentraciones son catabólicas (Werner e Ingbar, 1971; Wollman 1980). Las alteraciones de la función de la tiroides ocasionan patologías importantes, entre las que se cuentan numerosos casos de bocio endémico, hipertiroidismo, hipotiroidismo y cáncer de tiroides en el mundo y en Colombia (Gaitán, 1991). La unidad estructural y funcional de la tiroides es el folículo, constituido por una capa de células epiteliales cúbicas (tirocitos) alrededor de una solución viscosa, el coloide, secretado por los tirocitos (Werner e Ingbar, 1971; Nadler, 1974; Denef et al., 1980; Wollman, 1980). El tamaño de los folículos varía según la especie (50 a 150 µm en rata y ratón; 150 a 500 µm cerdo y humanos), edad y su localización: los más grandes al exterior de los lóbulos (Wollman, 1980).
La tiroides sintetiza y secreta las hormonas tiroideas: 3,5,3'-triyodotironina (T3) y 3,5,3',5'- tetrayodotironina (T4) que se realiza en tres procesos ligados a la morfología folicular y a la ultraestructura de los tirocitos (Giraud et al., 1997; Spinel, 2002). La síntesis de la tiroglobulina (Tg, proteína precursora de las hormonas tiroideas) e inicio de su glicosilación N-osídica se realiza en el abundante RER que se encuentra alrededor del núcleo; la maduración y finalización de la glicosilación en el CG, y en vesículas de exocitosis, luego de lo cual es secretada al coloide. La captación de yoduro se efectúa en la membrana basal (de la Vieja et al., 2000; Spitzweg et al., 2000; Spinel, 2002), y pasa al coloide folicular a través de la membrana apical del tirocito (Kopp et al., 1999; Rodríguez et al., 2002). En la membrana apical la tiroperoxidasa une yoduro a la Tg (proceso conocido como organificación o PBI (protein binding iodide)) y luego la misma enzima forma yodotironinas en la Tg (Björkman y Ekhölm, 1984; Medeiros-Neto et al,. 1993; Vono-Toniolo et al., 2004). Por último, la Tg es endocitada (Marino y McCluskey, 2000) y degradada en prelisosomas y lisosomas (Dubois et al., 1991), liberando las hormonas a la circulación (van den Hove-Vandenbroucke et al., 1980). La glándula tiroides está bajo el control de la TSH y de la concentración de yoduro (Werner e Ingbar, 1971; Denef et al., 1980; Wollman, 1980).
Uno de los mayores problemas del cultivo del tejido tiroideo es mantener la arquitectura folicular y la polaridad de los tirocitos, sin lo cual las propiedades funcionales se pierden (Fayet et al., 1982) debido a la desaparición del lumen coloidal y de la polaridad del tirocito (Ambesi-Impiombato et al., 1980; Chambard et al., 1982; Kimura et al., 2001; Eggo et al., 2003). En cultivos primarios, la introducción de elementos de la matriz extracelular (colágeno) u artificiales (matrigel), y en presencia de TSH se logran formaciones denominadas seudofolículos que algunos autores llaman folículos (Fayet et al., 1971; Toda et al., 1993; Curcio et al., 1994; Kuliawat et al., 1995; Mauchamp et al., 1998; Pellerin et al., 1999; Kimura et al., 2001; Toda et al., 2002; Eggo et al., 2003). Estas mis-mas estructuras pueden obtenerse a partir de la transfección de células madre embrionarias (Lin et al., 2003), pero son de corta duración y no reproducen la organificación de la Tg ni la formación de hormonas T3 y T4. La polaridad del tirocito en cultivo es fundamental para conservar los dominios de membrana y por lo tanto la expresión de moléculas específicas de estos dominios (Kuliawat et al., 1995; Bernier-Valentin et al., 2006). Han sido reportados métodos para cultivar folículos cerrados y abiertos (Chambard et al., 1982; Nitsch y Wollman, 1980a; Nitsch y Wollman, 1980b; Herzog y Miller, 1981; Karlsson et al., 1982; Gärtner et al., 1985; Westermark et al., 1985), o de folículos recubiertos de colágeno (Takasu et al., 1992; Massart et al., 1997; Kraiem et al., 2000; Cabezas et al., 2005; Kusakabe et al., 2006), pero no se describe la estructura, ni la función, como tampoco la relación entre estas dos.
Folículos de rata cerrados desde el inicio del cultivo con y sin tirotropina (TSH) mantienen la polaridad del tirocito, la función normal de síntesis de tiroglobulina y de hormonas tiroides (Spinel et al., 1990), y reproducen el efecto Wolff-Chaikoff (Spinel y Yildiz, 1991) de manera homóloga a los folículos de una glándula in vivo (Wolff y Chaikoff, 1948; Denef, 1980; Many, 1982). Sin embargo, este modelo no es adecuado para extrapolar al humano, porque el metabolismo es 10 veces mayor y el diámetro promedio de los folículos es tres veces más pequeño. Por lo tanto, desarrollamos este estudio con una glándula tiroides homóloga a la humana, como lo es la de cerdo.
]]> MATERIAL Y MÉTODOSEXTRACCIÓN Y DISECCIÓN DE TIROIDES DE CERDO
Los lóbulos de tiroides de cerdo se obtienen en Frigoríficos Guadalupe, Bogotá-Colombia. Inmediatamente disecados del animal se lavan durante un minuto en alcohol al 70% y luego se colocan en medio de cultivo COON (Sigma F-6636; Ambesi-Impiombato et al. 1980) con 100 µU/ml-µg/ml penicilina-estreptomicina (Gibco 15140-122; medio que denominamos de ahora en adelante COON), y se lleva directamente al laboratorio. Se retira la cápsula del lóbulo y se seccionan segmentos del parénquima libre de tejido conectivo que son cortados en fragmentos pequeños de aproximadamente 2 mm3.
DISOCIACIÓN Y CULTIVO
Los fragmentos obtenidos se reúnen en un frasco de base plana con medio COON + 400 U/ml de colagenasa tipo II (Sigma C-6885), se incuban a 37 °C con agitación continua de 160 osc/min. Cada 10 min se renueva el medio COON + colágenasa y se realiza cuatro veces sin pasar 1 h de acción enzimática. Al final de cada etapa de 10 min se realiza la disociación mecánica de los fragmentos con ayuda de pipetas de 10 y 5 ml cada una 10 veces evitando la formación de burbujas y turbulencia en el flujo; el material disociado se lava tres veces con COON + 2% de suero fetal bovino (SFB, Gibco 10437-028) 5 min a 50 g. Los sobrenadantes de cada lavado se eliminan y con ellos los deshechos celulares y las células aisladas. Se reúne todo el material disociado de las cuatro digestiones de 10 min y se filtra a través de una malla con poros de 300 mm de diámetro eliminando el tejido no disociado. Se realiza un control de viabilidad con azul Trypan 5% (Sigma T-8154) antes de iniciar el cultivo.
CULTIVO DE FOLÍCULOS
Los folículos se cultivan en cajas de Petri de 35 y 75 mm en suspensión sobre agarosa tipo II al 1% (agar-bearing marine algae type II, Sigma A9918) en medio COON + 0,5% de SFB a 37 °C y una atmósfera 95% aire - 5% CO2 y saturada en humedad. Se cambia el medio de cultivo a las 12 h de preincubación, a las 24 h y cada 3 días de cultivo por aspiración del medio con los folículos y lavado de la superficie de agarosa, se centrifuga a 50 g por 5 min y se resuspenden con nuevo medio COON. Se hicieron cultivos con y sin 1 mU/ml de TSH (donada por el Dr. Thierry Pourcher) desde el inicio del cultivo, y se realiza su seguimiento en microscopio invertido (MI).
PROCESAMIENTO PARA EL ANÁLISIS MORFOLÓGICO
El tejido completo se fija 2 h y los folículos 1 h con glutaraldehído 2,5% (Sigma G5882) en tampón cacodilato 0,1 M (Sigma C-0125) a pH 7,4. Tres lavados de 10 min con tampón cacodilato 0,1 M pH 7,4. Se continúa inmediatamente con la postfijación 1 h con tetróxido de osmio 1% (OsO4 Sigma O-0631) en tampón cacodilato 0,1 M. Tres lavados de 10 min con tampón cacodilato 0,1 M, pH 7,4. Como los folículos se encuentran en suspensión son centrifugados a 200 g por 5 min en cada eta-pa desde su fijación y deshidratación hasta su impregnación en resina. La deshidratación se realiza con concentraciones ascendentes de etanol (Carlo Erba 414577/002) 75%, 85%, 90% cada una de 5 min y alcohol absoluto cinco veces 5 min. La infiltración de la resina se realiza cuatro veces 15 min en óxido de propileno (Polysciences 00236), dos veces en una mezcla óxido de propileno/resina Epon 812 (Polysciences 08791) 1/1, la primera de 15 min y la segunda de 2 h. Se culmina con la inclusión de la resina una noche y cambio al día siguiente. La polimerización se realiza 6 h a 30 °C, 12 h a 40 °C y 2 días a 60 °C, una vez formada la pirámide de resina se realizan cortes semifinos de 0,5 µm de espesor, coloreados con azul de Toluidina 1% (Merck 15930) y se examinan en microscopio óptico (MO; Denef et al., 1980; Spinel et al., 1990). Los cortes ultrafinos se montan en rejillas de cobre y se contrastan con acetato de uranilo (Merck 8473) y citrato de plomo (Polysciences 003787) y se examinan en microscopio electrónico (ME; Hayat, 1975).
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
]]> AISLAMIENTO DE FOLÍCULOSEl tejido de tiroides que se obtiene para el cultivo presenta folículos con epitelio plano de 8 µm de espesor (Fig. 1A). Además, los tirocitos tienen exiguo RER, CG, escasos lisosomas y microvellosidades (Fig. 1B), aspecto similar al epitelio de los folículos de una glándula hipotiroidea (Many, 1982), al contrario al epitelio de 20 µm de espesor en promedio, con abundante RER, CG y largas microvellosidades en los tirocitos de una glándula normal o eutiroidea (Denef et al., 1980; Nitsch y Wollman, 1980a; Nitsch y Wollman, 1980b; Karlsson et al., 1982).
Se realizaron ocho aislamientos y cultivos de los folículos de las glándulas tiroides de cerdo, obteniendo los mismos resultados que se describen a continuación. La digestión enzimática y mecánica realizadas para la obtención de folículos cerrados son muy controladas, evitando turbulencia al aspirar y expirar, de lo contrario se obtienen folículos abiertos. Se conoce que con una fuerte disociación mecánica de tiroides de rata se obtiene 20% de folículos cerrados, mientras que con una disociación controlada, esta proporción aumenta a un 70% (Spinel, 1987). Esto permite obtener folículos cerrados de epitelio plano y algunos abiertos como lo reportado para la tiroides de rata (Spinel et al., 1990) o de ratón (Cabezas et al., 2005) y humana (Orozco et al., 1997), además de agrupaciones celulares y células aisladas (Denef et al., 1980; Nitsch y Wollman 1980a; Nitsch y Wollman, 1980b; Karlsson et al., 1982). Inmediatamente después de la disociación, los folículos cerrados con su coloide presentan una cavidad hialina y si pierden el coloide muestran un contenido heterogéneo al observarlos en microscopio invertido (MI). La viabilidad de las células en los folículos es 100%, solamente se observan células no viables en la periferia de los folículos que corresponden a células endoteliales de los capilares.
Se realizó una pre-incubación de 12 h, tiempo necesario para que los folículos abiertos se desorganicen y sean eliminados con el cambio del medio, además permite que se resellen los folículos ligeramente abiertos (Denef et al., 1980; Spinel et al., 1990). El periodo de pre-incubación permite que un 20% de folículos abiertos se cierren. Para que los folículos de rata se conserven en el cultivo de 12 d se debe iniciar con 80% o más de folículos cerrados después de la pre-incubación (Spinel, 1987; Spinel et al., 1990). Efectivamente, si se inicia con 60% o menos de folículos abiertos, no se conservan más allá de 48 h en cultivo.
CULTIVO DE FOLÍCULOS
Los folículos cultivados en ausencia de TSH conservan su arquitectura, en los primeros días de cultivo presentan el mismo aspecto del epitelio plano del tejido de origen. A partir del tercer día el epitelio deja de ser plano y aumenta observándose al día 8 un epitelio cúbico típico de una tiroides normal, ya sea que presenten coloide hialino o no (Fig. 2A). La estructura folicular se mantiene durante el cultivo (3 días) si se inicia con folículos cerrados (Cabezas et al., 2005) y no requieren soporte de elementos de la matriz extracelular (Fayet et al., 1971; Ambesi-Impiombato et al., 1980; Takasu et al., 1992; Massart et al., 1997; Eggo et al., 2003) ni TSH para mantener la cavidad folicular, como lo descrito en la mayoría de los cultivos de pseudofolículos, o de folículos reconstruidos a partir de monocapas, o de estructuras similares llamadas folículos (Fayet et al., 1971; Takasu et al., 1992; Toda et al., 1993; Curcio et al., 1994; Mauchamp et al., 1998; Pellerin et al., 1999; Bernier-Valentin et al., 2006) demostrándose que si desde el inicio del cultivo se tienen folículos cerrados estos conservan su morfología con la correcta polaridad en cultivo de 8 días. Cuando los folículos no son cerrados la polaridad del tirocito se reinvierte en el 2 día con el aumento de suero en el medio (Herzog y Miller, 1981), esto no ocurre con los folículos cerrados de cerdo o ratón aún con 10% de suero (Cabezas et al., 2005). En MI es muy difícil distinguir la cavidad de los folículos en presencia de TSH (Fig. 2B). Los folículos responden morfológicamente a la TSH como una glándula in vivo (Werner y Ingbar, 1971; Gaitán, 1991) aumentando el espesor del epitelio y disminuyendo notablemente las cavidades foliculares como fue descrito a partir del sexto día en el cultivo de rata (Spinel et al., 1990).
En ausencia de TSH, la polaridad celular persiste y las uniones celulares se conservan a nivel apical separando los dominios de membrana basolateral de la apical (Fig. 3D) como in vivo, siendo una característica descrita por diferentes autores como rasgo importante de polaridad (Alberts et al., 2002; Eggo et al., 2003), los folículos de cerdo a lo largo del cultivo (8 días) presentan estas características demostrando su cierre completo y la separación de la membrana apical de la basolateral como lo descrito tanto in vivo (Many, 1982) como in vitro para folículos reconstruidos con colágeno (Kusakabe et al., 2006) o de folículos cerrados de rata donde además se demuestra que es indispensable que sean cerrados para conservar la función de captación y organificación del yoduro hasta 12 días en ausencia de TSH (Spinel, 1987) y las proteínas que caracterizan los diferentes dominos de membrana (Bernier-Valentin et al., 2006). El epitelio de los folículos cultivados con TSH (1 mU/ml) al inicio del cultivo (0 y 1 día) presentan un epitelio menos plano (Fig. 4A), pero el espesor de las células es mayor comparado con los folículos sin TSH y se evidencia una mayor agregación de folículos. En el día 8, aunque en MI no se distinguen las cavidades, en MO se observan y los folículos presenta un epitelio de 30 µm (Fig. 4C). Esto también ha sido descrito en cultivo de folículos de rata a partir del 9 día de cultivo con 0,1 mU/ml de TSH y del 6 día con 1 mU/ml, únicamente por autorradiografía del yoduro radiactivo se pone en evidencia las cavidades de estos folículos (Spinel et al., 1990).
Es evidente que el incremento en la altura del epitelio de los folículos de cerdo en presencia de TSH es respuesta de las células a la hormona y va acompañado del abundante RER desde el primer día de cultivo (Fig. 4B) y día 8 presentan una ultraestructura similar a una glándula hipertiroidea que responde al estímulo de la TSH con un RER muy abundante alrededor del núcleo (Fig. 4D1), el CG en la región perinuclear, largas y abundantes microvellosidades y cavidades folicular muy estrechas (Fig. 4D2). En folículos humanos cultivados con péptidos sintéticos derivados de la TSH se evidencia su unión en la membrana basal de los tirocitos (Orozco et al., 1997), demostrando que el procedimiento de aislamiento no modifica los receptores de la TSH en la membrana basal de los tirocitos de los folículos. Ha sido descrito el aislamiento de folículos de cerdo (Gärtner et al., 1985) que responden a iodolactonas (Langer et al., 2003), pero no describen si estos folículos se mantienen más de 24 h y si en cultivo son cerrados o abiertos. La principal particularidad del cultivo descrito es su sencillez. Puede ser aplicada para obtener folículos de patologías de tejido humano cuyo epitelio sea plano para su estudio in vitro en condiciones controladas y homologable a la patología in vivo. En conclusión, los folículos deben aislarse cerrados, y así en cultivo conservan la arquitectura folicular, la ultraestructura del tirocito y responden a la TSH en cultivo a largo plazo de manera similar a una glándula tiroides in vivo.
AGRADECIMIENTOS
Este trabajo fue realizado gracias al apoyo de: Colciencias (1101405 20161), Unidad de Investigación Universidad Nacional de Colombia sede Bogotá (8003029) y al programa ECOS-Nord/Colciencias/ICFES/ICETEX. Agradecemos al Departamento de Biología de la Universidad Nacional de Colombia, al Laboratorio de Biofísica del Centro Internacional de Física. Muy especiales agradecimientos a Frigoríficos Guadalupe; y a la Unité Transporteurs en Imagerie et Radiothérapie Oncologique, Université de Nice Sophia-Antípolis. A Thierry Pourcher y Marcela Camacho muchas gracias por la asesoría científica.
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