DESCIFRANDO LAS BASES MOLECULARES DE LA RESISTENCIA CUANTITATIVA

Deciphering the Molecular Bases of Quantitative Resistance

CAMILO LÓPEZ¹ Ph. D.

¹Departamento de Biología (edificio 421), Universidad Nacional de Colombia, Bogotá, Colombia. celopezc@unal.edu.co

Presentado 17 de marzo de 2011, aceptado 16 de mayo de 2011, correcciones 7 de junio de 2011.

Uno de los factores que más afectan los cultivos son las enfermedades ocasionadas por patógenos. La resistencia vegetal ha sido clásicamente dividida en dos tipos: i) completa, vertical o cualitativa que es gobernada por un solo gen e ii) incompleta, horizontal o cuantitativa la cual es gobernada por varios genes. Aunque la resistencia cuantitativa provee resistencia de amplio espectro y es durable, los mecanismos moleculares subyacentes no han sido estudiados en detalle. En esta revisión se propone un modelo basado en co-localización de genes similares a los genes clásicos de resistencia cualitativa con QTLs (Quantitative Trait Loci) para explicar el mecanismo involucrado en el reconocimiento del patógeno durante la resistencia cuantitativa. Además se presenta información acerca del progreso obtenido en los últimos tres años para entender este tipo de resistencia, lo que culminó con la clonación de varios genes asociados a resistencia cuantitativa. En conjunto, estos datos proveen nuevas luces sobre la naturaleza genética de este tipo de resistencia y de cómo puede ser empleada en programas de mejoramiento genético.

Palabras clave: resistencia cuantitativa, QRLs, resistencia durable, clonación.

ABSTRACT

Plant pathogens are some of the most important factors affecting crop production. Classically two general types of plant resistance to pathogens have been recognized: i) complete, vertical or qualitative resistance governed by a single gene; and ii) incomplete, horizontal or quantitative resistance, which is governed by several genes. Although quantitative resistance provides broad spectrum and more durable resistance, the underlying molecular mechanism involved in pathogen recognition has not been deeply studied. In this review, we proposed a model to explain the molecular mechanism involved in the pathogen recognition during the quantitative resistance. This is based on the co-localization of similar classical qualitative resistance genes with QTL (Quantitative Trait Loci). In addition, information is presented about the progress made in the last three years towards understanding this complex resistance, which has culminated in the cloning of several quantitative resistance genes. Taken together these data provide new insights about this type of resistance and how we can use it for crop improvement.

Plantas y microorganismos han co-evolucionando durante millones de años. Como producto de esta co-evolución las plantas han desarrollado mecanismos para evitar la colonización por parte de patógenos y éstos a su vez se han adaptado para poder obtener los nutrientes de las plantas y suprimir las respuestas de defensa (Zipfel, 2009). Desde que se reconoció la base genética de la resistencia de plantas a patógenos, ésta se ha clasificado clásicamente en resistencia cualitativa (monogénica) y cuantitativa (oligo o poligénica; López, 2008). La base genética de la resistencia cualitativa descansa en el modelo gen por gen propuesto por Flor en los años cincuenta, para explicar la base de la herencia de la resistencia en lino y la herencia de la patogenicidad de la roya del lino (Flor, 1955). Desde entonces, esfuerzos importantes se encaminaron en identificar y aislar los genes responsables de la resistencia. Debieron pasar casi 50 años desde el planteamiento de Flor para que se aislaran los primeros genes de resistencia (Hammond-Kosack y Kanyuka, 2007). A pesar de conferir resistencia a patógenos tan disímiles como virus, bacterias hongos, nemátodos e incluso insectos, las proteínas de resistencia poseen combinatorias de unos pocos dominios conservados. El grupo de proteínas de resistencia más común presenta en la región central un dominio de unión a nucleótido (NBS, Nucleotide-Binding Site), en el extremo C-terminal un dominio de repeticiones ricas en leucinas (LRR, Leucine Rich Repeat) y en la región N-terminal ya sea un dominio de tipo coiled-coil (CC), o dominios con similitud a las proteínas Toll de Drosophila y a interleukinas IL-1 de mamíferos (dominios TIR) y han sido denominadas CC-NBS-LRR y TIR-NBS-LRR respectivamente (Hammond-Kosack y Kanyuka, 2007). Otro tipo de proteínas R se caracteriza porque sus miembros poseen solamente un dominio LRR extracelular, como las proteínas de la familia Cf de tomate (Solanum lycopersicum) que confieren resistencia al hongo Cladosporium fulvum (Stergiopoulos et al, 2010). Una proteína particular es RRS1-R de Arabidopsis que confiere resistencia a Ralstonia solanacearum, ya que además de poseer una estructura TIR-NBS-LRR posee una señal de localización nuclear y un dominio WRKY implicado en la activación transcripcional de genes de defensa (Deslandes et al, 2002). La función particular de las proteínas R es reconocer proteínas particulares de patógenos denominados efectores (Ma y Guttman, 2008). Las proteínas efectoras tienen a su vez como función la supresión de la inmunidad mediada por PRRs (Pattern Recognition Receptors) quienes reconocen PAMPs (Pathogen Associated Molecular Patterns) de los patógenos (Ma y Gutman, 2008). Este tipo de inmunidad ha sido denominada recientemente PTI (PAMP Trigger Immunity) y corresponde al concepto clásico de resistencia no hospedero, la cual es la que presentan todas las variedades de una especie vegetal particular frente a todas las variantes de un patógeno específico. Los PAMPs corresponden a moléculas conservadas y requeridas para la vialidad del microorganismo, como lo es el flagelo, el factor de elongación Tu (EF-Tu) o la quitina (Zipfel, 2009). La percepción de estas moléculas depende de receptores PRRs, los cuales poseen también un grupo de dominios conservados que incluyen un LRR o un LysM extracelular y un kinasa citoplasmático (Zipfel, 2009). Un patógeno puede poseer un repertorio de efectores que varía entre 30 a 100, pero basta con que al menos uno de ellos sea reconocido por una proteína R para que se desencadene la respuesta de defensa. Cuando la proteína efectora es reconocida por la proteína R recibe el nombre de proteína Avr (Ma y Gutman, 2008). Posterior al reconocimiento se induce la activación de la respuesta que confiere la resistencia, limitando el crecimiento y desarrollo del patógeno. Las vías de señalización inducidas en respuesta al ataque incluyen la actividad de MAP kinasas y conllevan a la regulación de la transcripción génica (Doods y Rathjen, 2010). La defensa está comúnmente asociada con la expresión de proteínas relacionadas con patogenicidad (PR, Pathogenesis Related), producción de especies reactivas de oxígeno (ROS, Reactive Oxygen Species), reforzamiento de la pared celular (deposición de calosa y compuestos fenólicos) y acumulación de compuestos antimicrobianos, como fitoalexinas. Todos estos procesos conllevan a la muerte celular localizada, conocida como respuesta hipersensible en el lugar del ataque, evitando así la colonización del patógeno a los tejidos sanos de la planta (Doods y Rathjen, 2010). La resistencia cualitativa al ser gobernada por un solo gen, es de relativo fácil estudio (Fig. 1A) y por esta razón se ha constituido en el modelo para el estudio de las bases moleculares de la resistencia en general. La resistencia cualitativa, también denominada vertical o raza especifica, es fuertemente efectiva y completa pero, como su nombre lo indica, solamente hacia razas o cepas particulares de una especie de patógeno específico (Hammond-Kosack y Kanyuka, 2007). Aquellas variedades de plantas que posean la proteína R (p. ej. R1) serán resistentes única, exclusiva y específicamente a aquellas cepas o razas de patógenos que posean la proteína de Avr correspondiente (Avr1 en este caso). Este hecho hace que se ejerza una presión selectiva importante sobre poblaciones de patógenos para generar variantes, a través de mutaciones, de la proteína Avr con el objetivo de escapar del reconocimiento (Hammond-Kosack y Kanyuka, 2007). Es por esta razón que la resistencia cualitativa no es durable en el tiempo. Con el fin de aprovechar la amplitud en la respuesta de la resistencia cualitativa, es necesario generar plantas con un amplio espectro de resistencia (resistencia a diferentes cepas y a diferentes patógenos) y durable en el tiempo. Para lograrlo se hace preciso contar con varios genes R, para a través de una estrategia de piramidaje de genes, introducirlos en una planta particular empleando ya sea técnicas de mejoramiento convencional o de transformación genética.

UNO MÁS UNO ES MÁS QUE DOS: LA RESISTENCIA CUANTITATIVA

La resistencia cuantitativa, también conocida como resistencia horizontal o poligénica, como su nombre bien lo indica, está gobernada por varios genes, en donde cada uno de ellos contribuye de manera parcial y particular con un porcentaje de la resistencia total (Kou y Wang, 2010). Este tipo de resistencia, a diferencia de la cualitativa, se ve afectada de manera sustancial, pero con diferentes grados, por condiciones ambientales (Poland et al, 2009). Al ser gobernada por varios genes, esta resistencia es más durable en el tiempo por cuanto es poco probable que ocurran mutaciones simultáneas en varios genes de los patógenos que les permitan superar esta resistencia (Polandet al, 2009). Al mismo tiempo la resistencia cuantitativa es de amplio espectro por cuanto no es específica para una raza o cepa particular de patógeno sino que confiere resistencia a todos los individuos de una especie de patógenos particular (Poland et al, 2009). Sin embargo la resistencia cuantitativa, a diferencia de la cualitativa, no es completa y muestra diferentes niveles dependiendo tanto del bagaje genético de la planta como de las condiciones ambientales (Kou y Wang, 2010). Dada la compleja base genética de la resistencia cuantitativa, la estrategia para la identificación de las regiones genómicas implicadas en ella se ha basado en la detección de QTLs (Quantitative Trait Loci), de manera similar a como se hace para cualquier característica compleja-cuantitativa (Fig. 1B; Kou y Wang, 2010). Por estar asociados a resistencia estos loci se han denominado QRL (Quantitative Resistance Loci). La identificación de QRLs está basada en el estudio de la segregación de la característica de resistencia cuantitativa en poblaciones de mapeo acompañada de pruebas estadísticas que permitan determinar asociación entre marcadores moleculares y la resistencia, medida como carácter cuantitativo, generalmente a través de una escala de síntomas en la población segregante (Fig. 1B; Kou y Wang, 2010). En la actualidad existen varios reportes de identificación de QRL en diferentes especies vegetales contra diferentes grupos de patógenos. El número de QRLs detectados puede variar, así como el porcentaje de contribución de cada uno de ellos a la resistencia. En trigo (Triticum aestivum) por ejemplo, se ha reportado recientemente dos QRLs asociados a resistencia contra Fusarium, los cuales explican hasta 48,8 y 22,8% de la varianza fenotípica (Ma et al, 2010). Varios QRLs se identificaron en tomate contra Xanthomonas dentro de los cuales dos que explican el 29 y 4,8% fueron los más importantes (Hutton et al, 2010). A pesar de la dificultad de realizar mapeo genético y segregación en plantas de manzano (Malus domestica) debido a sus ciclos de vida largos, se han logrado realizar poblaciones de mapeo e identificar QRLs en particular contra Erwinia amylovora (LeRoux et al, 2010). En este estudio se identificaron dos QRLs los cuales contribuyen con el 10 y 15% de la variación fenotípica. En plantas modelo también se han identificado varios QRLs como en papa (Solanum tuberosum; Gebhardt y Valkonen, 2001), en arroz (Oryza sativa; Ramalingam et al, 2003) a diferentes enfermedades (Zwonitzer et al, 2010). Estos estudios demuestran la complejidad en el análisis de QRLs y recalcan la necesidad de realizar la evaluación fenotípica de las poblaciones segregantes en diferentes ambientes para determinar la estabilidad de QRLs así como también la presencia tanto de QRLs cepa o raza específicos como de QRLs especie-específicos. La presencia de QRLs con un porcentaje alto en la contribución de la variación (por ejemplo, superior al 15 o 20%), hace parte de lo que se conocen como QRLs mayores y pueden ser considerados como blancos interesantes en la utilización de programas de mejoramiento o hacia la identificación de los genes subyacentes. Sin embargo, la presencia de QRLs a efecto menor, cuya contribución puede estar alrededor del 2-10% no debe menospreciarse ya que pueden ser contribuyentes importantes en los programas de mejoramiento (Hu et al, 2008).

BASES MOLECULARES DE LA RESISTENCIA CUANTITATIVA: SE ABRE LA CAJA NEGRA

A pesar de la importancia que tiene la resistencia cuantitativa, estudios encaminados al conocimiento de las bases moleculares que expliquen su funcionamiento han sido escasos. Solo una adecuada comprensión de los fundamentos moleculares subyacentes a la resistencia cuantitativa permitirá trazar mejores estrategias de fitomejoramiento dirigidas a la generación de plantas con resistencia durable y de amplio espectro. Unos pocos trabajos han buscado plantear algunas hipótesis en donde se sugieren algunos mecanismos moleculares de la resistencia cuantitativa y de los genes detrás de los QRLs (Poland et al, 2009; Kou y Wan, 2010). En los últimos años ha sido posible la clonación efectiva de genes de algunos QRLs lo que ha permitido dar nuevos indicios acerca de la naturaleza de la resistencia cuantitativa. A continuación se examinarán algunas reflexiones alrededor de este tema.

¿SON LOS QRLs GENES R?

La identificación de los primeros genes R fue posible solo 50 años posterior a la formulación del concepto gen por gen (Hammond-Kosack y Kanyuka, 2007). La identificación de los primeros genes R, en los comienzos de los noventa, fue posible gracias al empleo de técnicas de clonación por mapeo posicional y etiquetaje por transposones (transposon tagging), las cuales son laboriosas, dispendiosas y demoradas (Walbot, 1992). Como se mencionó anteriormente, las proteínas R poseen dominios conservados como NBS, los cuales han sido aprovechados para, mediante el empleo de cebadores degenerados, amplificar secuencias de genes de resistencia candidatos o RGA (Resistance Gene Analogues; Meyers et al, 1999). De esta forma se logró desarrollar una estrategia expedita para identificar genes candidatos de resistencia sobre todo para especies que contaban con poca información genética y/o genómica (mapas genéticos, colecciones de transposones, secuencias de nucleótidos; Meyers et al, 1999). El repertorio de RGAs ahora es amplio para muchas especies y sigue creciendo con la reducción en los costos de secuenciación. Cuando se realizaron los estudios de mapeo para identificar la asociación de RGAs particulares con la resistencia a una cepa de un patógeno específico, se encontró que muchos de ellos co-localizaban con QRLs (López et al, 2003; Ramalingam et al, 2003). La co-localización de genes que codifican proteínas con dominios clásicos de proteínas R como NBS con QRLs sugiere que la base molecular de la resistencia cuantitativa puede, al menos parcialmente, explicarse basado en la función de las proteínas R. Posiblemente algunas de las proteínas implicadas en resistencia cuantitativa cumplen la misma función que en el caso de la resistencia cualitativa, es decir actuar como proteínas receptoras que reconocen proteínas particulares del patógeno (Fig. 2A). ¿Por qué entonces el espectro de defensa, la intensidad y rapidez de la respuesta es diferente? Molecularmente es posible que las proteínas “QRLs” receptoras si bien son capaces de reconocer proteínas del patógeno, la afinidad y estabilidad de este complejo proteico no sea muy alto y por ende la proteína del patógeno es solo reconocida parcialmente, lo que significa que se presenta una dinámica entre el estado de unión-desunión de las dos proteínas. En este sentido, las vías de transducción de señales solo son activadas parcialmente y por períodos cortos de tiempo haciendo que la respuesta no sea constante y fuerte (Fig. 2B). En la resistencia cualitativa, la proteína R funciona como un receptor específico que presenta alta afinidad por la proteína Avr del patógeno. La estructura tridimensional de las dos proteínas permite su acople perfecto tal como ocurre en la interacción antígeno anticuerpo. Esta alta especificidad y afinidad permite que las vías de transducción de señales se activen de manera permanente (Fig. 2A). De esta forma una proteína “R cuantitativa” es capaz de reconocer de manera leve algunas proteínas presentes en un grupo de cepas de una especie particular de patógeno, esto explicaría el espectro amplio de esta resistencia (Fig. 2B). Como una planta presenta varias proteínas “R cuantitativas” los patógenos para burlarla deberían mutar varias de sus proteínas simultáneamente, lo que explicaría la mayor durabilidad de la resistencia cuantitativa. Recientemente, en nuestro grupo hemos caracterizado dos proteínas candidatas de resistencia en yuca contra la bacteriosis vascular causada por Xanthomonas axonopodis pv. manihotis (Xam). Los genes, denominados RXam1 y RXam2 fueron identificados inicialmente mediante la estrategia de genes candidatos. RXam1 se identificó gracias al empleo de cebadores diseñados a partir del gen de resistencia Xa21 de arroz que confiere resistencia de amplio espectro a Xanthomonas oryzae. RXam1 se encuentra asociado con un QRL que explica el 13% de la resistencia a la cepa CIO136 de Xam. Recientemente se ha demostrado que Xa21 reconoce el PAMP Ax21 cuya naturaleza molecular es un péptido sulfatado de X. oryzae y está presente en varias cepas de este patógeno, por lo cual se ha considerado que en realidad Xa21 es un PRR (Park et al, 2010). La alta similitud entre RXam1 y Xa21 sugiere que RXam1 puede funcionar como un PRR en yuca. RXam2 fue amplificado a partir de cebadores diseñados complementarios al dominio NBS. RXam2 posee un dominio NBS y un LRR en su extremo C-terminal (López et al, 2003). El gen co-localiza con un QRL que explica el 62% de la resistencia a la cepa CIO151 (López et al, 2007). La validación funcional de estos genes está en curso, pero los resultados preliminares parecen indicar que genes que codifican proteínas receptoras pueden estar implicados en la resistencia cuantitativa. Tomados en conjunto, estos resultados sugieren que tanto la resistencia mediada por PAMPs como la resistencia cualitativa y cuantitativa comparten proteínas con estructuras similares.

CLONACIÓN DE QRLs

Los esfuerzos en la clonación de genes asociados a QRLs culminaron en el 2009 con la clonación de tres genes QRLs, dos en trigo y uno en arroz. El gen Yr36 que confiere resistencia parcial y de amplio espectro a Puccinia striiformis fue clonado por mapeo posicional en trigo gracias al empleo de una población segregante de 4.500 individuos lo que permitió identificar marcadores estrechamente ligados a este locus, para posteriormente, mediante mapeo físico, identificar los clones BACs que poseían dos copias del gen candidato, los cuales fueron designados WHEAT KINASE-START (WKS) 1 y 2. Por análisis de mutantes se logró determinar que WKS1 correspondía a Yr36. La proteína WKS1 posee un dominio kinasa y otro implicado en la unión a lípidos (START), los cuales son importantes para la función de la proteína. De manera interesante el funcionamiento adecuado de esta proteína es dependiente de temperaturas altas (35 ºC; Fu et al, 2009). El gen Lr34 está asociado con resistencia de trigo a dos tipos de royas (Puccinia triticina y P. striiformis) y un mildeo (Blumeria graminis). Este gen ha sido empleado ampliamente en diferentes programas de fitomejoramiento por más de 50 años y la resistencia no ha sido superada por los patógenos. Lr34 provee resistencia parcial la cual se expresa particularmente durante el período de llenado del grano de trigo. Siguiendo una estrategia de mapeo posicional similar a la empleada en la clonación del gen Yr36, fue posible identificar tres genes candidatos para Lr34 (Krattinger et al, 2009). Mediante la secuenciación completa de los genes candidatos en las dos líneas parentales y en una colección de mutantes se logró determinar que el gen Lr34 corresponde a una proteína de tipo transportador ABC. El gen también está presente en algunas variedades susceptibles pero como una forma alélica que produce una proteína con un par de cambios aminoacídicos (Krattinger et al, 2009). Finalmente, por una estrategia de mapeo fino se clonó en arroz el gen pi21, el cual confiere resistencia al hongo Magnaporthe oryzae (Fukuoka et al, 2009). Este gen codifica una proteína rica en residuos prolina que está asociada con la función de transporte de metales. Al mismo tiempo se pudo demostrar que el alelo susceptible regula negativamente la resistencia y que el alelo resistente posee una mutación de pérdida de función (Fukuoka et al, 2009). La estructura y función de estos tres genes revela estrategias diversas y multifuncionales empleadas en la resistencia cuantitativa.

Mediante elegantes estudios que combinan análisis de QRLs, líneas de introgresión, silenciamiento de genes candidatos y evaluación de expresión génica, Manosalva et al, 2009, demostraron la asociación entre QRLs con genes que codifican proteínas tipogermin en la respuesta de defensa de arroz contra Magnaporthe oryzae. Empleando una combinación de genes candidatos y co-localización con QRLs en arroz, fue posible identificar varios genes en arroz asociados a QRLs (Hu et al, 2008). El primero es un gen que codifica para un factor de transcripción de la familia WRKY (OsWRKY13). El segundo gen, OsDR8 codifica para una enzima implicada en la biosíntesis de tiamina. El gen OsGH3-8 codifica para la enzima ácido indol-3-acético-amido sintetasa la cual previene la acumulación de auxina y finalmente OsMPK6 el cual codifica una MAP kinasa. Estos cuatro genes han mostrado ser inducidos en respuesta a patógenos como X. oryzae y M. oryzae y explican entre el 2 y el 5% de la resistencia. La sobreexpresión de OsWRKY13 y OsGH3-8 en plantas de arroz incrementó la resistencia a los dos patógenos. La supresión de OsDR8 provocó pérdida en la resistencia, la cual se recuperó al adicionar tiamina. Mientras que la supresión de OsMPK6 produjo incremento en la resistencia a diferentes cepas de X. oryzae y su sobreexpresión incrementó la resistencia a M. oryzae (Hu et al, 2008). Estas cuatro proteínas así como las proteínas tipo germin están implicadas en vías de señalización que se activan posterior al reconocimiento del patógeno o son proteínas implicadas en actividad antimicrobiana sugiriendo que este tipo de proteínas están relacionadas directamente con la resistencia cuantitativa.

CONCLUSIONES

La resistencia cuantitativa ofrece oportunidades grandes para los programas de mejoramiento encaminados a exaltar la resistencia de plantas a enfermedades ocasionadas por patógenos. Su naturaleza durable y de amplio espectro la convierte en un foco esencial dentro de estos programas. Sin embargo, el aprovechamiento de esta resistencia en programas de mejoramiento, depende en gran medida del conocimiento que ganemos de los mecanismos moleculares subyacentes. En los últimos cuatro años se han logrado progresos importantes en la identificación de genes que se encuentran detrás de QRLs lo que han dado luces acerca de la función molecular de estos genes. Sin duda alguna la base molecular de la resistencia cuantitativa yace a varios niveles que van desde proteínas implicadas en el reconocimiento así como de otras involucradas en las vías de transducción de señales y en la defensa. La combinación de estos genes abrirán seguramente nuevas posibilidades hacia la generación de plantas más resistentes y productivas.

AGRADECIMIENTOS

El soporte financiero para los estudios sobre las bases moleculares de la resistencia de la yuca ha sido suministrado por la DIB y Colciencias. Cordiales agradecimientos a los dos evaluadores que contribuyeron con mejoras al manuscrito.

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