LA COMPETENCIA DEL OVOCITO: QUÉ, CÓMO Y CUÁNDO

The Oocite Competence: What, How and When

ARIEL TARAZONA¹, MSc; ANGELA LÓPEZ²; MARTHA OLIVERA-ANGEL², Dr.Sci.Agr ¹BIOGENESIS, Facultad de Ciencias Agropecuarias, Universidad Nacional de Colombia; Bogotá, Colombia. arielmarcel@gmail.com. ²BIOGENESIS, Facultad de Ciencias Agrarias, Universidad de Antioquia; AA 1226, Medellín, Colombia. Calle 67# 53-108, Medellín.

Presentado 29 de enero de 2010, aceptado 29 de abril de 2010, correcciones 15 de julio de 2010.

RESUMEN

La producción de embriones in vitro ha sido una herramienta útil para el desarrollo de técnicas como la clonación y la transgénesis, que han revolucionado los campos de la ciencia y la tecnología. La técnica básica para la maduración, fertilización y cultivo in vitro de los embriones produce, desde sus inicios, bajas tasas de desarrollo hasta el estadío de blastocisto con índices reducidos de viabilidad de los mismos. Los avances en el conocimiento de la dinámica celular durante estos procesos condujo a la hipótesis, de que la maduración, entendida como el reinicio del ciclo meiótico, la reorganización del ooplasma y la regulación de la expresión génica, juegan un papel fundamental para sustentar el desarrollo temprano de los embriones, esta capacidad de lograr el desarrollo se ha denominado competencia. La adquisición de la competencia nuclear y citoplásmica ocurre durante dos fases claras del desarrollo del ovocito: la primera, de crecimiento, donde ocurren arreglos moleculares y reorganización de organelas en el ooplasma, y la segunda fase, donde ocurre el reinicio de la meiosis para lograr finalmente el número haploide de cromosomas que se complementarán con los paternos para el desarrollo del nuevo individuo.

Esta revisión tiene por objeto describir los procesos celulares y moleculares que conllevan a la adquisición de la competecia del ovocito, se incluyen: la maduración citoplasmática, el reinicio de la meiosis y las interacciones entre el ovocito, las células del cúmulus y el fluido folicular. El tema es presentado en tres partes: 1. el desarrollo del complejo folicular,2. El crecimiento del ovocito y la remodelación intracelular y 3. La maduración nuclear. Se concluye presentando un modelo de comunicación y regulación intercelular, para explicar como este intrincado complejo que involucra diferentes rutas de señalización conducen a la adquisición de la competencia.

Palabras clave: complejo folicular, maduración, meiosis, ooplasma.

ABSTRACT

The aim of this review is to describe the cellular and molecular processes that lead to the acquisition of competence of the oocyte, including: cytoplasmic maturation, resumption of meiosis and the interactions between the oocyte, cumulus cells and follicular fluid. The subject is presented in three parts: 1. follicular development of the complex, 2. Oocyte growth and intracellular remodeling and 3. Nuclear maturation. It concludes with a model of intercellular communication and regulation, to explain this intricate complex as it involves different signaling pathways.

Key Words: follicular complex, maturation, meiosis, ooplasm.

INTRODUCCIÓN

La producción de embriones in vitro ha sido una herramienta útil para el desarrollo de técnicas como la clonación y la transgénesis que han revolucionado los campos de la ciencia y la tecnología (Wells, 2003; Brem y Nowshari, 2004; Kues y Niemann, 2004) ha mejorado los sistemas de producción animal (Hansel, 2003; Greve y Callesen, 2004), la conservación de especies amenazadas (Kane, 2003), y ha sido fundamental para el aumento de la calidad de vida y la salud en humanos: xenotransplantes (Takefman et al., 2002), biomedicina (Prather et al., 2003) y reproducción asistida (Edwards, 2003; Loutradis et al., 2004). Sin embargo, la técnica básica para la maduración, fertilización y cultivo in vitro de los embriones mantiene su baja tasas de desarrollo hasta el estadío de blastocisto (Ben-Yosef y Shalgi, 1998) con bajos índices de viabilidad de éstos (Thompson et al., 1990; Thompson et al., 1996; Thompson, 1997). Los pocos embriones producidos presentan bajas tasas de implantación y preñez comparados con los embriones obtenidos in vivo (Holm y Callesen, 1998; Combelles et al., 2002) y cuyo se logra la preñez, en muchos casos se presentan problemas durante el desarrollo fetal (Duranthon y Renard, 2001; Merton et al., 2003) que conducen al aborto o a la muerte embrional tardía.

Las explicaciones a estos índices van desde el efecto de las especies reactivas de oxígeno (Goto et al., 1993; Kwon et al., 1999), pasando por el metabolismo alterado en los embriones (Thompson et al., 1996; Thompson, 2000), la expresión genética alterada (Christians et al., 1999; Plachot, 2003; Mohan et al., 2004), la heterogeneidad de los ovocitos recuperados de ovarios de mataderos o por punción ex vivo (Merton et al., 2003), hasta la más reciente: que estos problemas son consecuencia de fallas durante el proceso de maduración del ovocito, por lo cual no adquiere la competencia para lograr que una vez fertilizado se convierta en un embrión viable (Trounson et al., 2001; Dean, 2002; Jones, 2004).

MADURACIÓN

Los procesos involucrados en la maduración del ovocito ocurren desde la etapa fetal de la hembra hasta el final de su vida reproductiva. Las oogonias o células germinales primordiales sufren divisiones mitóticas prenatalmente para asegurar que la hembra nazca con suficientes células germinales que posteriormente formarán folículos. Sin embargo, solo una parte de las oogonias reinician meiosis formando ovocitos primarios, que son con los que nacerá la hembra (Senger, 1999).

La maduración es una serie de procesos que confluyen en la adquisición de la competencia del ovocito. Los ovocitos detienen su ciclo meiótico en el estadío de profase I, detenimiento que puede durar desde pocos meses (peces) hasta años (humanos), este tiempo es necesario para el crecimiento y reorganización citoplásmica del ovocito antes de la fertilización (Sagata, 1998). El reinicio de la meiosis es la etapa final de la maduración del ovocito, ocurre posterior al crecimiento y maduración citoplasmática y es desencadenado por diferentes estímulos que varían entre las especies.

La maduración ocurre dentro del complejo folicular, el cual se compone de: ovocito, células del cumulus, granulosa, teca y fluido (Nilsson y Skinner, 2001; Kalinowski et al., 2004), las interrelaciones entre estos componentes, han puesto en evidencia que la maduración del ovocito es un proceso complejo he involucra tanto el reinicio del ciclo meiótico, como el reordenamiento de las organelas y componentes citoplasmáticos (Fulka et al., 1998; Fair, 2003). Estos eventos han sido relacionados con la competencia del ovocito, concepto ampliamente usado para distinguir los ovocitos que son capaces de producir un embrión viable y transferible después de la fertilización (Duranthon y Renard, 2001).

1. Crecimiento folicular. Las hembras mamíferas, tienen al nacer un número finito de folículos primordiales, cada uno con un ovocito detenido en meiosis I, rodeado de células foliculares planas que al llegar a la pubertad son llamados a crecer en cohortes (Fair, 2003) (Fig. 1, A1). La iniciación del crecimiento folicular es conocida como activación del folículo primordial. Uno de los signos iníciales en el llamado al crecimiento, es la proliferación y cambio en la forma de las células de granulosa que rodean el ovocito, la cual pasa de ser aplanada a cuboide (Fortune et al., 2000; Fair, 2003). Estas células transformadas, inician la expresión del antígeno nuclear de proliferación celular (PCNA), que activa la mitosis en las células adyacentes, formando el cúmulos oophurus (Wyji et al., 1996; Wyji et al., 1997) (Fig. 1, A2).

Se cree que existe un factor inhibidor en la médula, que mantiene los folículos primordiales detenidos en la parte más interna del ovario; como la estructura ovárica presenta constantemente cambios dinámicos, esto podría afectar el contacto de los folículos con el factor inhibidor, lo que explicaría en parte el llamado en forma de cohortes de aquellos ovocitos que se encuentran hacia la corteza ovárica (Fortune et al., 2000). Una de las moléculas involucradas en la activación del folículo primordial es el kit ligy, que es producido por las células de granulosa y cuyo receptor es expresado posteriormente por las células de la teca (Fig. 1, A3), las células germinales y el ovocito (Fortune et al., 2000), este factor probablemente promueve la reorganización de las células de la teca en el paso de folículo primario a folículo preantral (Nilsson y Skinner, 2001).

Algunos de los factores que han sido estudiados en la expresión génica durante la activación del folículo primordial, pero que no sabe con claridad el papel conjunto que juegan: las proteínas morfogenéticas de hueso (BMP-15) en ovocitos primarios (Dube et al., 1998), el factor de detenimiento del cigoto 1 para el crecimiento del ovocito (Zar 1), el factor de la línea germinal α (FIG α) para las glicoproteínas de zona pelúcida (Soyal et al., 2000), el factor de crecimiento fibroblástico (FGF-8), que promueve la proliferación de las células de la teca, granulosa y estroma ovárico induciendo el desarrollo del folículo primordial (Valve et al., 1997; Nilsson y Skinner, 2001), la hormona antimulleriana (AMH) en foliculogénesis temprana (Durlinger et al., 2002), el factor de diferenciación (GDF-9) del crecimiento durante el crecimiento folicular (Hanrahan et al., 2004) y las Conexina 37 y 43 (Cnx37 y Cnx43) involucradas en la comunicación intercelular (Marchal et al., 2003) (Fig. 1, A4).

Posterior al llamado de una cohorte, los folículos deben progresar a través de unas fases de crecimiento en ondas foliculares que concluyen en la onda ovulatoria, en la cual se cumplen todas las fases de desarrollo folicular: folículo primordial, folículo primario, folículo secundario, folículo preantral, folículo antral, folículo dominante y folículo ovulatorio (Figs. 1: A1, B1, C1, D1, E1), detalles al respecto son ampliamente revisados por Fair T(Fair, 2003).

Durante las primeras etapas, ocurre simultáneamente el crecimiento del ovocito y su maduración citoplásmica, cuyo el folículo alcanza 3 mm, el ovocito detiene el crecimiento (Merton et al., 2003). Este crecimiento puede describirse en dos etapas: 1. La transición entre estado quiescente del folículo primordial a estadío de crecimiento activo y 2. El periodo preovulatorio, donde las gonadotropinas inducen el reinicio del ciclo meiótico, la expansión y separación de las uniones Gap presentes entre las células de la corona radiada y el ovocito (Picton et al., 1998).

A medida que ocurre el desarrollo folicular, se van presentando cambios al interior del ovocito, que conllevan a su crecimiento y reordenamiento citoplasmático.

2. Crecimiento del ovocito y maduración citoplásmica. Durante la fase de crecimiento, el ovocito adquiere una organización citoplásmica que depende de la expresión de genes y de la multiplicación, modificación y redistribución de organelas, además de la modificación postranscripcional de los mARNs que serán acumulados para su posterior uso durante el clivaje temprano del embrión, (Picton et al., 1998; Smith, 2001; Trounson et al., 2001). Durante el crecimiento y maduración del ovocito existen tres puntos de control importantes para la regulación del ciclo celular: El primero ocurre durante la fase G1 donde se monitorea el crecimiento y tamaño celular; el segundo se da en la fase S y vigila la replicación del ADN; el tercer punto de control es en la fase G2, donde se reconocen posibles daños o anormalidades sobre el huso meiótico (Fulka et al., 1998; Trounson et al., 2001). Es importante recordar que cuyo el ovocito reinicia meiosis el resultado final serán dos divisiones celulares consecutivas incompletas (cuerpos polares) sin pasar nuevamente por fase de S (Gross et al., 2001).

El crecimiento del ovocito y la organización de la zona pelúcida (ZP), dependen de la comunicación intercelular con el cumulus, vía uniones Gap, que permiten el paso de moléculas desde el ambiente folicular hasta el ovocito y viceversa (Fair, 2003) así como por la liberación conjunta de glicoproteínas y otros factores (Fig. 1, B3). La expresión coordinada de los genes que codifican para las glicoproteínas de ZP (ZP1, ZP2 Y ZP3) está regulada por FIGα, que a su vez regula otros genes involucrados en la foliculogénesis (Liang et al., 1997; Soyal et al., 2000) (Fig. 1, B3). Las tres glicoproteínas de la ZP son conservadas evolutivamente, pero su organización entre especies es diferente, lo cual confiere la especificidad de reconocimiento con el espermatozoide (Picton et al., 1998). Junto con el inicio de la formación de la zona pelúcida y el crecimiento del ovocito, el ooplasma sufre un cambio en la cantidad y distribución de sus organelas y moléculas, que le permiten sostener su propio desarrollo y acumular factores para los clivajes iniciales del embrión (Picton et al., 1998), estos eventos se pueden estudiar como un conjunto de arreglos celulares y moleculares.

Arreglos celulares. Hoy en día se postula que la organización molecular y celular del ovocito esta regulada de forma altamente organizada y modula el clivaje temprano por ejes de segmentación preestablecidos (Duranthon y Renard, 2001).

Citoesqueleto: el citoesqueleto del ovocito presenta una inestabilidad dinámica durante los procesos de reorganización celular que ocurren durante el crecimiento y la maduración. La tubulina soluble y la polimerizada, están en constante reorganización gracias a los procesos de polimerización y despolimerización (Wang y Lessman, 2002); durante el crecimiento del ovocito, los microtúbulos se encuentran en arreglo de tubulina en polímeros largos anclados y dirigidos por uno o varios centros organizadores de microtúbulos (MTOC), las funciones caracterizadas hasta el momento incluyen: 1. La organización de los cromosomas, proceso regulado por fosforilación y desfosforilación del centrosoma (Wickramasinghe y Albertini, 1993), 2. la separación final de los cromosomas para la formación del cuerpo polar, que requiere una relación coordinada entre microtúbulos, centrosoma, cinetocoro y cromosomas (Ma et al., 2003) y 3. la redistribución de organelas en el ooplasma.

Algunos de los factores que modulan la inestabilidad dinámica incluyen moléculas como p34^Cdc2, ciclina B, c-mos y MAP kinasa (Smith, 2001; Wang y Lessman, 2002) (Fig. 1, C2, C3). Se sabe poco acerca de los demás componentes del citoesqueleto durante estos procesos de adquisición de la competencia del ovocito, por lo cual se evidencia un campo de acción interesante para futuras investigaciones.

Aparato de golgi: el aparato de golgi aumenta de tamaño, formando sacos aplanados con cisternas grandes en la periferia ooplásmica, desde allí, participa en la exportación de glicoproteínas para formar la zona pelúcida y en la formación de los gránulos corticales (Picton et al., 1998) (Fig. 1, C3). Las membranas del aparto de golgi se reorganizan durante el progreso de la meiosis para distribuirse finalmente alrededor de los pronúcleos posterior a la fertilización (Payne y Schatten, 2003). Se cree que el aparato de golgi es una organela autónoma, estable, capaz de modular su propia organización, pero además comodulado por moléculas como la GM130 (Payne y Schatten, 2003) (Fig. 1, C3). Aunque se sabe muy poco de esta organela en el ovocito, por el momento, es claro que el aparato de golgi es importante durante el crecimiento y maduración, y necesario para la expresión de proteínas de membrana involucradas en señalización (Payne y Schatten, 2003) .

Retículo endoplásmico: los eventos de activación posteriores a la fertilización, incluyen la exocitosis del contenido de los gránulos corticales hacia el espacio perivitelino, la formación de los pronúcleos y la reiniciación de la meiosis. Estos procesos ocurren como consecuencia de las oscilaciones de iones de calcio liberado del retículo endoplásmico hacia el citosol, estas ondas de Ca⁺⁺ son iniciadas con la entrada del espermatozoide y mediadas por un mecanismo dependiente de inositol trifosfato (IP3), sin embargo, se ha comprobado que la sensibilidad al IP3 se adquiere de forma gradual durante la maduración del ovocito y corresponde a la reorganización del retículo endoplásmico y al incremento en el número y redistribución de los receptores de IP3 (Eppig et al., 2004) (Figs. 1, D2, D3).

Nucléolo y ribosomas: durante el crecimiento del ovocito ocurre un cambio de conformación del nucléolo, de un estado de configuración en red fibrilogranular difusa, a un estado denso y uniforme compuesto exclusivamente por material fibrilogranular (Fulka et al., 1998). Este cambio concuerda con el periodo marcado de producción de ARNs y proteínas que refleja un metabolismo elevado por parte del ovocito en crecimiento; los ribosomas ensamblados en el citoplasma no se agregan al retículo endoplásmico, sino que se mantienen en agrupaciones flotantes en el citosol. La cantidad de ARN se incrementa 300 veces en los ovocitos en crecimiento, y la mayoría corresponde a ARN ribosomal (Eppig J et al., 2004).

Es evidente que las organelas más estudiadas en el ovocito han sido las mitocondrias y el citoesqueleto, sin embargo, aun sabemos poco acerca del retículo, el aparato de golgi y el nucléolo, por lo cual es necesario más investigaciones en esta área. La reorganización de organelas y su maduración funcional, no son los únicos cambios durante el crecimiento del ovocito; el ARN, las proteínas y los lípidos también presentan cambios durante el desarrollo, esto, lo estudiaremos en conjunto como maduración epigenética.

Maduración epigenética. La maduración epigenética consiste en modificaciones estables de la cromatina que influyen sobre la expresión de genes sin alterar la secuencia de ADN (Eppig J et al., 2004). La actividad biosintética del ovocito es elevada durante el periodo de crecimiento folicular, donde ocurren cambios que confieren al genoma marcadores específicos ligados al futuro cromosoma X activo del ovocito o lo que se denomina genes improntados. Esto se ha comprobado por la presencia de uno o mas nucléolos activos, la elevada actividad de la ARN polimerasa y la continua captación de aminoácidos y ribonucleósidos del medio vía uniones Gap (Picton et al., 1998) (Fig. 1, D3).

Aparentemente la regulación génica del ovocito, esta mediada por las células de granulosa, quienes reciben señales endocrinas y paracrinas del fluido folicular y posteriormente envían señales de control de expresión génica al ooplasma, controlando la conformación de la cromatina durante el crecimiento y maduración del ovocito y formando una compleja red de señalización que converge en la inducción de modificaciones sobre los mARN y las proteínas, las cuales permanecerán como reserva para el sustento de la transición ovocito-embrión y para la embriogénesis temprana (Fig. 1, D3). Estos mRNA y proteínas se conocen como factores de efecto materno (Eppig J et al., 2004). Es claro que la adquisición de la competencia en cuanto a moléculas de reserva para el desarrollo temprano no es dependiente solamente del genoma del ovocito, sino de regulación externa mediada por las células que forman el complejo folicular. Existen algunas modificaciones especializadas tanto en los ARNs como en las proteínas de efecto materno.

ARNs: en la fase de crecimiento, el ovocito sintetiza gryes cantidades de ARN, dividido en diferentes categorías: ARN ribosomal un 60-65% (rARN), ARN de transferencia 20-25% (tARN) y ARN heterogéneo 10-15% (hARN), este último incluye el ARN mensajero (mARN) que será almacenado en el ovocito para soportar el desarrollo embrionario (Picton et al., 1998) (Fig. 1, D3).

El mARN encubierto es responsable del mantenimiento del embrión durante el clivaje temprano, periodo en el cual la trascripción es restringida. La regulación de la traducción de estos mARN no está comprendida del todo si se tiene en cuenta que algunos serán necesarios durante los primeros clivajes y otros, aun después de la activación del genoma embrionario. Las fallas en el procesamiento de este tipo de ARN se han asociado con los bajos índices de competencia de los ovocitos madurados in vitro.

Proteínas: el ovocito en crecimiento es muy activo para la síntesis de transcriptos nucleares y mitocondriales, las proteínas sintetizadas, son usadas para la diferenciación de sí mismo, para la comunicación con las células de granulosa, para la formación de la zona pelúcida, durante la fertilización y para el desarrollo temprano (Picton et al., 1998). Por otra parte, algunas proteínas que no pueden ser sintetizadas por el ovocito serán importadas por endocitosis a partir de las células de granulosa (Trounson et al., 2001).

Se ha demostrado que en el ovocito se expresan activamente alrededor de 900 genes (Merton et al., 2003), cuya trascripción se detiene en el momento que ocurre el rompimiento de la vesícula germinal (Christians et al., 1999). La vesícula germinal es el nombre que recibe el núcleo, debido a la apariencia acuosa y el gran tamaño durante esta etapa del ovocito (Byskov et al., 2002)

Algunas proteínas como el factor de trascripción oct-4 (Oct-4), la STAT-3 y la leptina, presentan un patrón de distribución polarizado hacia una región específica y posiblemente jueguen un papel importante en la diferenciación celular durante el desarrollo embrionario (Palmieri et al., 1994).

Vesículas lipídicas y otros componentes ooplásmicos: se ha encontrado que el citoplasma es particularmente rico en vesículas lipídicas que se acumulan de forma homogénea por el ooplasma (Fair, 2003) (Figs. 1: D2, D3). Durante el crecimiento se acumulan también gránulos de glicógeno, proteínas y cuerpos cristalinos multivesiculares, que aun no están bien caracterizados y que en conjunto reflejan la elevada actividad metabólica del ovocito en esta fase (Picton et al., 1998).

Se puede concluir que el ovocito en su desarrollo requiere un complejo cambio y reorganización tanto de sus organela, como de sus componentes citoplasmáticos solubles, sin embargo, aún falta mucho por comprender en este aspecto, lo que pone en evidencia la necesidad de mayores investigaciones.

Los cambios nucleares que suceden como parte final del proceso de desarrollo del ovocito dentro del complejo folicular, son esenciales para la posterior fertilización y adecuado desarrollo embrionario, solo unos pocos ovocitos terminarán el proceso, ya que la mayoría sufrirán atresia durante el avance de la onda folicular.

3. Maduración nuclear

La oogonia inicia meiosis durante el desarrollo fetal temprano, los ovocitos progresan a través del zigotene, paquitene y diplotene temprano, deteniéndose en este punto de la profase I (Picton et al., 1998; Sagata, 1998; Eppig J et al., 2004), La maduración nuclear, entendida como el reinicio de la meiosis se dará posterior a la pubertad y desencadenada en la mayoría de especies por un pico de LH preovulatorio (Fig. 1: E2, E3). Al final del periodo de crecimiento y antes del reinicio de la meiosis, el núcleo del ovocito se caracteriza por su gran tamaño y su tinción pálida y difusa con colorantes como Hoechst, a este estado nuclear se le conoce como vesícula germinal (VG) (Picton et al., 1998). Una vez el ovocito ha alcanzado su máximo tamaño, continúa con la meiosis, proceso que llevado a término se denomina competencia meiótica (De Vantery et al., 1997), y ocurre durante tres etapas: 1. rompimiento de la vesícula germinal (GVBD) que se inicia con la fosforilación de la lámina nuclear y la disolución del nucléolo (Smith, 2001), 2. progreso hasta metafase I y expulsión del primer cuerpo polar, y 3. continuación a metafase II de meiosis II para alcanzar el estado haploide en el momento del contacto entre el espermatozoide y el ovocito cuyo es expulsado el segundo cuerpo polar (Sun y Nagai, 2003; Rodriguez y Farin, 2004). Este proceso es dependiente de la inestabilidad dinámica del citoesqueleto (Smith, 2001).

Factores inhibidores: el AMPc ha sido la molécula principalmente involucrada en la regulación de la meiosis, los niveles altos activan la Proteína kinasa A dependiente de AMPc (PKA-AMPc), la cual regula la intervención de las purinas e inhibe el ciclo meiótico (Picton et al., 1998). La PKA es una proteína tetramérica con dos subunidades catalíticas y dos regulatorias (Sirard et al., 1998).

Se han planteado diferentes hipótesis para la regulación de los niveles de AMPc dentro del ovocito: 1. regulación por la vía de las uniones Gap, donde la granulosa transfiere AMPc al ooplasma; y 2. la producción interna de AMPc en el ooplasma mediado por la adenilciclasa (AC) que transforma ATP en AMPc, y la Fosfodiesterasa (PDE) que inactiva el AMPc transformándolo en 5’AMP, el cual es inefectivo para la activación de PKA (Kalinowski et al., 2004).

El papel del AMPc en la regulación del ciclo meiótico está bien establecido: niveles altos en el ooplasma inhiben la progresión de la meiosis, mientras que niveles bajos la activan (Sirard et al., 1998). La activación de la AC está regulada por los dominios α, β y γ de una proteína Gs presente en el ovocito (Kalinowski et al., 2004), sin embargo, hasta el momento se desconoce cuál es la vía de activación para la expresión de ésta. Debido a que la PKA se encuentra tanto en las células del cúmulus como en el ovocito, se ha propuesto que la subunidad reguladora puede modular la trascripción de ciertos genes en las células del cúmulos, mientras que la subunidad catalítica podría mantener el arresto meiótico fosforilando proteínas claves en el ooplasma. La Proteína kinasa C (PKC) ha sido también propuesta como factor regulador del reinicio de la meiosis (Sirard et al., 1998; Kishimoto, 2003), ya que se han encontrado las isoformas α, β y γ en ovocitos porcinos donde la activación de PKC inhibe el GVBD (Sun y Nagai, 2003). Las proteínas fosfatasas 1 y 2A (P1 y P2A) también juegan un papel importante en la regulación del ciclo meiótico (Sirard et al., 1998), pero la ruta de señalización aún se desconoce. Lo que si se sabe, es que cuyo los ovocitos son extraídos del ambiente folicular, se reinicia la meiosis espontáneamente, esto deja claro que la composición del fluido folicular contiene factores que participan indirectamente en el mantenimiento del detenimiento del ciclo meiótico (Sirard et al., 1998). Dentro de los factores foliculares postulados se encuentran el ácido linoleico (Homa y Brown, 1992), la hipoxantina (Downs et al., 1985) y el factor inhibidor de la maduración del ovocito (OMI) (Tsafriri et al., 1982). Estas rutas se resumen en la figura E1.

Factores activadores: el pico preovulatorio de LH, modula el rompimiento de las uniones Gap y simultáneamente el GVBD, con la consecuente progresión hasta metafase I y la expulsión del primer cuerpo polar (Picton et al., 1998). Usualmente es aceptado que el descenso del AMPc es ocasionado por el rompimiento de las uniones Gap, este evento ha sido relacionado con la fosforilación de Cnx43 por una PI 3 kinasa, lo cual conduce al cierre de comunicación del complejo de la unión Gap y por tanto disminuye el suministro de AMPc hacia el ooplasma (Sun y Nagai, 2003).

El factor promotor de meiosis (MPF) es una kinasa treonina/serina reguladora universal del ciclo meiótico, que consta de una subunidad catalítica p34^Cdc2 y una subunidad reguladora Ciclina B (Trounson et al., 2001). La treonina de p34^Cdc2 es desfosforilada simultáneamente con la fosforilación de la Ciclina B en la treonina 161 por la CAK (Kinasa activadora de Cdc2), quien regula de esta forma la actividad de MPF (De Vantery et al., 1997; Sun y Nagai, 2003).

El ovocito acumula durante el crecimiento las subunidades p34^Cdc2 y Ciclina B o un complejo pre-MPF, que se mantiene inactivo por la fosforilación de los residuos treonina 14 y tirosina 15 y la interacción con el gen WEE1 (Parker et al., 1991); la activación del pre-MPF a MPF ocurre gracias a la desfosforilación de estos residuos por la acción de la fosfatasa Cdc25 (De Vantery et al., 1997). El complejo pre-MPF activado sincrónicamente con el GVBD, aumenta hasta que alcanza la metafase I, para luego disminuir durante la anafase y la telofase; nuevamente es activado hasta alcanzar metafase II y se mantiene activo hasta la fertilización gracias a la interacción con CSF (Factor citostático) y el oncogen c-mos, que codifica para una proteína kinasa de serina/treonina llamada mos, la cual fosforila la ciclina B y así, participa en la regulación del ciclo meiótico (Trounson et al., 2001).

La MAP (Proteína activada mitogénica o también llamada proteína asociada a microtúbulos) es otra molécula asociada con el reinicio del ciclo meiótico, durante la maduración nuclear, esta kinasa sufre fosforilación y se torna activa (De Vantery et al., 1997), esta molécula se conoce de forma alternativa como ERK (Kinasa de regulación extracelular). MAP ha sido asociada con los eventos de regulación de microtúbulos, ensamblaje del huso y condensación de cromosomas (Trounson et al., 2001; Sun y Nagai, 2003), el hecho de que dos tipos de ER hayan sido aislados de los ovocitos durante la maduración, erk1 y p42^erk2 (Duranthon y Renard, 2001) permite pensar que tienen funciones especializadas y regulan diferentes rutas, sin embargo, al inhibirla no se inhibe el reinicio de la meiosis, con lo cual se concluye que aunque no es esencial para el desarrollo de este evento, posiblemente juega un papel importante en las cascadas de señalización que conducen a la adquisición de la competencia nuclear (Sun y Nagai, 2003).

Esteroles de activación de meiosis MAS también han sido relacionados dentro de la orquestación que conduce al reinicio del ciclo meiótico, FF-MAS y T-MAS se presentan de forma ubicua como intermediarios en la vía de formación de colesterol a partir de lanosterol debido a su carácter lipofílico, MAS se encuentra ligado a proteínas en el fluido folicular, además, se cree que las células de granulosa crean una barrera para evitar que el MAS alcance el ovocito y se induzca la meiosis tempranamente (Byskov et al., 2002), la ruta de señalización no es conocida, aunque se sabe que también participa en la regulación de la dinámica de microtúbulos. Esto abre un campo de investigación para dilucidar la función de esta molécula durante el crecimiento y maduración del ovocito.

El progreso de la meiosis una vez reiniciado el ciclo, requiere la cooperación de un complejo de proteínas involucradas en el ensamblaje de los microtúbulos y la formación del huso meiótico, algunas de estas proteínas son NuMA (Proteína del aparato mitótico nuclear), tubulina, polo-like kinasa 1 y CENP-E (Proteína del centrómero E) (Sun y Nagai, 2003), las cuales actúan coordinadamente para lograr la formación y expulsión de los cuerpos polares al final de los ciclos de meiosis I y II. La etapa de maduración nuclear aunque es la más corta (< 24 horas), está regulada por una gran cantidad de señales, muchas de las cuales aun desconocemos su función dentro de esta gran orquestación. Estas rutas se resumen en la figura E2.

La adquisición de la competencia del ovocito es un proceso complejo que involucra la maduración integral (núcleo, citoplasma y expresión génica), que ocurren coordinadamente en tiempos y espacios determinados. Probablemente, los procesos de maduración in vitro aun son insipientes en cuanto a moduladores de maduración citoplasmática y epigenética, aun cuyo los porcentajes de maduración nuclear son altos (> 80%). Se evidencias gryes vacios del conocimiento en esta área por lo cual se recomienda realizar mayores investigaciones para dilucidar los mecanismos celulares y moleculares durante estos eventos fisiológicos.

AGRADECIMIENTOS

En forma especial reconocemos el apoyo de Colciencias para la realización de este artículo mediante recursos del proyecto 314.

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