DETERMINACIÓN DE Salmonella Typhimurium EN COMPOST INOCULADO ARTIFICIALMENTE EMPLEADO EN UN CULTIVO DE LECHUGA

Salmonella Typhimurium determination in compost artificially inoculated in a lettuce crop

DIANA MARCELA RODRÍGUEZ¹, FRANCY ELAINE TORRES¹, EDNA VIVIANA GUTIÉRREZ¹, MARITZA PAOLA LÓPEZ¹, MARIA MERCEDES MARTÍNEZ¹, M. Sc.; ANA KARINA CARRASCAL², M. Sc.

Facultad de Ciencias, Departamento de Microbiología, Grupo de Biotecnología Ambiental e Industrial.Laboratorio de Microbiología Ambiental y de Suelos. Pontificia Universidad Javeriana, Bogotá, Colombia.

Laboratorio de Microbiología de Alimentos. Pontificia Universidad Javeriana. Carrera 7 No. 43-82. Edificio Félix Restrepo. Bogotá, Colombia. mmmartin@javeriana.edu.co

Presentado 12 de abril de 2008, aceptado 12 de mayo de 2008, correcciones 24 de junio de 2008.

RESUMEN

Salmonella enterica serovariedad Typhimurium, se ha asociado a brotes por el consumo de frutas y vegetales contaminadas a partir de agua de riego, manipuladores, bioabono y suelo. En esta investigación se inoculó artificialmente un bioabono aplicado a un cultivo de lechuga para determinar la capacidad de transferencia a las plantas, así como establecer el efecto del uso de cubiertas de polietileno en la protección del cultivo frente a este patógeno. Para ello, se utilizaron plántulas de lechuga de ocho semanas y se establecieron cuatro tratamientos y dos controles: T1 y T2, con y sin cubierta de polietileno respectivamente, contenían una concentración de Salmonella enterica Serovariedad Typhimurium ATCC 13176 inoculada en el compost en concentración de 0,04 mo/g, T3 y T4 con y sin cubierta de polietileno respectivamente con 100 mo/g de compost y finalmente C1 y C2 con y sin cubierta pero sin inoculación.

Palabras clave: compost, lechuga, Salmonella enterica serovariedad Typhimurium, inocuidad.

ABSTRACT

Salmonella enterica serovariedad Typhimurium, has been associated with outbreaks because of the ingestion of fruits and vegetables and those outbreaks have been related due to contamination sources like irrigation water, farm workers influence and the soil itself. In this investigation it was artificially inoculated in a compost and later applied to a lettuce crop, in order to determine the transfer capacity of this microorganism to the plants, as well as to establish if the polyethylene cover protected the crop. In this study, four treatments were made with two controls, T1 and T2 - with and without polyethylene cover - these treatments and controls were inoculated with Salmonella enterica Serovariedad Typhimurium ATCC 13176 0,04 mo/g de compost, T3 y T4 - with and without polyethylene cover - each one with 100 mo/g de compost, and finally C1 and C2 - with and without polyethylene cover -, but without inoculation. At 8 weeks the microorganism was determine by the MPN/4g technique (EPA, 2006).

Salmonella enterica serovariedad Typhimurium ATCC 13176 is capable to transfer itself to the lettuce, through the contaminated compost (OR=2.53) regardless of microorganism concentration in the compost, and there was an association between the contamination and the crop cover condition (p=0.002). The analysis of the roots and the irrigation water, demonstrated that it does not exist any transference association.

Key words: Compost, lettuce, Salmonella enterica serovariedad Typhimurium, safety.

INTRODUCCIÓN

En la última década, ha aumentado el número de brotes alimentarios siendo una de las principales causas, el consumo de vegetales frescos contaminados con bacterias como Salmonella spp., Escherichia coli O157:H7, Listeria monocytogenes, entre otras (Magnuson et al., 1990; Himathongkam et al.,1999; Solomon et al., 2002; Islam et al., 2004b; Sivapalasingam et al., 2004; Ibenyassine et al., 2007). Salmonella spp. es la bacteria que causa el mayor número de enfermedades transmitidas por alimentos (ETA) en el mundo (Tauxe et al., 1997) y tradicionalmente se ha asociado a alimentos de origen animal, aunque en la última década se ha asociado al consumo de vegetales y frutas frescas contaminadas con aguas recicladas y abonos orgánicos de baja cali-dad (Solomon et al., 2002; Natving et al., 2002; Warriner et al., 2003; Mukherjee et al., 2004; Franz et al., 2005).

Los abonos orgánicos y las materias primas que se emplean para el cultivo de vegetales juegan un rol muy importante en la posible introducción de patógenos humanos dentro de la cadena alimentaria (Solomon et al., 2002; Natving et al., 2002; Islam et al., 2004a; Franz et al., 2005; Lemunier et al., 2005), pues en aquellos procesos de compostaje donde el proceso térmico es deficiente pueden persistir y al no ser destruidos, pueden reactivarse al final del proceso cuando la temperatura desciende (Gale, 2002; Lemunier et al., 2005). Este resultado afecta directamente la calidad del bioabono obtenido, convirtiéndose en un riesgo para los cultivos de consumo directo y por ende para la salud pública. Se ha sugerido que patógenos como Salmonella spp.,

Escherichia coli O157:H7 y Listeria monocytogenes son introducidos como resultado de malas prácticas higiénicas, durante la producción o procesos del manejo post-cose-cha (Beuchat, 2006); también desde 1961, Angelotti et al., 1961, indicaron que Salmonella spp. persiste en bioabonos mal compostados por su habilidad para tolerar un rango amplio de temperatura (7 °C y 49,5 °C) y a su capacidad de adherencia a partículas pequeñas del suelo (Wilkinson, 2007).

MATERIALES Y MÉTODOS

MICROORGANISMO DE ESTUDIO

Se utilizó Salmonella enterica serovariedad Typhimurium ATCC 13176, la cual se adquirió del banco de cepas del Instituto Nacional de Salud (INS).

PRODUCCIÓN DEL INÓCULO

Para la producción del inóculo de Salmonella enterica serovariedad Typhimurium ATCC 13176 se sembraron 25 mL de preinóculo en 225 mL de caldo infusión cerebro corazón (BHI) y se incubó a 35 °C, 150 rpm durante 24 h; se realizó coloración de Gram para determinar pureza del inóculo y se ajustó la absorbancia 0,25 población cercana a 10⁸ microorganismos/mL (Delgado et al., 2004). Se realizaron diluciones seriadas para contaminar manualmente el compost de flores con una solución de 0,04 y 100 micro-organismos/g de compost respectivamente. Terminada la inoculación se corroboró la concentración de microorganismo inoculado mediante la técnica de NMP/4g (EPA, 2006) y el compost se mantuvo a 4 °C hasta su aplicación en campo.

FASE DE CAMPO

La prueba de campo se realizó en un lote de invernadero de 4 x 7 metros en la estación experimental San Javier de la Pontificia Universidad Javeriana, ubicado en el municipio de Cogua en la vereda El Mortiño, Cundinamarca, Colombia con temperatura promedio de 15 °C y una altitud de 2.631 msnm (Van der Hammen y Rangel, 1997).

Preparación del suelo. Se realizó un análisis fisicoquímico para suelo y compost, en elcual se determinó nitrógeno total, carbono orgánico (CO; Walkley y Black, 1934),nitrógeno amoniacal (N-NH4+), nitratos (N-NO3) y textura. De acuerdo a los resulta-dos fisicoquímicos obtenidos se planteó el siguiente plan de fertilización: materiaorgánica (compost vegetal procedente de flores: 2 kg/cama de suelo), 1,2 kg H2PO4,0,6 kg K2PO40,6, 0,2 kg MgNO3y 0,2 CaNO3/tratamiento; Balcaza, 1997). La mezclase colocó en el suelo a una profundidad de 17,5 cm, en camas de (80 cm ancho x 180cm largo). Posteriormente se distribuyeron los tratamientos en bloques al azar (Tabla.1) T1, T3 y el control C1, se cubrieron con polietileno negro de alta densidad utilizadocomo capa aislante entre las hojas de la lechuga y el suelo.

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Población de estudio y muestra. La población de estudio fueron 90 plántulas de(Lactuca sativa l var. crispa l) de ocho semanas de germinación donadas por una empresaproductora de hortalizas. Las plántulas fueron trasplantadas en bloques de 15 indivi-duos a cada tratamiento a distancia de 20 cm una de la otra (Johannessen et al.,2004). Los tratamientos con microorganismo fueron inoculados antes de realizar lasiembra; el tiempo de cultivo fue de ocho semanas (Colom y Pons, 2003). Igualmentese evaluaron muestras de suelo, compost de flores y agua de riego, durante las ochosemanas de experimentación, las cuales fueron tomadas mediante un muestreo alea-torio simple (Martínez et al., 2007).

Determinación de temperatura y pH del suelo. La determinación de la temperaturadel suelo de cada tratamiento y sus respectivos controles se realizó en la mañana y enla tarde diariamente utilizando un termómetro de punzón a 10 cm de la superficie. Ladeterminación de pH se llevó a cabo semanalmente por medio del método de pastade saturación (Lin et al., 1995).

Cuantificación de Salmonella enterica serovariedad Typhimurium ATCC 13176. Antes de realizar el ensayo, se procedió a evaluar la concentración de Salmonella spp. en suelo pormedio de NMP Salmonellaspp./4 g (EPA, 2006) y al agua de riego y plántulas por elmétodo Ausencia/Presencia Salmonella spp. (Palacios, 1999). Durante las ocho semanas de estudio se tomaron semanalmente 50 g de suelo aleatoriamente (forma de X),de cada tratamiento y control a una profundidad de 10 cm; y se determinó Salmonellaspp., mediante la técnica de NMP 1684 (EPA, 2006), al igual que en planta, realizandoel análisis de la población total de lechugas sembradas (n=15) por tratamiento.

Se llevó a cabo la determinación de Salmonellaspp., en raíces de lechuga, las cualesfueron separadas de las hojas con un cuchillo estéril; para su análisis se tuvo en cuentaque el peso de estas es muy bajo, razón por la cual se procedió a realizar un enjuague 65de las raíces en 100 mL de agua peptonada al 0,1% durante 15 minutos; el aguapeptonada de enjuague se adicionó en caldo BHI (Scharlau®) para realizar el pre-enriquecimiento durante 6 horas; posteriormente se tomó 1 mL de este cultivo y sesembró en caldo Rappaport y los aislamientos se realizaron en agar XLD (Scharlau®)y Hectoen (Scharlau®), posteriormente se procedió a su identificación bioquímica yserotipificación. Finalmente para la determinación del patógeno en agua de riego setomaron 100 mL del agua a utilizar, los cuales fueron analizados siguiendo la meto-dología propuesta por Palacios, 1999.

ANÁLISIS ESTADÍSTICO

Para el análisis estadístico se llevó a cabo un test de Kruskal-Wallis para evidenciardiferencias entre las medias de los tratamientos (con y sin cubierta de polietileno) y susrespectivos controles respecto a la concentración de Salmonella entericaSerovariedadTyphimurium ATCC 13176 con un nivel de significancia de 0,05. Adicionalmente, serealizó la prueba Odds Ratiopara evidenciar el riesgo de contaminación y el porcentajede transferencia del patógeno del suelo a la lechuga (Morris y Gadner, 1988). Losdatos fueron procesados empleando en el programa JMP versión 6.0 para Windows.

RESULTADOS

El suelo utilizado para la experimentación presentó valores de carbono orgánico pro-medio de 5,11%, nitrógeno total 0,53% y una textura franco arcillosa (Tabla.2), mien-tras que el compost procedente de residuos de flores presentó valores de carbonoorgánico de 17,3%, nitrógeno total de 1,3%, con una humedad de 39,4 % (Tabla.3).

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Durante las ocho semanas del ensayo el comportamiento del pH del suelo se caracterizópor ser ácido con valores entre 5,9 y 6,3, el tratamiento 4 (0,04 mo/g suelo descubierto) fue el que presentó valores de pH más altos (6,3; Fig. 1), mientras que en el tratamiento1 (100 mo/g de suelo) se observaron valores más bajos (5,9). La temperatura semantuvo con valores entre 15 °C y 16,7 °C (Fig. 1) sin diferencias significativas entrelos tratamientos respecto a las concentraciones de microorganismos evaluadas (0,04) mo/g de suelo y 100 mo/g de suelo) (p=0,08541) como tampoco respecto a la presencia o no de cubierta (p=0,6524; 0,3968) igualmente con la variable pH (p=0,46).

CUANTIFICACIÓN DE Salmonella enterica SEROVARIEDAD TYPHIMURIUM ATCC 13176 EN LAS DIFERENTES MATRICES EVALUADAS

Al analizar el compost y el suelo antes de la inoculación con Salmonella entericaserovariedad Typhimurium ATCC 13176, no se logró la recuperación del patógenomostrando valores de NMP <0,06473 Salmonellaspp./4 g suelo; en el caso del agua deriesgo y plántula no se aisló Salmonellaspp. El bioabono mezclado en el suelo reportóvalores de NMP de Salmonellaspp./4 g suelo en tiempo 0, de 39,27 para T1, T2(160,98), T3 (19,81), T4 (7,73), C1 (<0,06473) y C2 (<0,06473), concentraciones quefueron disminuyendo a lo largo de la experimentación como se muestra en la Tabla.4.

Para el tratamiento 2 y 4 se encontró un índice de OR=1,625 y proporcionalidad de P=61,9%, para el tratamiento 1 y 3 OR = 2,153 y proporcionalidad P=68,3%. Por otra parte se determinó la presencia del patógeno en los tratamientos T1 Y T3 en un 7% de la población evaluada y en los T2 y T4 en un 18% con, OR de 0,22 y 0,125 respectivamente sin detectarlo en los controles.

DISCUSIÓN

Durante la experimentación se observó el 100% de crecimiento de Lactuca sativa L var. crispa L, el rango de temperatura osciló entre15 °C y 16,75 °C, el pH entre 5,9 y 6,3, así como suelos con buena retención de humedad y buena cantidad de materia orgánica, lo que favoreció no solo el buen desarrollo de las plantas sino también del patógeno (Sarquis et al., 1997), Este microorganismo puede desarrollarse cuando la relación C:N es 15:1, concentraciones similares a las encontradas en el compost (13,1; Wilkinson, 2007). Con relación a la textura Natvig et al., 2002 y Franz et al., 2005, encontraron que suelos con texturas arcillosas favorecen las posibilidades de colonización de S. typhimurium en vegetales como la lechuga por el tamaño de la partícula, la formación de agregados, retención de agua y tensión de oxígeno, factores que probablemente permitieron la adherencia del microorganismo y su mantenimiento durante las ocho semanas del cultivo.

Respecto a la temperatura, los tratamientos 2, 4 y el control 2, presentaron mayores temperaturas (16,7 °C, 16,4 °C y 16,2 °C), incrementos que pudieron estar asociados al uso de la cubierta protectora de polietileno, la cual aunque es permeable, no per-mite un flujo rápido de gases y productos de la respiración del suelo induciendo un leve aumento de la temperatura; durante la experimentación a pesar que se presentó mayor temperatura en los tratamientos cubiertos con polietileno, no se encontró asociación de esta variable con la concentración del microorganismo; tal vez, en épocas de mayor calor la concentración del patógeno hubiera aumentado notablemente pues según Chang y Fang, 2007, S. tyhimurium disminuye su crecimiento en una unidad logarítmica (UL) cada 14 días si se encuentra en temperaturas de 4 °C y aumenta en 3 UL en temperaturas cercanas de 22 °C.

Al comparar el NMP/4 g Salmonella spp. de suelo de la primera semana con el recuento inicial se observó un incremento, el cual puede estar relacionado con factores como: concentración de nutrientes y la procedencia del inóculo; no obstante a partir de la segunda semana en todos los tratamientos se observó un descenso de la población el cual se mantuvo casi constante durante el resto del ensayo; es posible que este descenso esté asociado a la degradación de materia orgánica realizada por los microorganismos propios del suelo, los cuales al ser nativos poseen una alta actividad metabólica adaptada a las condiciones propias de la matriz que los convierte en fuertes competidores de Salmonella spp. por nutrientes y espacio. Estudios realizados por Weissinger et al., 2000, indican que el pH óptimo para Salmonella spp. oscila entre 5,5 y 7,4, en la segunda semana de cultivo, el crecimiento de Salmonella spp. se vió incrementado, a pesar del pH ácido, generado por la transformación de la materia orgánica presente en el medio (Islam et al., 2004a).

Durante la experimentación dos factores pudieron contribuir en la disminución del microorganismo, el riego periódico que genera percolación a través de la matriz (Natvig et al., 2002) y disminución en la concentración de nutrientes como nitritos, fosfatos y materia orgánica (Holley et al., 2006). Salmonella spp. al no encontrar los nutrientes necesarios sufre de injuria bacteriana por lo que la concentración, en términos de cuantificación puede ser menor a los existentes en el suelo (Doyle y Beuchat, 2007). Es importante tener en cuenta que la inoculación del suelo y bioabono sólo se realizó en la fase inicial del cultivo, sin adicionar carga microbiana alguna o fertilización química después de la primera inoculación y de la siembra de las plántulas, lo que, al igual que en los trabajos reportados por Johannessen et al., 2005, permite determinar que no es necesario fertilizar en repetidas ocasiones para que se presente el patógeno, pues es capaz de utilizar la materia orgánica presente como sustrato y medio de propagación (Islam et al., 2004a). Según Ibenyassine et al., 2007, es importante considerar que con una segunda fertilización como es tradicional en este cultivo, la concentración del microorganismo se incrementa por la presencia de nutrientes rápidamente disponibles, lo que a su vez se constituye en un factor importante que aumentaría la probabilidad de contaminación de las plantas de lechuga.

Los resultados obtenidos semanalmente para las matrices bioabono y suelo, según la técnica de NMP de Salmonella/4 g suelo (EPA, 2006) indicaron menores concentraciones del microorganismo en las plantas cosechadas con respecto a las presentadas en el suelo abonado.

Tradicionalmente la búsqueda de Salmonella spp., en alimentos se hace utilizando la técnica de ausencia/presencia, siendo este microorganismo de cero tolerancia, sin embargo, en este estudio, se utilizó la técnica de NMP en el alimento, para realizar un seguimiento y homologar los datos del bioabono con los obtenidos en planta. Los resultados demostraron valores bajos del patógeno presentados en el vegetal, que pueden limitar su comercialización y consumo, al ser considerado un microorganismo de cero tolerancia en alimentos de consumo directo. Las concentraciones encontradas son suficientes para causar enfermedad pues según la dosis infectante del microorganismo (10² mo/g alimento; Kowall, 1985) y la dosis ingerida promedio de lechuga por persona (aproximadamente 25-50 g), al expresar el resultado en 4 g, las concentraciones presentadas son más que suficientes para que el microorganismo cause enfermedad en el consumidor.

En concordancia con otros estudios en los que también han investigado el riesgo de usar abonos contaminados con microorganismos patógenos a lo largo del cultivo de hortalizas frescas, se ha encontrado que la transmisión puede ocurrir en cualquier etapa del cultivo, tanto en condiciones de invernadero como en campo abierto (Baloda et al., 2001; Solomon et al., 2002; Lemunier et al., 2005). Se destacan como factores críticos la cantidad y calidad de bioabono aplicado (Islam et al., 2004a), la inoculación de las plantas desde la semilla y reinoculación del microorganismo de prueba a lo largo del cultivo (Johannessen et al., 2004; Franz et al., 2006), la calidad de agua durante el riego, cosecha o distribución (McMahon y Wilson, 2001). Weissinger et al., 2000, Natvig et al., 2002, Solomon et al., 2002, realizando estudios similares con bioabono inoculados artificialmente en cultivo de lechuga, concluyen que estos materiales son fuente directa de contaminación de la planta a través del tiempo de cultivo.

Según Klerks et al., 2007, hay factores más allá del área de contacto de la lechuga con el suelo y bioabono ya que en Salmonella spp. los factores de virulencia favorecen tanto la colonización como la internalización en las plantas en condición de endófito. Esto explica el hecho que en el presente estudio, al determinar la presencia del patógeno en plantas este fue detectado en camas con cubierta y si ella, sin influir significativamente factores como temperatura, pH o concentración del microorganismo (Thanassi y Hultgren, 2000). Así, se determinó que no hay relación entre la cubierta con polietileno y la contaminación de las lechugas, las barreras físicas entre la planta y la matriz contaminada no evitan la contaminación del cultivo por microorganismos patógenos como Salmonella enterica serovariedad Typhimurium ATCC 13176.

Este estudio demuestra que a pesar que las matrices a utilizar en cultivos de alimentos de consumo directo cuenten con concentraciones mínimas (0,04 mo/g y 100 mo/g) de S. typhimurium se produce contaminación del alimento poniendo en peligro la salud del consumidor, por lo que en estos cultivos es necesario asegurar la calidad de los bioabonos a utilizar para reducir el riesgo de contaminación de los consumidores con Salmonella spp. y determinar no solo por técnica A/P, sino también por NMP/4 g, pues existen muchos factores que se combinan para enmascarar el microorganismo, en especial en matrices tan complejas como los abonos orgánicos.

CONCLUSIONES

Se evidenció la permanencia de Salmonella enterica Serovariedad Typhimurium ATCC 13176 inoculada en concentraciones (0,04 mo/g bioabono/suelo y 100 mo/g bioa-bono/suelo) en suelo y bioabono por un tiempo de ocho semanas. Se logró determinar que existe transferencia de Salmonella enterica Serovariedad Typhimurium ATCC 13176 a la planta de lechuga tanto en camas cubiertas como descubiertas. El uso de la cubierta de polietileno durante el cultivo protege la planta físicamente pero no es un factor determinante en el aislamiento de la misma frente a la coloniza-ción por parte de patógenos como Salmonella enterica Serovariedad Typhimurium ATCC 13176.

AGRADECIMIENTOS

A la productora de hortalizas Hortícola Frutos de Mi Tierra de Hoy, a la Federación Internacional de Universidades Católicas (CIC-FIUC) proyecto 000158 y al Instituto Colombiano para el Desarrollo de Ciencia y Tecnología COLCIENCIAS.

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