CULTIVOS DE CÉLULAS DE NERVIO CIÁTICO Y DE GANGLIO DE LA RAÍZ DORSAL DE RATÓN ADULTO

Cell Cultures of the Sciatic Nerve and Dorsal Root Ganglia from Adult Mouse

OCHOA C¹,² Est-MSc, PERDOMO S¹ Est-PhD, MORENO CM1,² Est-PhD, VIVAS O¹,² Est-PhD, LEAL L¹,² MSc, SPINEL C¹,² PhD ¹Laboratorio de Biofísica, Centro Internacional de Física, Universidad Nacional de Colombia cmspinelg@unal.edu.co ²Departamento de Biología, Facultad de Ciencias, Universidad Nacional de Colombia (UN) Cr 30 N° 45-03, Bogotá, Colombia.

Presentado 12 de abril de 2009, aceptado 2 de julio de 2009, correcciones 18 de noviembre de 2009.

RESUMEN

Las células de Schwann (CS) son la glía de sistema nervio periférico. El diseño de prótesis nerviosas se ha centrado en la producción de CS autólogas cultivadas a partir de nervios ciáticos (NC) y de ganglios de la raíz dorsal (GRD). Muy poca literatura reporta cultivo de células perineurales (CP) y fibroblastos endoneurales (FE), y no son consideradas como elementos a incluir en una prótesis.

En este trabajo, se describe la importancia de la microdisección del nervio ciático y de los GRD para obtener cultivos de CS, FE y CP con 98%±2 de purificación. Las CS crecen sobre diferentes soportes, con y sin mitógenos. Se obtuvo un porcentaje de CS elevado cuando se elimina el epineuro y perineuro de los NC 90%±3 y la cápsula de los GRD 94%±3 antes de la disociación enzimática, comparado a 70%±4,2 sin microdisección u 80%±3,5 sin epineuro. Los FE se adhieren preferencialmente en las primeras 24 h y 20% de suero favorece su crecimiento. En el primer sub-cultivo, son 99% CS o FE, siendo confluentes a los 6 y 8 días respectivamente. Las CP o de la cápsula de GRD no se disocian y no crecen en sub-cultivos, únicamente crecen a partir de explantes de perineuro; no forman monocapa sino una “lámina” de múltiples capas celulares.

En conclusión, la microdisección del GRD y del NC y su disociación son indispensables para obtener en pocos días CS, FE y CP de animales adultos en cultivos altamente purificados.

Palabras Claves: nervio ciático; ganglio de la raíz dorsal; células de Scwhann; células perineurales; fibroblastos endoneruales.

The Schwann cells (SC) are glial of system peripheral nerve. The nervous prostheses are related to the production of autologous SC obtained from the peripheral nervous and from the dorsal root ganglia (DRG). There is a small amount of literature that reports perineural cells (PC) and endoneural fibroblast (EF) cultures as elements to take account of prostheses.

In this work, the micro dissection importance is described in the sciatic nerve (SN) and in the DRG to achieve SC, EF and PC culture with a purity of 98%. The SC grows up on different supports with and without mitogens. An elevated percentage

of SC was obtained when the epineurium and the perineurium were removed in the SN (90%±3) and in the GRD (94%±3) before the enzymatic dissociation compared to seventy percentage when the micro dissection was omitted or eighty percentage without the epineurium micro dissection. The EF was adhered in the first twenty four hours and the twenty percentage of serum improved their growth. In the first passage, there is 99 percentage SC or EF, and they get the confluence in the six and eight day, respectively. The PC or the cells of the DRG don´t have neither a good dissociation, nor a growth in subcultures, they only grow from the perineurium explants that forms a lamina of several cellular layers more than a monolayer.

In conclusion, the DRG and SN micro dissection and dissociated are indispensable to acquire in few days SC, EF and PC cultures with a high purity from adult animals.

Key words: Sciatic nerve, dorsal root ganglia, Schwann cells, perineurial cells, endoneurial fibroblasts.

INTRODUCCIÓN

El sistema nervioso periférico (SNP) está constituido por los nervios periféricos (Fig. 1A) y los GRD (Fig. 1B) que reúnen los cuerpos de las neuronas o pericariones sensitivas; y el sistema nervioso autónomo cuyos ganglios y nervios se encuentran en los órganos que inervan. Los pericariones o cuerpos de neuronas están rodeados por células satélites, que son agrupadas por una cápsula (Fig. 1B) cuyo origen es meníngeo y delimita a cada GRD. Las células satélites en cultivo primario presentan una forma ahusada muy similar a las CS de nervio (Chi et ál., 1993) y en cultivo las llaman CS indistintamente si su origen es de NP o de GRD. Los NP están constituidos por fibras nerviosas que son las neuritas, recubiertas por las células de Schwann (CS) o glía del SNP. Durante el desarrollo del SNP las CS migran de la cresta neural (Mirsky y Jessen, 1999b), y los autores sugieren que las presentes en los GRD y en las raíces espinales se derivarían directamente del tubo neural. La mielina es un esfingolipido producido por la CS, su distribución y cantidad hacen que las fibras nerviosas se clasifiquen en fibras nerviosas mielínicas o amielínicas; en las fibras mielínicas hay un replegamiento continuo de la membrana plasmática de la CS sobre una sola neurita seguido de un engrosamiento de la neurita debido la producción de este esfingolípido, formando lo que se conoce como vaina de mielina. En las fibras nerviosas amielínicas, la CS no forma mielina, como replegamiento, aunque si produce este esfingolípido y recubre varias neuritas a manera de sincitio, envolviendo una vez cada una de las neuritas que agrupa (Mirsky y Jessen, 1999a; Perdomo y Spinel, 2004). Las CS son el soporte y guía del crecimiento de las neuritas (axón o dendrita) (Peters et ál., 1991). Las fibras nerviosas se distribuyen paralelamente unas al lado de las otras a lo largo del gran eje del nervio, como los alambres de un cable de luz que transmiten la señal. Cada fibra nerviosa (neurita(s) + CS) está rodeada por una membrana o lámina basal que entra en relación directa con el tejido conectivo denominado endoneuro o capa perifascicular que les da sostén y apoyo y un lugar por donde va la red de vasos sanguíneos (Fig. 1B). Paquetes de fibras son agrupadas en fascículos nerviosos rodeados por el perineuro o envoltura lamelar de células perinerales (CP) (Peltonen et ál, 1987). Las CP se unen por desmosomas y zónulas ocluyentes (tigh junctions) (Nagaoka et ál., 1999) se encuentran rodeadas por una membrana basal o lámina basal (Bunge et ál., 1982; Jaakkola et ál., 1989) presentando alta resistencia mecánica. Son también, una barrera entre los fascículos y el exterior impidiendo el paso intercelular de moléculas (Levitan et ál., 1983; Bunge et ál., 1989; Muona et ál., 1992; Todd et ál., 2000; Smith et ál., 2001) y la entrada de patógenos (Walbeehm et ál., 2004). Varios fascículos son agrupados por el epineuro o tejido intrafascicular de Ranvier, conformándose el nervio.

Actualmente, resurgió la duda de su origen y está en discusión, se propone que los FE provienen de las crestas neurales como las CS y en cultivo dan origen a miofibroblastos (Joseph et ál., 2004), y que las CP tienen otro origen, pero no pueden confirmar su origen mesodérmico como dijo Bunge (1989). Pero hay relación directa entre la CP y las CS, ya que éstas últimas secretan señales que regulan la diferenciación del perineuro (Parmantier et ál., 1999).

El método generalmente empleado en la regeneración de nervios con pérdida importante de un segmento es el autoinjerto (injerto autólogo). La regeneración nerviosa ha sido estudiada con tubos de diferentes materiales: artificiales y biológicos, en modelos animales con muy pocos casos descritos en humanos. Consiste en suturar los dos muñones (proximal y distal) nerviosos dentro de una guía tubular o prótesis que proporcione un ambiente adecuado para el crecimiento de los axones regenerantes. Dentro de los tubos introducen células, principalmente las CS (Bunge, 1994), factores tróficos o elementos de la matriz extracelular (MEC) solos o entremezclados, permitiendo obtener información útil para el diseño de prótesis (Williams y Varón, 1985; Peters et ál., 1991; Dick, 1993, Fu y Gordon, 1997; Labrador et ál., 1998; Sutachán et ál., 1999).

Se han descrito más de 1500 guías tubulares para la regeneración de nervios donde los mejores resultados se obtienen cuando se emplean CS, comparando el autoinjerto y el empleo de CS autólogas (Kim et ál., 1994; Rodríguez A et ál., 2000; Perdomo y Camargo, 2001), pero los resultados no son homólogos o reproducibles en las mismas condiciones experimentales. Quizá, porque la fuente de CS es a partir de cultivos en monocapa de GRD o de NP que presentan un 10 a 30% de otros tipos celulares diferentes a las CS (Bunge et ál., 1980 y 1982; Guénard et ál., 1994; Xu et ál., 1995; Van den Berg et ál., 1995; Muñetón et ál., 1998; Perdomo y Camargo, 2001; Evans et ál., 2002; Dubový, 2004; Raisman, 2004). Por lo tanto, los FE y las CP no se tienen en cuenta en los estudios de regeneración con cámaras, pero su aporte ha sido estudiado indirectamente por ser contaminantes importantes en los cultivos de CS empleados en las cámaras de regeneración. Los FE podrían tener un papel vital en la regeneración remodelando el tejido conectivo (Jenq et ál., 1987; Sutachán et ál., 1999; Spilker et ál., 2001), teniendo en cuenta que los FE son el 19% de células del endoneuro que remodelan el colágeno y otros elementos de la MEC, y favorecen el crecimiento de las neuritas, formándoles una guía fibrosa al inicio de la regeneración (Scott et ál., 1998, Nagase y Woessner, 1999; Sternlicht y Werb, 2001; Galko y Tessier-Lavigne, 2000; Wong et ál., 2001). Sería pertinente incluirlas en una prótesis conociendo el porcentaje de cada una de las células empleadas, aunque esto hasta la fecha no ha sido considerado. Así, Yannas y Hill (2004) hacen una recopilación de la regeneración en más de 60 prótesis experimentales en animales y en el hombre, en todas se forma un puente fibroso, pero los resultados no son homologables, ni se reproducen los mismos resultados en el mismo grupo experimental, debido a la estandarización de las condiciones de los ensayos, pero concluyen que las CS son esenciales en cualquiera de las prótesis que se analiza.

Tanto, el grado de purificación como la organización de las CS dentro de la prótesis están adquiriendo importancia (Schmalenberg y Uhrich ,2005), al igual que las características básicas de las CS están en pleno desarrollo para entender los mecanismos moleculares de su diferenciación, por ejemplo, inducen células madres o mesenquimatosas a CS in vitro (Croft y Przyborski, 2009). Las CS del NP dan mejores resultados en la reparación del sistema nervioso central (SNC) que las células gliales del propio SNC (Raisman, 2004). Lo que ha llevado a estudiar y caracterizar mejor las CS y su interacción con las neuronas. Las células envolventes o gliales del epitelio olfativo y las CS que en cultivo presentan la misma morfología, pero, son diferentes al estimular la regeneración del SNC (Takami et ál., 2002; Hill et ál., 2006). Para obviar las células contaminantes de los cultivos de CS, ahora se emplea una línea de CS en las prótesis (Lago, et ál., 2009), pero como toda línea celular es inmortal, y se conoce que no tienen las mismas características celulares que los cultivos primarios (Chatterjee, 2007), en el caso específico de CS además, pueden producir Schwannosis por esto (Giovannini et ál.1999). Las CS de cultivos primarios siguen siendo la herramienta más prometedora, ya que secretan factores, desconocidos aun, que estimulan la regeneración de nervios, y aunque no estén 100% purificadas se está empleando CS autólogas para reparar nervios humanos logrando resultados similares a los del autoinjerto (Hood et ál., 2009), los autores consideran que hay mucho por aprender de las CS y dan importancia a que sean altamente purificadas, para estudiar bien los factores bioquímicos y fisiológicos que promueven la regeneración. Todo lo expuesto de las CS y de los FE nos llevó a realizar cultivos primarios de las células del nervio ciático y ganglios de la raíz dorsal lo más purificadas posibles, para ser empleadas en una prótesis de regeneración nerviosa.

Aquí se describe el cultivo en monocapa de CS y de células de la cápsula de los GRD; como también de CS, CP y FE del NC, el grado de purificación, la morfología y el análisis morfológico de estos cultivos.

MATERIALES Y MÉTODOS

Obtención de nervio ciático (NC) y ganglio de la raíz dorsal (GRD)

El manejo de los ratones ICR de 30 g donados por el Bioterio Experimental de la Universidad Nacional de Colombia, se hizo de acuerdo a las exigencias del National Reserch Council, 1996 y de la legislación colombiana. Se anestesian con ketamina 0,25 mg/g (Parke-Davis) y por ratón se extraen los 2 NC y los GRD, se colocan en medio Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM, Sigma) con penicilina 50 µg/mL, estreptomicina 50 U/mL (Gibco) y amfotericina 0,25 µg/mL (Sigma). En los cultivos de CS y de CP se adiciona 10% de suero fetal bovino (SFB) (Gibco); lo que llamamos medio completo (MC), para el cultivo de los FE se utiliza MC con 20% de SFB (MC20%). El cultivo primario se realiza en cajas de plástico (Falcon) de 35 mm de diámetro a 37ºC con una atmósfera de CO2 5% - aire 95% saturada en humedad.

En la Tabla 1 se resumen los tratamientos realizados a los GRD y a los NC, estos fueron divididos en grupos experimentales de la siguiente manera: células provenientes de NC grupos 1 al 9 y células provenientes de GRD grupos 10 al 16, a los cuales se les aplicó 2 tratamientos diferentes, cultivo de explantes (o fragmentos del tejido) y cultivo celular (haciendo disociaciones enzimáticas y mecánicas del tejido). Los grupos a lo que hacemos referencia en materiales y métodos son los de esta tabla.

Cultivo de explantes

Los NC completo se cortan en fragmentos de aprox. 2mm y se cultivan (Grupo 1). Los GRD se retiran de los espacios intervertebrales, las raíces nerviosas se cortan y se cultivan enteros (Grupo 10). El cultivo de explantes se inicia con 0,5 mL de MC entre ½ y 3h inicialmente. Se asegura la adhesión del tejido al soporte, y luego se añade MC hasta un volumen de 2mL.

Bajo el microscopio estereoscópico se realiza la microdisección, se separan los compartimentos del NC y se cultivan separadamente: NC sin epineuro (Grupo 2), endoneuro (sin epineuro ni perineuro) (Grupo 3).

La cápsula se retiró de los GRD, se cultivó explantes de GRD sin cápsula (Grupo 11). Para todos los cultivos el medio se cambia el 2o d y luego cada 3er d.

Cultivo de explantes de perineuro y de cápsula de GRD

Los explantes de perineuro (Grupo 8) se cultivaron en las mismas condiciones del ítem anterior, y otros fragmentos se sometieron a 4ºC por 24h y luego se cultivaron (Grupo 9). Fragmentos de la cápsula de los GRD se cultivaron (Grupo 16) igual que el Grupo 8.

Disociación y cultivo de NC y de GRD.

Se realizó la disociación como fue descrita pera nervios humanos, pero no se dejó tiempo (14 d) de degeneración in vitro (Calderón-Martínez et ál., 2002). La disociación enzimática de los fragmentos descritos en cultivo de explantes, se realizó con colagenasa tipo II 250 U/mL (Sigma) y dispasa 0,1 mu/mL (Sigma) en DMEM a 37ºC por 15 min en agitación continua (160 oscilaciones por min); en esta misma solución se realizó la disociación mecánica con pipeta Pasteur de vidrio. Las células disociadas se lavan por triplicado a 200g por 5 min con MC. Sólo para las células disociadas de GRD se filtran a través de mallas de nilón con poros de 100 Μm de diámetro, para eliminar los cuerpos de las neuronas. En el momento de la siembra se determinó la viabilidad celular por el método de exclusión con azul Trypan 5%. Las células de los GRD filtradas (Grupos 12, 13 y 14) o de los NC (Grupos 4, 5 y 6), se cultivan en 2 cajas de Petri de 35 mm de diámetro con y sin colágeno 0,1 mg/mL (obtenido a partir de tendones de cola de rata según Elsdale y Bard 1972), en MC y las mismas condiciones ambientales que los explantes. Los grupos 6 y 14 se cultivaron con forskolina 2 µM (Biovision) y toxina colérica 0,1 µg/mL (Sigma). El MC se cambia el 2o d y luego cada 3er d.

Un vez establecidos los cultivos, se hicieron también cultivos en cajas de 24 pozos con laminillas, recubiertas o no de colágeno 0,1 mg/mL para la realizar las pruebas de inmunocitoquímica.

Obtención y cultivo de fibroblastos endoneurales y dérmicos

Se realizó cultivo de explantes de endoneuro con MC20% para verificar el crecimiento de fibroblastos endonuerales (FE) según lo descrito por Leal et ál., (2004). También se disoció el endoneuro y GRD sin cápsula con 400 U/mL de colagenasa tipo II y una disociación mecánica más prolongada, se cultivaron en MC20% en las mismas condiciones ambientales anteriores. Se realizó el cultivo de fibroblastos dérmicos (FD) a partir de dermis del ratón y en las mismas condiciones de disociación y de cultivo que los FE. El medio de cultivo se cambia el 1er d y luego cada 2 d con MC20% hasta obtener confluencia, en general a partir del día 8 (Leal et ál., 2004).

Mantenimiento de los cultivos

Cuando los cultivos primarios de CS y FE llegan a confluencia, se lavan dos veces con DMEM, y se incuban 30 min a 37°C en 4 mL de DMEM con tripsina 2,5 mg/mL (Sigma). Inicialmente se lavaron una vez con MC a 200g x 5 min, pero luego se observó una mejor viabilidad celular si se lavan 3 veces, lo cual se realizó para todos los sub-cultivos de cultivos. Antes de sembrar, se determina la viabilidad celular por el método de exclusión con azul Trypan 5% y se cuenta el número de células. Luego se inicia el cultivo secundario de las células de los cultivos primarios. También se realizaron cultivos primarios, y los secundarios de 6000 células/pozo, en cajas de 24 pozos con laminillas recubiertas con y sin colágeno.

Inmunocitoquímica

En la inmunocitoquímica se utilizaron los siguientes anticuerpos primarios (Ac 1): Anti-S100Β (Dako Cytomation) para las CS, que marca una superfamilia de proteínas con unión acídica al calcio, en el SNP es expresada por las CS distribuyéndose en su citoplasma y asociándose a proteínas de membrana (Spreca et ál., 1989; Rambotti et ál., 1990; Garavito et ál., 2001). Ac anti-Thy1.1 (Santacruz biotechnology, Inc) para los fibroblastos, contra glicoproteínas de membrana con un tercio glicosilado y el resto constituido por un polipéptido que varía en longitud dependiendo de la especie a la que pertenece (Joseph et ál., 2004; Pei et ál., 2004). Ac anti-ZO1 (Santacruz biotechnology, Inc) reconoce proteínas de la unión cerrada o zónula ocluyente (tight junction or zonula occludens) y se empleó para determinar las células perineurales, cuya característica es la presencia de estas uniones entre ellas (Pummi et ál., 2004).

Los controles positivos fueron cortes de GRD y de NC de ratón para todos los marcadores. Los controles negativos, los mismos cultivos sin Ac 1. El control negativo de estos marcadores en cultivo, se hizo en monocapas de macrófagos murinos línea J774.

Para obtener GRD y NC, el ratón se perfundió por 3 min con paraformaldehído 4% en tampón fosfato salino (PBS) 0,1 M, pH 7.4 vía intracardíaca a 260 mm Hg.

El procesamiento para los tejido se hizo de acuerdo a lo descrito para la inclusión en parafina (Luna, 1960) Se hicieron cortes (5 µm de grosor) colocados sobre portaobjetos cubiertos con poli-L-lisina y luego se desparafinaron.

Los cultivos y los tejidos se permeabilizaron con Tritón X100 (0,1% en PBS) 30 min a 20°C, se bloquearon los sitios inespecíficos con SFB 3% en Tris HCl pH 8,6, se incuba con el Ac 1 1h a 37°C (1:500 para S100Β; 1:100 para Thy1.1 y ZO1) y el Ac secundario 1:200 IgG anti-conejo (Vectastain) 30 min a 37°C. Se continúa 45 min con ABC-peroxidasa (A-B, Vectastain), y se colorearon con Hemalun de Meyer (Bernal et ál., 2007) y además para los fibroblastos con Alexa Flour.

Observación y análisis estadístico

El análisis y seguimiento de los cultivos se hizo en microscopio invertido y para las técnicas de inmunocitoquímica con el microscopio convencional. El número total de células que crecen y el número de CS, FE o FD se determinó en 20 campos al azar en cada uno de los grupos, con base a la morfología de las células en el día 8 para el cultivo primario y secundario. La pureza de los cultivos ya sea de CS, o de FE o de CP fue evaluada como el porcentaje promedio de células con respecto al número total de células contadas % ± desviación estándar, N=4 experimentos (se indica cuando el N es diferente de 4) (Levi, 1996). Para el análisis de viabilidad celular y de la purificación de los cultivos obtenidos se realizó el test de t de Student.

RESULTADOS

La Tabla 2 resume resultados más relevantes en los cultivos primarios a partir de los diferentes grupos experimentales de la Tabla 1 a partir de nervio ciático y ganglios de la raíz dorsal de ratón. Los grupos a lo que hacemos referencia en resultados y discusión son los de la Tabla 2.

Cultivo de explantes

En el cultivo primario se observan mezcla de 3 tipos celulares principales: CS, FE y CP. En el sub-cultivo no se observó CP, pero si una mezcla de CS y FE, predominando las CS.

Cultivo de explantes de perineuro y de cápsula de GRD

No se disocian las células de los explantes de perineuro o de la cápsula del GRD con las diferentes concentraciones enzimáticas empleadas y descritas en materiales y métodos siendo representativo de estos ensayos los Grupos 7 y 15. Los fragmentos después de esta disociación son viables en su gran mayoría, y excepcionalmente se adhieren y crecen pocas células que mueren en los primeros días. Tampoco crecen células cuando se cultivan los GRD completos (Grupo 10) o sin cápsula (Grupo 11). Aunque no hay proliferación se conserva la viabilidad celular, ya que al contrastar con un flourocromo vital (flourogold) los GRD con o sin cápsula conservan la fluorescencia durante 6 d de cultivo; además, estos fragmentos cultivados al realizar el examen de exclusión con azul Trypan sólo las células periféricas son azules y las del interior son translúcidas, lo que demuestra que las células en el interior del GRD son viables.

El cultivo de células del perineuro y de la cápsula de GRD se logró únicamente con los explantes de estos tejidos (Grupos 8, 9 y 16). Presentan una gran dificultad para adherirse a la superficie de la caja de cultivo plástica, de vidrio o recubierta de colágeno. Pero no crecen sobre colágeno.

Los fragmentos cuando se cultivan desde el inicio con 2 mL de medio flotan y no se adhieren al soporte por las vibraciones del ventilador de la incubadora, fue necesario cultivar al inicio (al menos 4 h) con poco medio para evitar su movimiento y así se adhirieron al soporte, logrando una buena interferencia entre aire y medio de cultivo. Fue Interesante, que el inicio de la migración y crecimiento de las células a partir explantes de cápsula de GRD y de perineuro de NC se observa a partir del día 14 en los dos casos, se hicieron 10 experimentos para poder confirmar que el inicio de la migración de las CP y capsulares sobre el soporte de la caja de cultivo es este día. Las CP son de gran tamaño, con núcleos 2 a 3 veces el de un FE, con forma poligonal (Figs. 2B y 2C), crecen unas al lado de las otras en vidrio o plástico. El cultivo primario de CP difiere de los cultivos primarios clásicos en monocapa, porque crecen sobreponiéndose unas a otras dando lugar a una estructura estratificada de células (Fig. 2B y C), después del inicio de la migración (14d de cultivo primario) llegan rápidamente a confluencia en cinco días, donde no proliferan más y no cubren completamente la superficie del soporte de cultivo. Para realizar el sub-cultivo se realizó la tripsinización y todo el cultivo se desprende como una sola “lámina o cubierta”, resistente a la tracción mecánica y física como el perineuro recién disecado y no proliferan en cultivos secundarios o sub-cultivos. Esta “lámina” se pudo manipular como un tejido fresco que se fijó, deshidrató e impregnó en parafina y se pudo realizar cortes de 5 Μm de espesor (Fig. 2D). Tanto las CP (Fig. 2D) o capsulares (Fig. 2B) en cultivo o en los cortes de parafina de la “lamina” de CP muestran que son ZO1 positivas; manifestando que los dos tipos de células son homologables. Estas células no se marcan con Ac anti-queratina (Fig. 2C) y Ac anti-vimentina, cuya imagen es similar al control negativo de la inmunocitoquímica. La inmunocitoquímica confirma los resultados morfológicos y el porcentaje de purificación observados con el microscopio invertido.

La purificación de CP se vio favorecida con 24h a 4°C (Levi et ál., 1994a) antes de iniciar el cultivo de explantes, obteniendo 99%±0,5 de CP (Grupo 9) comparado con 97±0,5 (Grupo 8) cultivado inmediatamente después de la disección, pero esta diferencia no es significativa (p≤0,6).

Cultivo de endoneuro y GRD sin cápsula disociados enzimáticamente para obtener células de Schwann

La morfología que presentan los cultivos de NC sin epineuro y disociado (Grupo 4) permite identificar los tres tipos celulares que crecen: CS, FE y CP (Fig. 3A) y del GRD completo y disociado (Grupo 12) (Fig. 3B). Las CS fueron identificadas en base a su morfología en microscopio invertido inicialmente, y fueron seleccionadas como aquellas que presentaban una forma bipolar, con procesos largos, núcleo ovoide y refringentes en el centro celular (Fig. 3 flechas blancas); mientras que los fibroblastos fueron identificados como células más aplanadas, irregulares con varias prolongaciones y con un gran núcleo redondo y sin refringencia en el centro (Fig. 3 flechas rojas).

La obtención de CS altamente purificadas se logró con el endoneuro del NC y los GRD descapsulados que fueron disociados enzimática y mecánicamente sin exceder 15 min.

Muchos autores sugieren la necesidad de soportes de elementos de la matriz extracelular para obtener CS en cultivo. En cuanto a los substratos aquí utilizados, si bien el colágeno permitió una mejor adhesión inicial; las cajas de plástico o vidrio sin ninguna cubierta fueron igual de efectivas en el establecimiento de los cultivos purificados de CS (Fig. 4A), contrario a lo que se esperaba. Los cultivos realizados sobre plástico o vidrio alcanzaron rápidamente la misma confluencia a los realizados sobre colágeno (Fig. 4B). La única diferencia observada entre los sustratos, es que las CS sobre plástico o vidrio presentan una morfología más expandida sobre el soporte. Se obtuvo un número aproximado de 1.4 x 106 células con una pureza del 94%±3 en tan sólo 10 a 11 días de cultivo a partir de GRD de un ratón (Fig. 5A y 5B) o 90%±3 de los dos NC de ratón (Grupos 5 y 13. Fig. 5C).

Las CS de NC (Fig. 5B) y CS de GRD (Fig. 5C) marcan con el Ac anti-S100Β, aunque no todas las CS del NC marcan con este anticuerpo; además, el cultivo primario de CS de GRD presenta un porcentaje de purificación mayor (Grupo 5) que las CS de NC (Grupo 13); igual que con mitógenos, grupos 6 y 14 respectivamente. Las inmunocitoquímicas corroboran el grado de purificación de CS observado con microscopio invertido. Esta purificación es importante en el momento de emplear CS autólogas en las prótesis de regeneración (Hood et ál., 2009).

Obtención y cultivo de Fibroblastos Endoneurales y dérmicos

Para acelerar la proliferación y el número de fibroblastos en los cultivos primarios de explantes del endoneuro como en los cultivos secundarios o sub-cultivos, se añadió 20% de SBF, lográndose una confluencia a los 12 días en el cultivo primario y un número menor de CS contaminantes. La utilización de este suplemento de SBF redujo en 8 días el tiempo de cultivo primario de los FE en relación a los mantenidos con SBF al 10% y se evita la contaminación por CS (Flechas, Fig. 6A) con explantes.

Se modificó la técnica de obtención de explantes de endoneuro (Fig. 6A) y su cultivo, para lograr en corto tiempo un mayor número de FE en el cultivo primario y evitar una población sin CS en los sub-cultivos. La primera modificación, fue eliminar perineuro y epineuro. La segunda, realizar una disociación enzimática y mecánica muy controlada. Así, la adhesión de los FE al soporte en el cultivo primario se observó desde el primer día de cultivo. Lo más importante fue lograr una rápida purificación de la población de FE y la eliminación de las CS en los cultivos secundarios, cada sub-cultivo dura aproximadamente 4 días. A partir de este momento, los cultivos secundarios fueron empleados para propagar los FE y obtener un mayor número. Este mismo procedimiento se realizó con los GRD sin cápsula obteniendo los resultados similares (Fig. 6B).

La identificación con el Ac anti-Thy1.1 de los cultivos primarios de FE fue tenue (Fig. 6C), como ocurrió en el NC completo. Para corroborar su identificación se

hizo el mismo marcaje en fibroblastos dérmicos (FD) (Fig. 6D), se evidenció mejor empleando el segundo Ac flourescente y una observación en microsocopio confocal de los FE (Fig. 6E) y de los FD (Fig. 6F). Los controles negativos no presentaron ningún marcaje cuando se realizó sólo con el Ac primario, como tampoco con Ac anti-Thy1.1 en cultivo de macrófagos murinos.

Aunque se logró identificar los diferentes tipos celulares, encontramos células con aspecto entre FE y CP y en otras ocasiones FE se marcaban con el Ac anti-S100Β, y células similares a CP sin ser tan extensas en su superficie con marcaje alrededor del núcleo con Ac anti-S100Β; hubo CP y pocas CS marcadas con el Ac anti-Thy1.1, lo que determinamos como células no identificadas (Tabla 2).

Cultivo de explantes

El cultivo de CS se hizo inicialmente por explantes de nervios periféricos (Morrissey et ál., 1991), donde se dejan entre 7 a 14 días en la caja de cultivo (llamado también tiempo degeneración in vitro). Las células migran después de los 7 d y forman una monocapa de células donde predominan las CS (Morrissey et ál., 1991). Es en los cultivos secundarios que logran un alto grado de purificación pero no más del 80%. Nosotros no obtuvimos una alta purificación de CS por este método de cultivo (Grupos 1, 2 y 3). En las mismas condiciones descritas aquí, pero en NC de rata adulta hay, dos picos de proliferación de las CS a los 7d y 15d, tiempo en el cual se logra obtener de los explantes mayor número de CS 60 a 70% (Garavito et ál., 2001), de forma similar a nuestros resultados.

El no obtener cultivo celular a partir de explantes de GRD con y sin cápsula (Grupos 10 y 11) podría deberse a que la migración sea impedida por el tejido conectivo o adiposo que rodea al GRD pues quedan vestigios de estas células, o simplemente al hecho de quedar conservados en su estructura tisular no requieren dividirse para sobrevivir en monocapa de manera homóloga a folículos de tiroides (Spinel et ál., 1990; Herrera et ál., 2008) o a acini de glándulas salivales (Victoria et ál., 2007) donde las células son viables a largo plazo del cultivo (12 d folículos y 9 d acini) aún impidiendo la adhesión celular con agarosa, el número de células y su viabilidad se mantiene constante a lo largo del cultivo y no hay proliferación, como en los GRD que al ser contrastados con un florocromo vital conservan la fluorescencia los 6 d que se dejan en cultivo; además se demuestra que las células dentro de los GRD son viables. Con el cultivo de explantes se pueden obtener CS pobremente purificadas.

Cultivo de explantes de perineuro y de cápsula de GRD

El tejido perineural es un tejido “conectivo” compacto de alta resistencia y además elástico (Levitan et ál., 1983) gracias a las uniones cerradas o zónulas ocluyentes (tight junctions) (Kanda et ál., 2004; Pummi et ál., 2004), a las uniones comunicantes (gap junctions) (Nagaoka et ál., 1999) y a los desmosomas entre las células. La superposición de láminas celulares concéntricas que forman los fascículos del nervio, es regulado por uniones con las láminas básales y por proyecciones celulares desde una lamela a otra (Smith et ál., 2001; Walker et ál., 2004), lo que explicaría la dificultad en disociar las CP y que no crezcan in vitro a partir de los fragmentos que se forman después de la disociación, o quizá los requerimientos de cultivo cuando están “disociadas” no son adecuados en las condiciones sencillas de este trabajo. Estos fragmentos disociados con enzimas, tal vez pierden muchos de sus elementos de la membrana basal indispensables para unirlas y aglutinar las CP (Jaakkola et ál., 1989),

El cultivo primario de CP sólo se obtuvo con explantes del perineuro y con la cápsula de GRD, las células migran y crecen a partir de explantes enteros a los 14 d como lo describió Peltonen en 1987. Ellos describe que las CP in vitro crecen lentamente y para la migración celular es necesario replantar el mismo explante casi 10 veces, demostrándose la dificultad de cultivar este tipo celular y tal vez por esto hay muy poca literatura sobre el tema. Los estudios posteriores a Peltonen se basaron en cultivo de fibroblastos que se diferenciaban en CP o en estudios in vivo sobre las capas perineurales (Joseph et ál., 2004). El origen de la CP de GRD se dice que son del tejido conectivo de las meninges (Mirsky y Jessen, 1999a) o como no hay reportes detallados en la literatura de cultivos sobre este tejido, falta simplemente información. Mientras que el origen de las CP de nervio está en discusión, si son endoteliales, epiteliales, de CS o de FE o independiente de CS y de FE (Shanthaveerappa y Bourne, 1966; Peltonen et ál., 1987; Jaakkola et ál., 1989; Popovic et ál., 1994; Rosenbaum et ál., 1995; Popovic et ál., 2000).

La naturaleza de los filamentos intermedios se conservan desde muy temprano durante el desarrolle embrionario (Rodríguez FJ et ál., 2000) y aún en células metastásicas se conservan el origen de los filamentos intermedios y se emplean como marcadores en patología para determinar origen de las células metastásicas (Mindan et ál., 1996); ya que las CP no expresan los filamentos intermedios de queratina y vimentina, no tendrían origen epitelial ni mesenquimal.

Cualesquiera que sea su origen, demostramos que es posible cultivar CP de origen de NC y de GRD con alto porcentaje de purificación 98 a 99%. El éxito del cultivo primario de CP es la microdisección y un cultivo inicial de explantes de perineuro y de la cápsula de GRD de unas horas con poco medio de cultivo (0,5 mL).

Cultivo de endoneuro y GRD sin cápsula disociados enzimáticamente para obtener células de Schwann

La obtención de CS se realizó con el endoneuro del NC y los GRD descapsulados gracias a la disociación en base al cultivo de CS de nervio humano (Calderón-Martínez et ál., 2002), modificando y eliminando el tiempo de degeneración inicial (14d); además, al eliminar la capsula de los GRD y el epineuro y perineuro del NC el tiempo de disociación enzimática se redujo a 15 min, acortar el tiempo de extracción del tejido y el inicio del cultivo es importante para tener éxito en el cultivo (Ansselin et ál., 1998), ya que la viabilidad disminuye cuando las células son sometidas a tiempos altos de exposición a la enzima, como se ve en los trabajos de Muñetón et ál., (1998), quienes obtuvieron en los mejores casos una viabilidad de 88% al utilizar un tiempo de digestión enzimática de una hora y media. Aquí se describe el cultivo primario con resultados similares para CS de NC o de GRD, logrando un 95 a 98% de purificación.

Han sido numerosos los sustratos empleados para promover la proliferación y la purificación de las CS (Vleggeert-Lankamp et ál., 2004), los más usados son el colágeno tipo I (Askanas, 1980; Chi et ál., 1993; Muñetón et ál., 1998; Calderón-Martínez et ál., 2002) y la poli-L-lisina (Levi, 1996, Rodríguez A et ál., 2000) entre otros, pero todos los autores afirman que el uso de una cubierta o elementos de adhesión como soporte es indispensable para la obtención de estos cultivos. La única diferencia que observamos es que las CS sobre plástico o vidrio presentan una morfología más extendida sobre la superficie, probablemente porque no brindan sitios de unión tan fuertes para las células como el colágeno que aún las cancerosas adquieren una morfología de in vivo con colágeno como sustrato (Yang et ál., 1980), y se conoce que las células establecer un número mayor de uniones célula-sustrato y célula-célula, lo que hace que disminuya la refringencia del centro celular sobre vidrio o plástico.

Demostramos que las CS de nervio de ratón no son tan dependientes de factores mitogénicos específicos ni de colágeno para su proliferación como las células de rata adulta (Garavito et ál., 2000a y 2001) o de nervio humano (Calderón-Martínez et ál., 2002), ya que crecen sin forskolina y toxina colérica, sobre vidrio o plástico, aunque si con mayor rapidez que sin estos mitógenos (Bernal et ál., 2007). En cultivo primario sin mitógénicos se obtuvo 90%±3 de CS a partir de NC y 94%±3 a partir de GRD en comparación con 70% descrito a partir de nervio de rata (Garavito et ál., 2001) o de nervio humano (Calderón-Martínez et ál., 2002). Con mitogénicos se logró un mayor porcentaje 95%±3,5 de CS a partir de NC pero similar al descrito en la literatura, 85% en rata (Garavito et ál., 2000b y 2001) y 95% en nervio humano (Calderón-Martínez et ál., 2002), pero el efecto de los mitógenos fue notorio en la CS de GRD siendo el mayor porcentaje de purificación: 98%±2.

Generalmente, las células luego de una disociación enzimática son lavadas una o dos veces, pero se sabe que si no se añade inhibidor de tripsina se tiene que lavar tres veces con medio que contenga suero o albúmina fetal para eliminar el efecto de la tripsina que queda en las proteínas de la membrana plasmática de las células (De Meyzô et ál., 1986). Por eso realizamos tres lavados con mejores resultados en los sub-cultivo de CS, como también para eliminar las trazas de clostripaina (homóloga a la tripsina) que contiene la colagenasa tipo II que se empleó en la disociación para el cultivo primario.

Las CS de NC (Fig. 5B) y CS de GRD (Fig. 5C) marcan con el Ac anti-S100Β, pero no todas las CS del NC marcan con este anticuerpo, como fue descrito por Garavito et ál., (2000b) en rata. Se corrobora con las inmunocitoquímicas que el cultivo primario de CS de GRD presenta un porcentaje de purificación mayor (Grupo 5) que las CS de NC (Grupo 13); igual que con mitógenos, grupos 6 y 14 respectivamente. Es posible que la presencia de algunas neuronas sensoriales en el cultivo incremente la proliferación de las CS (Wood y Bunge, 1975; Zhang et ál., 1994), pues queda una que otra neurona. Los agentes que elevan el AMPc favorecen esta purificación, pero no son necesarios y sí inconvenientes para emplear las CS en prótesis de nervios.

En conclusión logramos una alta purificación de CS en cultivos primarios a partir de NC o GRD favorecidos por la microdisección antes de la disociación enzimática, en tiempos muchos más cortos que los descritos en la literatura.

Obtención y cultivo de Fibroblastos Endoneurales y dérmicos

El crecimiento de los FE se vio favorecido por la digestión más severa (mayor concentración de colagenasa y el doble de tiempo en la disociación mecánica) que la empleada para el endoneuro de NC y GRD sin cápsula.

Se conoce que la proliferación de las células en los cultivos depende de la concentración de SBF que se le añade al medio (Denef et ál., 1980), y que los fibroblastos responden más eficazmente a los factores presentes en el suero que las CS (Leal et ál., 2004; Nadri y Soleimani, 2007).

Aunque son muchísimas las técnicas descritas para cultivo de fibroblastos, principalmente dérmicos; Knoops et ál., (1990) trabajaron con fibroblastos de nervio sin describir el origen específico del tejido conectivo del nervio que utilizaron, y además, es una metodología muy costosa. Al eliminar perineuro y epineuro, y emplear el endoneuro y al eliminar la cápsula de los GRD, podemos asegurar en un alto porcentaje el origen de los FE en nuestros cultivos.

La disociación enzimática que empleamos se basó en la disociación descrita para células endocrinas con colagenasa tipo II seguida de la disociación mecánica controlada (Spinel et ál., 1990) que fue inicialmente empleada para CS humanas (Calderón-Martínez et ál., 2002) y se lavó con MC20% para eliminar mejor el efecto de las trazas de clostripaina de la colagenasa tipo II. Además, se hizo muy controlada para evitar la pérdida de proteínas de membrana implicadas en la adhesión celular (Karlsson et ál., 1982; Albert et ál., 2002).

El crecimiento de los FE con el método de explantes se demora entre 20 días a un mes para formar la monocapa y con 20% de SBF a partir de 8 d (Leal et ál., 2004); con la introducción de la disección nervio y disociación del endoneuro se obtuvo la confluencia a los 5 días de cultivo, empleando también 20% de SFB.

Como Thy 1.1 se expresa en células con fenotipo miofibroblástico de nervio, es utilizado como un marcador selectivo para los fibroblastos de nervio, entre los cuales se puede incluir los FE, que presentan un fenotipo contráctil al estar en cultivos en monocapa (Campbell et ál., 1981; Chang et ál., 1985; Joseph et ál., 2004). Además, esto quizá se debe también a que aún no se conoce el origen de los FE, por lo que estas dos líneas celulares comparten el mismo origen ectodérmico a partir de células madre no neuronales de la cresta neural (Siironen et ál., 1992; Joseph et ál., 2004), y puede significar que las proteínas de unión a calcio (S100Β) tienen una distribución más ubicua de lo que se piensa, expresándose en las células provenientes de nervio tanto con morfología de Schwann como en aquellas con morfología fibroblástica, pero incluso se expresó levemente en tirocitos en cultivo, lo que confirma su ubicuidad.

En conclusión, se ha logrado obtener cultivos primarios de células de Schwann, células perineurales y fibroblastos endonuerales altamente purificados. Esto se logró principalmente por dos hechos: 1. se pudo acortar máximo a 30 min el tiempo entre la obtención del tejido y el inicio del cultivo. 2. La microdisección de los diferentes tejidos del nervio y del ganglio de la raíz dorsal, son esenciales para asegurarse el origen celular y lograr un mejor control de la disociación de los tejidos.

Las células de Schwann altamente purificadas de NC o de GRD crecen en cultivos primarios sobre plástico, vidrio o colágeno y sin necesidad de agentes mitogénicos.

Las células de la cápsula de GRD en cultivo primario tienen las mismas características de las células perineurales y pueden ser consideradas como tales.

Las células perineurales sólo crecen en cultivos primarios a partir de explantes y forman una “lámina” de células estratificadas. Son vimentina y queratina negativas.

Nuestros resultados en los cultivos primarios altamente purificados de CS, FE o CP son un paso muy importante y esencial para la aplicación a corto plazo en prótesis nerviosas, pues en el caso de no tener disponibilidad de estas prótesis, pueden ser construidas en corto tiempo para su utilización a partir de cultivos primarios.

Queremos agradecer a Marcela Camacho por su asesoría crítica del proyecto de investigación y la donación de macrófagos de la línea J774. Al laboratorio de Biofísica, por su apoyo para poder realizar este trabajo. A la Fundación para la Promoción de la Investigación y tecnología del Banco de la República de Colombia (Proyecto 2199) y la División de Investigación de la sede Bogotá, Universidad Nacional de Colombia por la financiación de este trabajo.

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