BIODEGRADACIÓN DE COMPUESTOS ORGÁNICOSPERSISTENTES (COP): I. EL CASO DE LOS BIFENILOSPOLICLORADOS (PCB)

Biodegradation Of Persistent Organic Pollutants (POPs):I The Case Of Polychlorinated Biphenyls (PCB)

ZIV ARBELI^1,2*

¹Dirección de Desarrollo Sectorial Sostenible, Ministerio de Ambiente,Vivienda y Desarrollo Territorial, Calle 37 No 8-40, Bogotá, Colombia.

²Facultad de Agronomía, Universidad Nacional de Colombia, SedeBogotá, A.A. 14490; Bogotá, D.C., Colombia. aziv@bt.unal.edu.co

^*Dirección actual: Unidad de Saneamiento y Biotecnología Ambiental,Departamento de Biología, Pontifica Universidad Javeriana.

Presentado 31 de mayo de 2008, aceptado 10 de diciembre de 2008, correcciones 21 de enero de 2009.

RESUMEN

Los contaminantes orgánicos persistentes poseen propiedades tóxicas, son resistentes a la degradación, se bioacumulan y son transportados por el aire, el agua y las especies migratorias a través de las fronteras internacionales; en consecuencia se depositan lejos del lugar de su liberación, acumulándose en ecosistemas terrestres y acuáticos. Para atender a esta problemática a nivel mundial se firmó el 23 de mayo de 2001 el Convenio de Estocolmo. Aunque por ahora los COP estan prohibidos en la mayoria de los países, todavía existen en el mundo muchos sitios contaminados con estas sustancias. La remediación de sitios que presentan contaminantes orgánicos persistentes requiere consideraciones distintas a las contempladas en la recupe-ración por contaminación de hidrocarburos. El siguiente texto revisa la literatura sobre la biodegradación anaeróbica y aeróbica de los bifeniles policlorados (PCB) y las posibles estrategias para estimular dicha biodegradación. La degradación de los demás COP será descritas en textos adicionales.

ABSTRACT

Persistent organic pollutants are chemicals that are toxic to humans and wildlife, remain intact in the environment for long periods, accumulate in living organisms and can become widely distributed geographically by air, water or migrating species. As a result, these contaminants have been found all over the world including in places, such as the Polar Regions, which are very far from their application site. The Stockholm Convention was signed in 23/5/01 in order to cope with this international environmental problem. Although POPs were banned by most countries, there are still a lot of sites contaminated with these substances. The remediation of these sites is problematic and requires distinct considerations from those which are established for hydrocarbon remediation. This manuscript reviews the literature about anaerobic and aerobic biodegradation of polychlorinated biphenyls (PCB) and possible strategies to stimulate these processes. The degradation of the other POPs would be reviewed in additional texts.

Key words: Persistent organic pollutants (POPs); Polychlorinated biphenyls (PCB); Biodegradation; Bioremediation.

INTRODUCCIÓN

Los Contaminantes Orgánicos Persistentes (COP) son un grupo de sustancias sintéticas de alto riesgo para la salud humana y el medio ambiente. Estas sustancias han sido encontradas alrededor del mundo, incluidas algunas zonas muy alejadas de aquellas en donde se emplearon tales contaminantes, e.g. las zonas polares, además de poblaciones humanas e, incluso, en la leche materna (MacDonald et al., 2000; Polder et al., 2003; She et al., 2007). Para atender esta problemática a nivel mundial, se firmó el 23 de mayo de 2001 el Convenio de Estocolmo. En el texto del convenio se describen las propiedades de los COP de la siguiente forma: “los contaminantes orgánicos persistentes tienen propiedades tóxicas, son persistentes a la degradación, se bioacumulan y son transportados por el aire, el agua y las especies migratorias, a través de las fronteras internacionales y depositados lejos del lugar de su liberación, acumulándose en ecosistemas terrestres y acuáticos” (Convenio de Estocolmo: http://www.pops.int/documents/convtext/convtext_sp.pdf).

Hasta ahora, las características de los COP incluidos en el Convenio de Estocolmo (esto es, PCB, dioxinas, furanos, aldrina, dieldrina, DDT, endrin, clordano, hexaclorobenceno, mirex, toxafeno y heptacloro) responden a patrones muy similares, pues se trata de moléculas orgánicas cíclicas cloradas; 11 de éstas son policíclicas. Por lo tanto, es posible realizar muchas generalizaciones sobre su degradación y comportamiento ambiental. No obstante, entre los candidatos a COP que se están discutiendo en estos momentos se encuentran sustancias con propiedades diferentes. El caso más llamativo es el del sulfonato de perfluorooctano (PFOS), no lipofílico, dispersable en agua por su capacidad tensioactiva, y que no se bioacumula en los tejidos grasos, sino mediante la unión a proteínas con una distribución muy diferente a la de los COP considerados hasta el momento. Evidentemente, la evaluación de esta sustancia requiere un modelo conceptual muy diferente al de los COP incluidos hasta la fecha (MAVDT, 2007a).

En los últimos años se han adelantado en Colombia algunas actividades relacionadas con los COP, entre las cuales se encuentra la prohibición de producción y uso de aldrin, dieldrin, endrin, mirex, toxafeno, hexaclorobenceno (HCB), DDT, heptacloro y clordano; se elaboraron inventarios de su existencia (MAVDT, 2007b; MAVDT, 2007c; MAVDT, 2007d); estudios sobre sus posibles efectos en la salud (MAVDT, 2007e) y análisis socio-económico sobre la implementación del Convenio de Estocolmo en Colombia (MAVDT, 2007f). A partir de estos inventarios, actualmente se está desarrollando el Plan Nacional de Aplicación del Convenio de Estocolmo en Colombia.

La problemática colombiana relacionada con los sitios contaminados con estas sustancias está muy ligada al uso intensivo de plaguicidas y al manejo de transformadores eléctricos. El manejo inadecuado como consecuencia de la falta de conocimiento sobre su toxicidad y la carencia de normas y controles adecuados, puede conllevar a problemas de contaminación ambiental. En el campo agrícola grandes cantidades de plaguicidas se han tornado obsoletos, debido a la reducción del área sembrada de ciertos cultivos (por ejemplo, el caso del algodón), y a la prohibición del uso de algunos plaguicidas organoclorados. Estos plaguicidas fueron abandonados o enterrados, y posiblemente han contaminados las áreas en donde se encuentran. De igual forma, el manejo inadecuado de transformadores eléctricos o aceites dieléctricos contaminados con PCB en talleres de mantenimiento y en bodegas de almacenamiento son la causa de contaminación en el sector eléctrico. No obstante lo anterior, en el país aún no se ha abordado con suficiente rigor un inventario que incluya análisis químico de suelos, sedimentos o cuerpos de agua para la verificación de sitios sospechosos por contaminación de COP.

Por su naturaleza, los compuestos orgánicos persistentes son díficiles de degradar. La biodegradación, que para muchos contaminantes es el principal mecanismo de degradación, es limitada en el caso de los COP. La dificultad de degradación de COP se atribuye a su estructura química estable (gran tamaño molecular y alto número de cloros), a su carácter xenobiótico y a su baja biodisponibilidad, dada su baja solubilidad en agua y fuerte adsorción al suelo (Hatzinger y Alexander, 1995; Focht, 2003). Por lo tanto, el éxito de la bioremediación para tratar compuestos de tipo COP todavía es limitado. Por ello, las técnicas más usadas en el control de la contaminación por estos compuestos son la incineración, la excavación y disposición en rellenos sanitarios de seguridad y el aislamiento del contaminante en el sitio, mediante capas que eviten o disminuyan su dispersión y su contacto con organismos del tope de la pirámide trófica (Layton et al., 1998; EPA, 2000; Magar, 2003; Ross, 2004).

Los COP se consideran compuestos xenobióticos (que fueron sintetizados por primera vez por el ser humano) y, por lo tanto, que son foráneos del medioambiente y la microbiota. Sin embargo, en los últimos años se ha encontrado que más de 3.000 moléculas órganocloradas se producen naturalmente por organismos tales como bacterias, hongos, insectos, organismos marinos, plantas y mamíferos, así como también, mediante procesos abióticos tales como actividad volcánica e incendios forestales (Gribble, 2003; Haggblom y Bossert, 2003; Meharg y Killham, 2003; van Pée y Unversucht, 2003). De esta forma, en los microorganismos han evolucionado varios mecanismos para la degradación de compuestos organoclorados (Fetzner, 1998; Haggblom y Bossert, 2003; van Pée y Unversucht, 2003). De hecho, se considera que la degradación microbiana de dichos compuestos es el mayor mecanismo que previene su acumulación en el ambiente. En este sentido, se puede hablar de ciclos biogeoquímicos de compuestos organoclorados, de la misma forma como se habla del ciclo del carbono o del ciclo del nitrógeno etc., (Haggblom y Bossert, 2003). No obstante, en el último siglo, la producción industrial de compuestos haloorgánicos incrementó dramáticamente la carga y la variedad de dichos compuestos en el pla-neta. Mantener esta tendencia y no compensarla con el incremento de la taza de degradación, ocasionará acumulación de dichos contaminantes, con el consecuente incremento de los riesgos para la salud humana y el medio ambiente. Esta situación es especialmente preocupante en los casos de las moléculas más resistentes para la biodegradación como los COP.

Ahora bien, son conocidas numerosas bacterias y hongos que pueden degradar compuestos haloorgánicos en diversas rutas metabólicas bajo condiciones aeróbicas y anaeróbicas. La biodegradación de moléculas haloorgánicas ocurre, por suerte, con enzimas no específicas (co-metabolismo) o mediante enzimas altamente específicas que tienen como fin el de aprovechar tales moléculas como fuente de nutrientes y/o energía que aportan al crecimiento de dichos microorganismos (Alexander, 1999).

En el co-metabolismo el papel natural de la enzima de degradación es el metabolismo de otra molécula (normalmente no contaminante), pero, dada la baja especifidad de la enzima, afortunadamente esta podría degradar contaminantes con estructuras semejantes. Normalmente este proceso es lento, no completo (degradación parcial) y además, los microorganismos que lo realizan no se benefician de tal proceso. Por el contrario, tal proceso podría ser inhibitorio para los microorganismos, dado que la enzima puede estar ocupada con el sustrato equivocado (inhibición competitiva) o el producto de la reacción ser tóxico (Ensign et al., 1992; Mars et al., 1998; van Hylckama Vlieg y Janssen, 2001). A pesar de la ineficiencia del co-metabolismo, a veces se usa este tipo de reacciones en biorremediación a nivel de campo, siempre y cuando no exista una mejor opción. Los dos ejemplos más importantes de procesos de co-metabolismo de contaminantes haloorgánicos son la oxidación de solventes clorados como PCE y TCE, y de bifenilos policlorados (PCB; Alvarez-Cohen y Speitel, 2001; Arp et al., 2001; Pieper, 2005).

En otros casos el contaminante puede servir a los microorganismos como una fuente de uno o más elementos esenciales para su crecimiento (carbono, nitrógeno, fósforo, o energía; Alexander, 1999). En este escenario la biodegradación está relacionada con el crecimiento de los microorganismos. Para este tipo de degradación las enzimas son normalmente específicas y, por tanto, la tasa de reacción es mucho más rápida. Además, en tales casos la contaminación da una ventaja ecológica a los microorga-nismos que llevan a cabo el proceso de degradación, pues al hallar una fuente de energía su población irá en aumento y, a su vez se incrementará la tasa de degradación en mayor medida (Alexander, 1999).

Para la estimulación de la degradación de un contaminante se puede considerar la ruta metabólica de la degradación y sus requerimientos; así como la fisiología de la bacteria que produce la degradación. Entre los factores más importantes encontramos: 1) el papel del contaminante en la reacción, e.g. fuente de carbono, donador de electrones, aceptor final de electrones, inhibidor (como en co-metabolismo); 2) sustratos adicionales de la reacción e.g. oxígeno; 3) el donador y aceptor final de electrones para capturar energía; 4) condiciones óptimas para el crecimiento de los microorganismos que degradan el contaminante (potencial rédox, temperatura, pH, etc.) y 5) las características del sitio contaminado (pH, nutrientes, potencial rédox, temperatura, etc.).

Los diferentes mecanismos de degradación de moléculas haloorgánicas han sido descritos en varias revisiones de literatura (Fetzner, 1998; Haggblom y Bossert, 2003; van Pée y Unversucht, 2003). En el presente texto mencionaremos tres ejemplos para mostrar el efecto de la ruta metabólica sobre los mecanismos de estimulación de los procesos de degradación. Los dos primeros ejemplos se relacionan con la deshalogenación oxidativa y deshalogenación hidrolítica. En ambos casos, la etapa clave en la degradación es la incorporación de uno o dos grupos de hidroxilos. En la deshalogenación oxidativa, la fuente de oxígeno es molecular (O2) y por tanto ocurre estrictamente en condiciones aeróbicas, mientras que en la deshalogenación hidrolítica la fuente del oxígeno es la molécula de agua y puede ocurrir bajo diversas condiciones rédox, según el requerimiento del aceptor de electrones de la bacteria responsable por esta reacción (respiración aeróbica, desnitrificación, etc.).

Un tercer ejemplo tiene que ver con la deshalogenación reductiva, en donde el átomo de cloruro se reemplaza por un átomo de hidrógeno y dos electrones (Holliger et al., 1999; Smidt y de Vos, 2004). Esta reacción puede ocurrir en condiciones aeróbicas o anaeróbicas. En muchos casos de deshalogenación reductiva el compuesto haloorgánico juega el papel de aceptor final de electrones en respiración anaeróbica, donde la energía liberada en la oxidación del donador de electrones se utiliza para formar gradiente de protones y posteriormente para sintetizar ATP. Este proceso se conoce con el nombre de halorespiración o deshalorespiración y las bacterias implicadas en él normalmente son anaeróbicas obligatorias. En este sentido, para estimular la halorespiración es necesario asegurar las condiciones anaeróbicas y adicionar fuentes de carbono y un donador de electrones (e.g. hidrógeno).

Los Bifenilos Policlorados (PCB) fueron utilizados ampliamente desde 1929 hasta 1978 en equipos eléctricos como transformadores, condensadores, intercambiadores de calor, sistemas hidráulicos, así como también en la fabricación de pinturas y plásticos. Aproximadamente, se han producido en el mundo 1’324.000 toneladas de PCB que en gran cantidad han ocasionado contaminación al medio ambiente (Iwata et al., 1993; Breivik et al., 2002a; Breivik et al., 2002b; Meijer et al., 2003; Breivik et al., 2007). Al respecto, se estima que solamente en el río Hudson en Estados Unidos fueron liberados entre 95 a 603 toneladas de PCB (EPA, 2000).

Las moléculas de PCB se componen de dos anillos de fenilos con 1 a 10 átomos de cloro (Fig. 1). Existen 209 posibles congéneres de los PCB, de acuerdo a la cantidad y posición de los cloros. Aproximadamente 189 congéneres fueron identificados en mezclas comerciales, 36 de los cuales están considerados como los más significativos por su abundancia y alta toxicidad (McFarland y Clarke, 1989). Es importante mencionar que los PCB fueron comercializados en diferentes mezclas, caracterizadas por el grado de clorización, e.g., Aroclor 1221, 1242 y 1260 contienen respectivamente, 21%, 42% y 60% de cloros en peso. Existe, sin embargo, gran diferencia entre los distintos congéneres de PCB en cuanto a su comportamiento ambiental (persistencia, sorpción, transporte y bioacumulación) y toxicidad. En este sentido, los PCB con mayor cantidad de cloros son más resistentes, se adsorben con más fuerza al suelo o sedimento y tienen mayor tendencia a bioacumularse. Por ejemplo, la solubilidad de PCB cambia de 6 ppm en monoclorobifenil a 0,007 ppm en octaclorobifenil (Borja et al., 2005). Los congéneres más tóxicos presentan una conformación “co-planar”. Dichos congéneres no tiene cloros en posición orto, por el contrario, tienen cloros en las dos posiciones para y, por lo menos, en las dos posiciones meta. Estas moléculas se parecen estereo-química y toxicológicamente a 2,3,7,8-tetraclorodibenzo-p-dioxin (TCDD) y, por lo tanto, se denominan “como-dioxin” (Dioxin-like; McFarland y Clarke, 1989). Según la lista, elaborada por la Organización Mundial de la Salud, de las Toxicidades Equivalentes a Dioxinas (TEQ por su siglas en inglés) de varios compuestos de “como-dioxin”, la TEQ de distintos congéneres de PCB varía de 0,00001 a 0,1, en comparación con la máxima TEQ de 1,0 que fue asignada a 2,3,7,8-TCDD (van den Berg et al., 1998; van den Berg et al., 2006; Haws et al., 2006).

Para llevar a cabo la remediación de un sitio contaminado con PCB hay que tener en cuenta que la contaminación es una mezcla de congéneres. Esto es especialmente clave cuando se trata de degradación biológica. Las enzimas que catalizan la degradación presentan un rango limitado de moléculas que pueden ser degradadas y hasta la fecha, aún no ha apareció la “Súper-Bacteria”, de tal suerte que para la biorremediación de sitios contaminados con PCB es mejor contar con la comunidad microbiana. La degradación secuencial anaeróbica-aeróbica es especialmente importante para PCB, ya que los congéneres con mayor número de cloros se transforman exclusivamente en condiciones anaeróbicas en procesos de deshalogenación reductiva y los productos de declorinación, congéneres de menor número de cloros, se degradan exclusivamente en condiciones aeróbicas (Wiegel y Wu, 2000; Abraham et al., 2002; Master et al., 2002). Esta combinación es mucho más importante en las mezclas comerciales de mayor clorización del PCB (e.g. Aroclor 1260), e.g., la incubación anaeróbica (cuatro meses) antes de la incubación aeróbica con la cepa LB400 fue indispensable para la degradación de Aroclor 1260 (Master et al., 2002), mientras que mejoró solo un poco (70% versus 67%) la degradación aeróbica de Aroclor 1248 con la misma cepa (Evans et al., 1996).

Aunque la investigación sobre la biodegradación y biorremediación de PCB se ha adelantado consideradamente en los últimos 25 años (para revisiones de literaturas véase Bedard y Quensen, 1995; Furukawa, 2000b; Wiegel y Wu, 2000; Abraham et al., 2002; Bedard, 2003; Magar, 2003; Ohtsubo et al., 2004; Pieper, 2005), todavía existen múltiples barreras que han de superarse para lograr un tratamiento eficaz que pueda disminuir las concentraciones de PCB a niveles aceptables (Tiedje et al., 2002). Las barreras son: 1) la baja solubilidad y biodisponibilidad de PCB; 2) la baja eficiencia de deshalogenación anaeróbica; 3) la baja eficiencia de degradación aeróbica; 4) ambos procesos (anaeróbicos y aeróbicos) degradan preferiblemente PCB sin substitución de cloro en posición de orto, lo que resulta en la acumulación de productos orto. En lo que sigue discutiremos cada barrera y las estrategias para superarlas.

La biodisponibilidad de compuestos orgánicos se considera una de las más importantes causas que influyen en la tasa de degradación, además de que la baja disponibilidad es considerada como un factor importante que hace a un compuesto recalcitrante (Alexander, 1999; Focht, 2003). Este factor podría limitar tanto la degradación aeróbica como la anaeróbica. Adicionalmente, se considera que la baja disponibilidad es uno de los factores primordiales que explican porqué las metodologías que funcionan en el laboratorio, no funcionan en el campo. En este sentido, la adsorción de compuestos orgánicos al suelo con el tiempo va fortaleciéndose y, por lo tanto, la descontaminación de sitios que fueron contaminados años atrás es más compleja y difícil (Hatzinger y Alexander, 1995; Alexander, 1999; Alexander, 2000).

Algunos intentos de superar esta barrera se han concentrando en la aplicación de surfactantes (e.g. Singer et al., 2000; Fava y Piccolo, 2002; Ferrer et al., 2003). Sin embargo, el éxito de dicho método aún se encuentra limitado. Esto puede explicarse debido a la toxicidad de varios surfactantes para los microorganismos y por el entrampamiento de PCB en las micelas que no genera ningún aumento de la biodisponibilidad (Ohtsubo et al., 2004). Adicionalmente, la inhibición de la degradación puede atribuirse al hecho de que los surfactantes pueden cambiar la composición de la comunidad microbiana, estimulándo bacterias que pueden degradar tales surfactantes (Colores et al., 2000). Además, el surfactante puede disociar las bacterias que están adsorbidas junto a los contaminantes en la matriz y, por lo tanto, alejarlas de estos (Stelmack et al., 1999). En condiciones anaeróbicas es posible que la adsorción de bacterias y PCB en el mismo sólido estimule su deshalogenación (Arbeli y Ronen, 2003), y existen especulaciones acerca de que compuestos como los PCB se deshalogenan, también, en su forma adsorbida o sólida (Ballerstedt et al., 2004; Arbeli et al., 2006), tal vez de una manera semejante a la reducción de hierro sólido (Ruebush et al., 2006).

Varios estudios han mostrado que los surfactantes de la familia “Tween” son menos tóxicos que otros (Laha y Luthy, 1992; Van Hoof y Jafvert, 1996; Yeh et al., 1998). Además, se encontraron que los surfactantes Tween 60, 61 y 65 pueden servir como fuente de carbono y donadores de electrones para la deshalogenación reductiva de hexaclorobenzeno (HCB; Yeh y Pavlostathis, 2005). Tween 80 estimuló la deshalogenación reductiva de HCB (hasta cinco veces más) en concentraciones bajas o iguales a la concentración micelar crítica (30-1200 mg/L), pero, inhibó el proceso en concentraciones significativamente mayores (1,500-5,000 mg/L) (Van Hoof y Jafvert, 1996). Por otro lado, Tween 80 inhibió varias cepas de Dehalococcoides spp. (Amos et al., 2007). Aunque el último estudio fue dirigido para realizar deshalogenación de tetracloroetileno (PCE), diferentes estudios han mostrado la importancia de dicho género y otros relacionados en la deshalogenación de PCB (Bunge et al., 2003; Fennell et al., 2004; Fagervolt et al., 2005; Watts et al., 2005; Yoshida et al., 2005; Yan et al., 2006; Kjellerup et al., 2008). Es posible que los biosurfactantes tengan mayor éxito en la remediación, dado que tienen menor toxicidad y son más biodegradables (Golyshin et al., 1999; Ron y Rosenberg, 2001; Makkar y Rockne, 2003; Fava etal., 2003; Mulligan, 2005) y, al menos, un estudio ha mostrado que el biosurfactante rhamnolipid estimuló la deshalogenación reductiva de PCB (Cho et al., 2004). Con todo, un mayor conocimiento sobre la compleja interacción entre suelo, surfactante, contaminante y micro-organismos puede ayudar en el diseño de mejores estrategias para la aplicación de surfactantes en la remediación de sitios contaminados (Pieper, 2005).

El metabolismo anaeróbico de PCB se produce mediante deshalogenación reductiva. Actualmente se conocen ocho procesos distintos de declorinación reductiva de PCB según su selectividad, la posición del cloro y de los cloros vecinos. Estos procesos han sido descritos con más detalle en otras revisiones (Bedard y Quensen, 1995; Wiegel y Wu, 2000; Bedard, 2003). Varios estudios indican que diversos procesos son realizados por distintos grupos de bacterias (e.g Wu et al., 1997; Cutter et al., 2001; Wu et al., 2002; Kjellerup et al., 2008). El proceso más común es la desclorización de un cloro en posición meta o para situados entre dos cloros (Doble Flanked). El que lo sigue es la declorización de cloro en posición meta o para situados al lado de un cloro (Flanked). Y menos comunes que los anteriores es la declorización de los cloros sin otros cloros al lado en posiciones meta o para (Bedard, 2003). La declorización menos común se desarrolla en posición orto. Este proceso fue observado en el laboratorio, aunque para congéneres de menor importancia en mezclas comerciales de PCB (Berkaw et al., 1996; Wu et al., 1997; Kuipers et al., 1999). Teniendo en cuenta lo anterior, la combinación de dos o más procesos complementarios es ideal para lograr mayor desclorización. Este tipo de combinación ha sido observada en algunos sitios (Bedard, 2003). Los productos dominantes (pero no exclusivos) de esta etapa son PCB con menos cloros: entre uno a tres cloros en posiciones orto y orto + para (Evans et al., 1996; Maltseva et al., 1999). Por ejemplo, 2-, 4-, 2,4-, 2,6-, 2,2’-, 2,4’-, 2,2’,4-, y 2,4,4’-clorobifeniles fueron 70 a 85% (molar) de los productos de desclorización anaeróbica de Aroclor 1242 (Maltseva et al., 1999).

La investigación sobre la deshalogenación reductiva de PCB ha presentado por muchos años dificultades al cultivar las bacterias que llevan a cabo dicha deshalogenación. Sin embargo, se ha logrado un gran avance en los últimos años, inicialmente al ser identificadas las cepas o-17 y DF-1, filogenéticamente cercanas a Dehalococcoides, como las responsables de la desclorización de PCB en cultivos de enriquecimiento (Cutter et al., 2001; Wu et al., 2002). Posteriormente, se descubrió que los cultivos puros de Dehalococcoides cepa 195 y cepa CBDB1 pueden deshalogenar PCB, dioxinas polycloradas y furanas polycloradas (Bunge et al., 2003; Fennell et al., 2004). Finalmente, algunos estudios que emplearon métodos moleculares con muestras ambientales han establecido la importancia del género Dehalococcoides y otras filogenéticamente cercanas en la deshalogenación reductiva de PCB y dioxinas clorados (Fagervolt et al., 2005; Watts et al., 2005; Yoshida et al., 2005; Yan et al., 2006; Kjellerup et al., 2008). Una de estas cepas, DF-1, ha sido aislada recientemente (May et al., 2008) y su genoma está en proceso de secuenciación (http://genomesonline.org/index.htm). Estos nuevos resultados seguramente van a ampliar el conocimiento sobre la deshalogenación reductiva de PCB en los próximos años y, en gran medida, esto redundará en el mejoramiento del proceso de biorremediación en el campo.

1. Adición de fuente de carbono y donador de electrones. En condiciones naturales (suelo, sedimento etc.) el carbono se considera como el nutriente limitante para el crecimiento bacteriano (Aldén et al., 2001; Koch et al., 2001). Dado que en el proceso anaeróbico el PCB sirve como aceptor de electrones, y los anillos aromáticos quedan intactos, las bacterias que preforman la halorespiración necesitan una fuente adicional de carbono y donador de electrones para estimular el proceso (Nies y Vogel ,1990; Wiegel y Wu, 2000). Además, la adición de una fuente de carbono estimulará el consumo de aceptores de electrones alternativos que podrían inhibir la deshalogenación (Arbeli et al., 2006). Por lo tanto, el primer nutriente para lograr la biostimulación de la deshalogenación reductiva es probablemente el carbono.

Varios estudios (uno, específicamente, sobre sedimentos del río Bogotá, Gracía-Chaves et al., 2007) han mostrado que la adición de fuentes de carbono estimula la dehalogenación reductiva (Leahy y Shreve, 2000; Aulenta et al., 2005). Normalmente, los halorespiradores pueden utilizar sustratos de uno a tres carbonos (Holliger et al., 1999), aunque es posible agregar fuentes de carbono más complejas como glucosa, molasa o almidón. En condiciones anaeróbicas dichas fuentes de carbono serán fer-mentadas a alcoholes, ácidos grasos e hidrógeno que pueden alimentar los halorespiradores. Actualmente no hay una única fuente de carbono que se considere ideal para estimular la dehalogenación anaeróbica de PCB (Wiegel y Wu, 2000). Dado que este proceso se lleva a cabo por diferentes bacterias, es lógico que bacterias distintas, necesiten fuentes distintas de carbono, por ejemplo, la cepa o-17 se estimula por acetato (Holoman et al., 1998; Cutter et al., 2001), mientras la cepa DF-1 puede cre-cer con formato (Wu et al., 2002). Por su reactor Tiedje et al., 2002, han sugerido utilizar fuentes de carbono simples como el etanol, que no influirá en la biodisponibilidad de PCB.

Además del carbono otros nutrientes pueden ser limitantes entre los que se cuentan el nitrógeno, el fósforo y las vitaminas. En ensayos de laboratorio se usan normal-mente productos tales como extractos de levadura o de carne para suplir dichos nutrientes. Sin embargo, en los procesos de biorremediación en el campo pueden utilizarse productos económicos que contienen estos nutrientes. Por ejemplo, el Environmental Protection Agency de EEUU (EPA) ha desarrollado un protocolo de bioestimulación de degradación anaeróbica de toxafeno utilizando sangre de ani-males como fuente de nutrientes (EPA, 2005).

2. Adición de otro compuesto halogenado. Múltiples estudios han demostrado que la deshalogenación reductiva de PCB podría ser estimulada mediante la adición de otros compuestos halogenados como bifeniles (e.g. 2,6-dibromobifenil) y benzoatos halogenados (Van Dort, et al., 1997; Bedard et al., 1998; DeWeerd y Bedard, 1999; Cho et al., 2002). Dichos compuestos probablemente son aceptores de electrones preferibles por los halorespiradores, estimulando el crecimiento de estas bacterias y, como consecuencia, incrementando además la tasa de deshalogención de PCB. Esta estrategia ha sido probada en campo exitosamente (Bedard et al., 1995). Aparentemente, esta es unas de las estrategias más exitosas para la estimulación de la deshalogenación reductiva de PCB, pero, el mayor reto aún es encontrar un compuesto ambientalmente seguro y económico que pueda ser utilizado a escala real.

3. Adición de FeSO4. Otra estrategia probada exitosamente en estudios de laboratorio es la adición de FeSO4 (Zwiernik et al., 1998). En uno de estos estudios se agregaron 10 mM de FeSO4 al sedimento del río Hudson, inoculado en un caldo de cultivo en condiciones anaeróbicas. La declorización de PCB (Aroclor 1242), preliminarmente en posición meta y para, se incrementó considerablemente. Los autores sugieren que en este caso los deshalogenadores son reductores de sulfato. El sulfato sirve para aumentar dichas bacterias, de tal modo que cuando se agota el sulfato, se inicia el proceso de deshalogenización del PCB. El papel del hierro se aprecia en la titración de sulfides generados en la reducción de sulfato que podrían ser tóxicos para el proceso de la deshalogenación reductiva (Zwiernik et al., 1998). Este estudio parece ser prometedor, dado que FeSO4 es relativamente económico y no presenta efectos negativos para el medio ambiente. Sin embargo, hasta donde he investigado, esta estrategia no se ha probado en otros estudios. Aunque Tiedje et al., 2002, agregaron FeSO4 a su reactor, no han comparado este reactor con uno sin FeSO4, además, el alcance del estudio no está completamente claro. Adicionalmente, en los últimos años, los estudios han resaltado la importancia de las bacterias de la familia de Dehalococcoides en la deshalogenación anaeróbica de PCB. Hasta donde se sabe, dichas bacterias no son reductoras de sulfato (Kube et al., 2005; Seshadri et al., 2005) siendo contradictorio con la hipótesis de Zwiernik et al., (1998).

4. Bioaumentación. La bioaumentación (adición de bacterias deshalogenantes al sitio contaminado) podría ser beneficiosa en ambientes donde no se encuentran bacterias con capacidad de deshalogenación de PCB. Para la deshalogenación de mezclas de PCB es probable que sea necesario agregar consorcios microbianos con amplia capacidad de deshalogenación reductiva. Dado que en diversos lugares se han encontrado diferentes procesos de deshalogenación, es posible que al someter el PCB a dos poblaciones bacterianas con actividades compatibles resulte un proceso de deshalogenación más completo (Tiedje et al., 2002). Varios estudios han mostrado la factibilidad de bioaumentación en dehalogenación reductiva de PCB (Natarajan et al., 1996; Natarajan et al., 1997; Tiedje et al., 2002), mientras que, por el contrario, otros ensayos han fallado (Wu y Wiegel, 1997; Bedard et al., 1997).

El ensayo de Tiedje et al., 2002, es ejemplo exitoso de bioaumentación al nivel de laboratorio, demostrando también la complejidad de la bioaumentación. Los autores adicionaron a un suelo contaminado cultivos de enriquecimiento de dos orígenes distintos que pueden llevar acabo procesos complementarios de deshalogenación: 1) sedimento de Silver Lake que presenta capacidad de deshalogenar PCB altamente clorados, pero su alcance es limitado dado que puede deshalogenar solo cloros en posición meta adyacentes a otro cloro (proceso N: Wiegel y Wu, 2000); 2) sedimento de río Hudson con la capacidad limitada en la deshalogenación de PCB altamente clorados pero pueden remover cloros de posiciones meta y para sin necesidad de que haya presencia de cloro adyacente (proceso M y Q respectivamente: Wiegel y Wu, 2000; Quensen et al., 1990, Tiedje et al., 2002). Al contrario de lo esperado al combinar estos dos sedimentos se expresó principalmente el proceso M frente a una tasa insignificante de los procesos N (del Silver Lake) y Q (del río Hudson). Por otro lado, fue mucho más exitoso adicionar microorganismos enriquecidos de sedimento del Silver Lake, dejándolos actuar para expresar el proceso N y, posteriormente, para deshalogenar los productos de dicho proceso, agregar el cultivo de sedimento del río Hudson que expresa los procesos M y Q. La combinación de los tres procesos dió como resultado la acumulación de congéneres con cloros en posición orto. El porcentaje de congéneres que tienen cloros solo en posición orto se incrementó del 1% en Aroclor 1260 al 39% en los productos de la deshalogenacion.

LA BAJA EFICIENCIA DE DEGRADACIÓN AERÓBICA

La degradación aeróbica es considerada un proceso de co-metabolismo (Hernandez et al., 1995; Pieper, 2005), aunque existen ejemplos de crecimiento de bacterias copladas a la degradación de mono, di o tri-clorobifeniles (Potrawfke et al., 1998; Kim y Picardal, 2000; Kim y Picardal, 2001, Adebusoye et al., 2008b). En ambos casos el proceso está catalizado por enzimas especializadas en la degradación de bifenil (la ruta de bifenil -bph) o compuestos aromáticos similares. Afortunadamente, estas enzimas también pueden catalizar la degradación de bifeniles clorados. Sin embargo, dado que el sustrato “natural” de estas enzimas es bifenil, la tasa de degradación de PCB es mucho menor y, en muchos casos, se forman productos no completos de degradación. Estos productos y los de la degradación de clorobenzoato (e.g. catecol clorado) pueden inhibir la degradación o ser tóxicos a las bacteria (Bartels et al., 1984; Sondossi et al., 1992; Stratford et al., 1996; Blasco et al., 1997; Dai et al., 2002; Hiraoka et al., 2002; Vaillancourt et al., 2002; Cámara et al., 2004; Parnell et al., 2006). La ruta metabólica de la degradación de bifenil, su genética y sus enzimas fueron estudiadas ampliamente (Ohtsubo et al., 2004; Pieper, 2005). En esta ruta, el bifenil se convierte en ácido benzoico y en ácido 2 hidroxi-penta-2,4-dienoico (Fig 2). Este último, se convierte, a su vez, en acetil-Co-A y piruvato que alimentan el ciclo de Krebs. Para muchas bacterias el producto final de la degradación de bifenil o PCB es el benzoato o el clorobenzoato respectivamente (Pieper, 2005), mientras que otras bacterias pueden metabolizar también benzoato y clorobenzoato (Arensdorf y Focht, 1994; Potrawfke et al., 1998; Kim y Picardal, 2000, 2001; Kitagawa et al., 2001; Adebusoye et al., 2008a).

Las moléculas aromáticas son antiguas y abundantes en la naturaleza e ingresan al ambiente a través de múltiples rutas, tales como: actividades geotérmicas y volcánicas, cometas y polvo espacial, y mediante su producción en plantas (Liu et al., 2004; Singer et al., 2003; Singer et al., 2004). De acuerdo con esto, las bacterias degradadoras de PCB son abundantes y diversas (Pieper, 2005; Leigh et al., 2006) y se hallan también en suelos o sedimentos no contaminados (Macedo et al., 2007).

Se aislaron degradadores de PCB de diversos géneros tales como Pseudomonas, Burkholderia, Achromobacter, Comamonas, Ralstonia, Sphingomonas, Acinetobacter, Rhodococcus y Bacillus (Pieper, 2005). Es importante resaltar que bacterias aisladas no necesariamente representan la comunidad nativa ni a los degradadores importantes del suelo (e.g. Tillmann et al., 2005; Ritz, 2007). Por ejemplo, el análisis de un suelo con métodos independientes de cultivo indicó que bacterias de los géneros Pseudonocardia, Kribella, Nocardiodes y Sphingomonas son las degradadoras dominantes de bifenil, mientras que los Rhodococcus ssp. representaron el 73% de los aislamientos (Leigh et al., 2007). Los genes de degradación están ubicados en plásmidos u otros elementos genéticos móviles (Nishi et al., 2000; Stecker et al., 2003; Takeda et al., 2004; Pieper, 2005). Por lo tanto, la degradación aeróbica de PCB no se puede correlacionar con un género particular de bacterias. Es decir, aunque muchas cepas degradadoras se encuentren en algunos géneros (e.g. los mencionados arriba) no todos los miembros de estos géneros son degradadores de PCB y, además, no son los únicos géneros que pueden degradar PCB. En este sentido, la presencia o ausencia de dichos géneros en un sitio contaminado con PCB, de ninguna manera puede utilizarse como indicador de la degradación de tales compuestos.

Un mejor indicador para el potencial degradativo de PCB de una comunidad microbiana es la identificación de los genes de degradación. Estos genes pueden ser detectados mediante técnicas moleculares como PCR, o hibridización con cebadores o sondas específicas para dichos genes (Erb y Wagner-Döbler, 1993; Leigh et al., 2007). Sin embargo, también hay variabilidad en tales genes y por tal motivo hay que tener cuidado al interpretar los resultados de este tipo de estudios. Las enzimas de degradación de PCB conocidas hasta la fecha pertenecen a una misma familia y, probablemente, tienen un ancestro común. Sin embargo, estas enzimas presentan gran variabilidad (Asturias et al., 1995; Masai et al., 1995; Fortin et al., 2005; Pieper, 2005). Por ejemplo, las enzimas BphA de Rhodococcus globerulus P6 y Rhodococcus sp. sepa RHA1 son más cercanas filogénicamente a las dioxigenasas del tulueno que al BphA de las cepas Burkholderia xenovorans LB400 y Pseudomonas pseudoalcaligenes KF707 (Asturias et al., 1995; Masai et al., 1995). Finalmente, se debe recordar que, hasta la fecha, la mayoría de los estudios han analizado enzimas de degradación originadas por bacterias aisladas y, por lo tanto, no necesariamente son buenas representantes de las enzimas más importantes en el campo (e.g. Leigh et al., 2007). Se espera que los métodos moleculares independientes del cultivo brinden una mejor aproximación sobre las enzimas importantes in situ (Leigh et al., 2007; Suenaga et al., 2007).

La degradación de bifenil es llevada a cabo mediante una serie de enzimas (Fig 2). En este sentido, si la primera enzima no puede metabolizar un congénere, la degradación no se obtendrá. Al contrario, si una enzima en la mitad de esta cadena no podría metabolizar el metabolito clorado, este metabolito se acumulará. La primer enzima, BphA, tiene todavía mayor influencia dado su regioespecifidad de la dioxigenación, es decir, los carbonos que preferiblemente va a oxidar, influyen en la eficacia del catálisis de las siguientes enzimas en la ruta (Cámara et al., 2007).

Un ejemplo de la especifidad de BphA para diferentes congéneres tiene que ver con los dos grupos BphA en bacterias gram negativas (Mondello et al., 1997). El primer grupo de BphA tiene un rango relativamente estrecho de congéneres y, normalmente, puede degradar congéneres con pocos cloros (hasta cutro cloros) y puede oxidar exclusivamente los carbonos 2 y 3 (Fig 2). Los tetraclorobifeniles con cloros en posición 2 y 5 son sustratos pobres para estas enzimas y, hasta la fecha, ninguno de ellos puede degradar 2,5,2’,5’-CB. Por otro lado, dichas enzimas son superiores en la degradación de congéneres en dos cloros en las posiciones para como 4,4’-CB y 4,2,4’-CB. El representante más estudiado de este grupo es el Pseudomonas pseudoalcaligenes KF707 (Furukawa y Miyazaki, 1986). El segundo grupo de enzimas tiene un rango relativamente amplio de congéneres que se pueden degradar y una mayor flexibilidad en la posición de los carbonos que pueden oxidarse. Estas enzimas pueden oxidar congéneres con un alto número de cloros (hasta seis sustituciones por bifenil) y tienen la capacidad de oxidar los carbonos de posición 3 y 4, lo que permite la oxidación de 2,5,2’,5’-CB. Por otro lado, los congéneres en dos cloros en las posiciones para como 4,4’-CB y 4,2,4’-CB son degradados más lentamente por estas enzimas. El representante más estudiado de este grupo es el Burkholderia xenovorans LB400 (antes Pseudomonas; Bopp, 1986).

Diferentes congéneres pueden tener diversos cuellos de botella en la cadena metabólica, que va a dar como resultado una acumulación de distintos metabolitos. Como se mencionó anteriormente, algunos de estos metabolitos son tóxicos y la degradación, afortunada para nosotros, resulta ser un suicidio para la bacteria. En los estudios acerca de estos cuellos de botella se han identificado las enzimas BphA (Seeger et al., 1995; Brühlmann y Chen, 1999), BphC (Dai et al., 2002) y BphD (Seah et al., 2000). La enzima BphB tiene un rango relativamente amplio de degradación y normalmente no limita la degradación de PCB (Pieper, 2005), pero cuando la BphA fue mejorada genéticamente, la BphB se convirtió nuevamente en el cuello de botella (Brühlmann y Chen, 1999). El cuello de botella depende del congénere y la bacteria. Así pues, diferentes bacterias tienen distintos rango de bifeniles para degradar. Sin embargo, se pueden hacer varias generalizaciones (Furukawa et al., 1978):

1. La degradación aeróbica es más eficiente con un menor número de cloros (normalmente entre 1-3 cloros), lenta y limitada en 4-6 y prácticamente ausente con un número mayor a 6 cloros.

2. La oxidación del PCB ocurre en posición 2 y 3.

4. Generalmente los PCB que contienen todos los cloros en el mismo anillo se degradan más rápido que aquellos que contienen el mismo número de cloros, pero que se distribuyen entre los dos anillos.

5. El rompimiento aeróbico del anillo aromático ocurre en el anillo que posee un número menor de cloros.

6. Existen excepciones, y las reglas mencionadas arriba son únicamente generalizaciones. Por ejemplo, hay reportes sobre la degradación de 2,2’-bifenil (Kim y Picardal, 2001), o sobre el ataque preferido al anillo clorado (Kim y Picardal, 2001), o a la oxidación de posiciones 3 y 4 (Seeger et al., 1999) etc.

Biodegradación de clorobenzoato. Uno de las factores claves para el éxito de la degradación de PCB es la mineralización eficaz del clorobenzoato (Bedrard, 2003; Pieper, 2005). La degradación parcial del clorobenzoato produce metabolitos tóxicos tales como clorocatecol, protoanemonin y ácido 5-cloroformil-2-hidroxipenta-2,4-dienoi-co (Bartels et al., 1984; Sondossi et al., 1992; Arensdorf y Focht, 1994; Blasco et al., 1997; Pérez-Pantoja et al., 2003; Denef et al., 2006; Martínez et al., 2007). Dichos me-tabolitos pueden acumularse dado que muchas bacterias tienen rutas no completas de degradación de clorobenzoato (Pavlu et al., 1999; Bedrard, 2003; Pieper, 2005). Algunos autores han encontrado dificultades para enriquecer degradadores de clorobenzoato (Brunsbach y Reineke, 1993; Pavlu et al., 1999), mientras que otros han encontrado que dichos degradadores son abundantes y diversos en suelos prístinos (Fulthorpe et al., 1996; Fulthorpe et al., 1998).

La degradación depende de la estructura del clorobenzoato (número y posición de los cloros) y en muchos casos diferentes bacterias degradan diferentes clorobenzoatos (Pavlu et al., 1999). Lo anterior es importante, dado que en sitios contaminados con mezcla de PCB se espera encontrar mezclas de productos de clorobenzoato. Las diferentes rutas de degradación fueron descritas por Peel y Wyndham, 1997 y Pieper, 2005, algunas de éstas serán mencionadas brevemente en lo que sigue.

El clorobenzoato puede transformarse en clorocatecol (e.g. la ruta de clc: Dorn y Knackmuss, 1978), la hidroliza de 4-clorobenzoato produce un 4-hidroxibenzoato (la ruta de fcb: Klages y Lingens, 1979), la dioxigenación de 3-clorobenzoato y 3,4-diclorobenzoato en posición 4 y 5 produce 5-cloroprotocatechuato (Nakatsu y Wyndham 1993). En la medida en que se planee la bioaumentación con degradadores de clorobenzoato, será prudente elegir rutas que no generen productos tóxicos (Blasco et al., 1997). La ruta de 3-oxoadipate (Pieper, 2005) genera el potente antibiótico protoanemonin (Blasco et al., 1997), y la ruta de “meta cleavage” que convierte a 3-clorocatecol en ácido 5-cloroformil-2-hidroxipenta-2,4-dienoico se considera como una reacción de suicidio (Bartels et al., 1984). Aparentemente las rutas preferidas son aquellas que eliminan el cloro en la primera etapa de oxidación y la “orto cleavage” de clorocatecol (Blasco et al., 1997; Tiedje et al., 2002). Adicionalmente, es importante anotar que la bacteria debe tener un buen balance entre la producción y eliminación de metabolitos, de tal manera que los productos tóxicos nunca se acumulen. En este sentido, la consideración final tendrá que tener en cuenta cada caso particular, según el clorobenzoato específico (o la mezcla específica) y las diferentes bacterias disponibles.

Estimulación de co-metabolismo. En tanto que la degradación de PCB se hace en buena parte por co-metabolismo, donde las bacterias que llevan a cabo la degradación no pueden aprovechar el PCB por crecimiento, una de las posibles estrategias para estimular dichas bacterias es agregar una fuente de carbono adicional que estimule el crecimiento de los degradadores de PCB. La fuente ideal de carbono para estimular específicamente los degradadores de PCB, debe inducir la expresión de los genes de degradación y, además, no ser una fuente tóxica. Por ejemplo, la glucosa no es una buena elección dado que estimula un amplio rango de bacterias, y no necesariamente presenta ventajas ecológicas a los degradadores de PCB, asimismo, no induce la expresión de los genes de degradación de bifenil. Por el contrario, el bifenil puede ser el sustrato ideal, ya que los degradadores de PCB se alimentan naturalmente de este compuesto, y tiene como ventaja, el inducir los genes de degradación. De acuerdo con esto, algunos trabajos han mostrado que el bifenil puede estimular la degradación de PCB (Brunner et al., 1985; Harkness et al., 1993; Fava y Bertin, 1999). Sin embargo, el bifenil es carcinigénico (Focht, 2003) y, por lo tanto, no es buen candidato para ser agregado al ambiente. Algunos estudios han demostrado que sustancias derivadas de plantas, tales como flavonoides (Donnelly et al., 1994) y terpenes, específicamente carvono, limoneno y p-cimeno (Focht, 1995; Gilbert y Crowley 1997; Tandlich et al. 2001) pueden estimular la degradación de PCB. De igual manera Hernandez et al., 1997, mostraron que la adición de cáscara de naranja o follaje al suelo con PCB estimuló la degradación del contaminante y aumentó el número de degradadores de PCB. Similarmente, se ha encontrado que los degradadores de PCB (y de bacterias en general) son más numerosos cerca a las raíces y, aparentemente, diferentes degradadores de PCB presentan preferencias hacia raíces de plantas especificas (Leigh et al., 2006) lo que resalta la potencialidad de la fitorreme-diación (Pieper, 2005).

2. Bioaumentación. Los problemas mencionados sugieren que la bioaumentación sea tomada como una opción importante en la degradación aeróbica de PCB. La bioaumentación puede dar respuesta a las siguientes problemáticas:

a.La bioaumentación puede solucionar la baja concentración de degradadores de PCB. Esto es importante dado que la degradación de PCB se lleva a cabo mediante co-metabolismo y las bacterias que los degradan no crecen.

Dado que el PCB es una mezcla, puede resultar ventajoso agregar una mezcla de bacterias con capacidades complementarias para degradar diferentes congéneres relevantes de PCB y sus productos tóxicos. Una primera opción es elegir cepas conocidas o aislar nuevas para diseñar este tipo de mezcla. Es importante señalar que los criterios de elección de las cepas deben incluir, además de su capacidad de degradar diferentes congéneres o metabolitos, también su compatibilidad al ambiente, su capacidad de degradar PCB en bajas concentraciones (alta afinidad al sustrato) y alta capacidad de sobrevivir en el ambiente. Una opción alternativa tiene que ver con tomar una muestra del sitio contaminado, enriquecer las bacterias degradadoras de PCB en un reactor (por ejemplo en la presencia de bifenil y PCB) y retornar esta mezcla al ambiente contaminado. Adicionalmente, se pueden agregar consorcios bacterianos de fuentes tales como el compost o el lodo de plantas de tratamiento de agua residual (Di Toro et al., 2006). Finalmente, se pueden agregar una o más bacterias modificadas genéticamente. La última opción sigue siendo todavía teórica, dado que es prohibido liberar al ambiente este tipo de bacterias. En este sentido, la tarea de buscar nuevas bacterias con nuevos genes y con diferentes afinidades al PCB, sigue siendo todavía importante. Esta tarea podría ser facilitada a través de nuevos métodos que permitan analizar rápidamente altas cantidades de muestras (high-throughput; Kahl y Hofer, 2003; Goddard y Reymond, 2004).

3. Mejoramiento de bacterias por ingeniería genética. Es posible que la complejidad de la degradación de PCB inhiba la evolución de una bacteria que degrada PCB eficientemente. Es decir, si apareciera una mutación exitosa en la primera enzima, puede ser que la oxidación más eficiente de PCB resultare en mayor acumulación de metabolitos tóxicos. Si bien, es probable que en el futuro la evolución natural “encontrará” una solución a esta complejidad, la evolución artificial (ingeniería genética) puede acelerar el proceso. Teniendo en cuenta lo dicho, pueden considerarse varias estrategias para mejorar la capacidad de las bacterias degradadoras de PCB:

a.Modificar las enzimas para ampliar el rango de los congéneres que pueden degradar, o para aumentar la velocidad de la reacción o, en algunos casos, para reducir su sensibilidad a los productos tóxicos de la degradación (Ohnishi et al., 2004).

b.Agregar genes de degradación de clorobenzoato, de tal manera que se evite la acumulación de productos tóxicos, como el clorocatecol. Además, mejorando la capacidad de crecimiento del degradador en presencia de PCB.

c.Aumentar la expresión de los genes de degradación de PCB, por ejemplo, eliminando el sistema de control para que la expresión sea constitutiva, o cambiando el promotor para que la inducción se realice mediante otra molécula que pueda ser liberada al ambiente.

Como se mencionó anteriormente, la degradación de PCB se lleva a cabo a través de una serie de enzimas y es posible que estas deban ser modificadas en su totalidad o parcialmente. Por ejemplo, al mejorar la enzima BphA, la BphB se convierte en el cuello de botella para algunos congéneres (Brühlmann y Chen, 1999). La modificación de las enzimas puede ser planeada o, por el contrario, ejecutada al azar (Ang et al., 2005). En modificaciones planeadas se identifican aminoácidos claves, según la comparación entre dos enzimas similares con actividades distintas (Kimura et al., 1997; Mondello et al., 1997) o según la estructura tridimensional de la enzima (Suenaga et al., 2002) y se cambian tales ácidos por otros (mutagénesis en sitio dirigido).

Esta estrategia puede ahorrar mucho trabajo en el laboratorio y sirve, además, para probar hipótesis acerca de la importancia de algunos aminoácidos en la degradación, así como también, aportan en la elaboración del mecanismo de la catálisis. Sin embargo, normalmente es imposible identificar todas los aminoácidos claves y, aún más difícil, encontrar parejas o aminoácidos con efectos sinergísticos. Para encontrar estos sitios es necesario aplicar mutaciones aleatorias (Suenaga et al., 2001; Zielinski et al., 2006). En este sentido, esta última estrategia es más engorrosa y tediosa, pero se parece más a la evolución natural. De hecho, se pueden aplicar varias rondas de mutaciones: después de la primera ronda, se eligen los mejores mutantes y, a su vez, a estos mutantes se les aplica de nuevo un procedimiento de mutación aleatoria, en lo que se denomina evolución artificial (Harayama, 1998; Zhao, 2007).

Muchas investigaciones se han concentrado en el mejoramiento de la primera enzima BphA (Furukawa, 2000a, Ohtsubo et al., 2004). La subunidad BphA1 es considerada la más importante en la determinación de la especifidad para diferentes congéneres, así como también, para la determinación de la tasa de reacción (Furukawa, 2000a, Ohtsubo et al., 2004), aunque la subunidad βde la enzima también influye en esta determinación (Hurtubise et al., 1998). Los primeros trabajos probaron, de manera racional, la importancia de varios aminoácidos sobre la especifidad de la enzima para diferentes congéneres y para la posición de la oxidación (es decir, la posición en donde se insertan los hidróxidos). Estos trabajos compararon los genes bphA en Burkholderia xenovorans LB400 (antes Pseudomonas; Bopp, 1986) y Pseudomonas pseudoalcaligenes KF707 (Furukawa y Miyazaki, 1986). La gran subunidad de la primera enzima BphA1 en estas sepas difiere en 20 de 459 aminoácidos (~4,36%) y las otras 3 subunidades son similares en un 99,3 a 100% de los aminoácidos. Sin embargo, el rango de la degradación de diferentes congéneres es muy distinto (Kimura et al., 1997; Mondello et al., 1997). Con la determinación de las posiciones en donde la secuencia de estos aminoácidos se diferencia, y las mutaciones específicas en estas posiciones, se pueden identificar algunos aminoácidos que son responsables de la especifidad de la enzima (Kimura et al., 1997; Mondello et al., 1997). Por ejemplo, cambiando Thr 376 (KF707) a Asn 376 (LB400) en la sepa KF707 se amplía el rango de PCB que puede degradarse de manera similar a la sepa LB400 (Kimura et al., 1997). Asimismo, diferentes mutaciones en la misma posición dieron como resultado diferencias de especifidad para la degradación de PCB y dibenzofurano (Suenaga et al., 2006). De igual manera, cambiando Phe 336 (LB400) a Ile 336 (KF707), o Asn 338 (LB400) a Thr 338 (KF707) en la cepa LB400 se mejora su capacidad a degradar 4,4-CB (Mondello et al., 1997).

Suenaga et al., 2002, propusieron un modelo tridimensional de bphA1, confirmando la cercanía de dichas posiciones al sitio activo de la enzima. Asimismo, sus estudios ensancharon el conocimiento de la influencia de mutaciones en estas posiciones y su alrededor (Suenaga et al., 2002; Suenaga et al., 2006). Es importante señalar que hasta la fecha, el mejoramiento de la actividad de bphA para algunos congéneres, da como resultado un detrimento de su actividad en otros congéneres y aún no se ha logrado construir la “súper enzima”.

Finalmente, es posible incrementar la expresión de los genes de degradación mediante la modificación de su regulación. Esta estrategia se ha probado exitosamente por Ohtsubo et al., 2003, pues determinaron que no solamente se incrementó la tasa de degradación, sino que también se agregaron, sorprendentemente, habilidades para degradar nuevos congéneres.

La ingeniería genética aún está en el nivel de ensayos, a su vez, la aplicación de microorganismos modificados genéticamente todavía está prohibida, aunque en los últimos años se han empezado a valorar los posibles efectos de su aplicación (Aguirre de Cárcer et al., 2007). Es posible suponer que su aplicación en reactores de manera controlada pueda ser más viable, para evitar su salida al medio ambiente (e.g. me-diante esterilización). La aprobación de su uso estimulará más investigaciones en esta dirección con el propósito de construir un “súper degradador”, mejorado en todos los genes de la ruta metabólica, que contenga varias copias de dichos genes con capa-cidades complementarias para degradar diferentes congéneres, y que, además, tam-bién incluya genes de mineralización de todos los posibles clorobenzoatos, con una mayor expresión de tales genes, con capacidad de producción de surfactantes y que tienen genes de quimiotaxis por PCB.

EVALUACIÓN DE RIESGO SEGÚN SITIO Y SEGÚN CONGÉNERES O TOXICIDAD

La evaluación de riesgo fue aceptada en muchos países como herramienta importante para determinar niveles aceptables de contaminantes en el ambiente y las metas de procesos de remediación (Tarazona, 2002; Tarazona y Vega, 2002; MAVDT, 2007a; Wolska et al., 2007). Las tablas genéricas que determinan dichos niveles se refieren a los peores casos posibles para dar protección en amplias condiciones am-bientales y a toda la población. Por lo tanto, en muchas ocasiones (que no repre-sentan el peor caso posible) se pueden aceptar niveles más altos de contaminación, siempre y cuando, estos niveles no signifiquen mayor riesgo a la salud humana o al medio ambiente. Dichos niveles se determinan mediante un proceso de evaluación de riesgo y son específicos dependiendo del sitio. Por ejemplo, en el peor caso posible el riesgo de exposición por inhalación a los receptores que están a 10 m del suelo contaminado se presenta cuando el suelo no retiene (adsorbe) el contaminante (e.g. suelo arenoso), cuando el viento sopla 24 horas al día en la dirección de los recep-tores y cuando los receptores permanecen 24 horas en el lugar. Por otro lado, en la realidad el suelo puede ser orgánico y retiene fuertemente el contaminante, el viento es débil, no constante, y sopla en distintos direcciones; y los receptores permanecen en el lugar únicamente una hora al día. Evidentemente, en cada caso, el nivel máximo del contaminante en el suelo que no va a generar efectos adversos a la salud de los receptores es distinto y, por lo tanto, la meta de remediación podría ser específica para cada caso (Tarazona, 2002; Fernández et al., 2006; MAVDT, 2007a).

En el caso de los PCB puede considerarse también la variación en la toxicidad de los diferentes congéneres. Como fue mencionado anteriormente la TEQ de distintos congéneres de PCB varía de 0,00001 a 0,1, en comparación con 2,3,7,8-TCDD (McFarland y Clarke 1989; van den Berg et al., 1998; van den Berg et al., 2006; Haws et al., 2006). Las tablas genéricas que determinan niveles máximos permisibles de contaminación de PCB como conjuntos de congéneres son conservadoras considerando el peor caso posible, mientras que al analizar la concentración de los distintos congéneres en el sitio puede evaluarse mejor el riesgo según la toxicidad de cada uno. De igual manera hay que tener en cuenta que en procesos de biorremediación, los procesos aeróbicos que pueden romper el anillo aromático son más eficientes en remoción de masa, pero dado que ataca los congéneres menos clorados, son menos eficientes en la remoción de toxicidad. Por otro lado, los procesos anaeróbicos no logran el rompimiento de la molécula y, por lo tanto, la disminución en la concentración del contaminante es limitada, resultando en un bajo porcentaje de remoción de masa. Sin embargo, este proceso ataca preferiblemente congéneres más tóxicos, es decir, los congéneres co-planares, y el porcentaje de remoción de la toxicidad podría ser mucho mayor (Mousa et al., 1998; Quensen et al., 1998; Magar, 2003; Ganey y Boyd, 2005).

Revisando la literatura sobre los resultados de estudios toxicológicos y epidemio-lógicos de PCB, Ross, 2004, llegó a una conclusión todavía más radical. Dado que los únicos efectos notables sobre personas expuestas en su trabajo a elevadas concen-traciones de PCB fue la irritación de piel y ojos, y que la exposición a PCB de fuentes ambientales es mucho menor con una tendencia constante a decrecer desde la prohibición de la producción de PCB, el autor dedujo que el riesgo de PCB de fuentes ambientales es bajo. Teniendo en cuenta esta conclusión y los elevados costos de descontaminación, Ross consideró que la remediación de zonas contaminadas con PCB reporta pocos beneficios a la salud humana.

CONCLUSIONES

La degradación de PCB ha sido estudiada ampliamente. Sin embargo, su aplicación en campo es aún muy limitada. En general, es recomendable usar un esquema cons-tituido por un proceso de degradación anaeróbica, seguido por uno de degradación aeróbica, complementado todo esto con la totalidad de la comunidad microbiana que es esencial para degradar un amplio rango de congéneres, además de un gran número de productos de degradación. La complejidad de la remediación de sitios contaminados con PCB requiere de conocimientos detallados y, por tanto, es nece-sario seguir investigando y mejorando la biodisponibilidad de PCB, la deshaloge-nación reductiva y el proceso de degradación aeróbica para superar las barreras relacionadas con la biorremediación de sitios contaminados con PCB.

AGRADECIMIENTOS

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