BIODEGRADACIÓN DE RESIDUOS DE ESTACIONES DE SERVICIO Y LAVADEROS INDUSTRIALES POR LA CEPA Rhodococcus erythropolis ohp-al-gp.

Biodegradation Waste of the Stations Service by Rhodococcus erythropolis ohp-al-gp.

OSCAR HÉCTOR PUCCI¹ , Ph. D.; ADRIÁN ACUÑA^1,2, Ph. D.; GRACIELA NATALIA PUCCI^1,3 , Ph. D.

¹Centro de Estudios e Investigación en Microbiología Aplicada (CEIMA). Universidad Nacional de la Patagonia San Juan Bosco. Comodoro Rivadavia, Argentina. ceima@unpata.eud.ar. ²vajcuna@unpata.edu.ar. ³granapu@unpata.edu.ar. Autor de correspondencia: Graciela Natalia Pucci, granapu@unpata.edu.ar.

Presentado el 27 de febrero de 2013, aceptado el 8 de marzo de 2013, correcciones el 22 de abril de 2013.

RESUMEN

La cepa Rhodococcus erythropolis ohp-al-gp fue aislada de un suelo contaminado con aceite de turbinas de la zona norte de la provincia de San Cruz, Argentina. Dado su potencial en la bioremediación, el objetivo del trabajo fue conocer las habilidades para la degradación de compuestos puros y mezclas de hidrocarburos, como también degradación en presencia y ausencia de nitrógeno de gasoil medido por cromatografía gaseosa. La cepa posee la capacidad de utilización de los siguientes hidrocarburos: gasoil, kerosene, aceite lubricante, pristano, hexano, heptano, octano, pentadecano y hexadecano. La cepa R. erythropolis ohp-al- gp presenta un excelente potencial de biorremediación de hidrocarburos conflictivos como son los aceites lubricantes, su posible empleo en la eliminación de barros provenientes de lavados de motores o de estaciones de servicio sería su aplicación más importante. La velocidad de degradación, en condiciones óptimas de cultivo, le confiere una ventaja adicional. Además, posee una degradación baja en ausencia de nitrógeno, factor limitante y frecuente en los suelos patagónicos.

Palabras clave: biodegradación, petróleo, Rhodococcus erythropolis.

ABSTRACT

Keywords: oil, biodegradation, Rhodococcus erythropolis.

INTRODUCCIÓN

Los lavaderos industriales de equipos petroleros y las estaciones de servicio, en sus lavaderos, producen una gran cantidad de barros con concentraciones y calidades muy variables de hidrocarburos. El volumen de barros producidos hace que su eliminación por incineración sea altamente costosa y poco práctica. Los métodos biológicos son de relativo bajo costo, muy amigables para el medio ambiente, y a diferencia de la incineración, no destruye el suelo. Esto es relevante, porque después de eliminados los hidrocarburos biodegradables del suelo, este puede ser rescatado por medio de la reforestación. En la ciudad de Comodoro Rivadavia, se han extremado esos controles, debido a que en esas instalaciones, o en los llamados lavaderos industriales, se acondicionan y lavan equipos de la industria petrolera. El grado de contaminación que producen es muy variable, así como la composición, en la que entran naftas, gasoil, kerosene, aceites lubricantes y grasas, cada uno de ellos con una composición muy compleja (Speight, 1991). Entre las fracciones de los destilados del petróleo que se encuentran en los barros de los lavaderos industriales, la fracción correspondiente al aceite lubricante es una de las que presentaría mayor dificultad para su biodegradación debido a su composición.

En trabajos anteriores se han discutido las posibilidades de los métodos de biorremediación en suelos semiáridos de la Patagonia (Pucci et al., 1998; Pucci et al., 2000; Riss et al., 2002, Pucci et al., 2011), llegándose a la conclusión de que es posible una buena biodegradación aún en climas y suelos con características extremas como los de la Patagonia central.

Por otro lado, las cepas de R. erythropolis han sido descritas como buenas degradadoras de hidrocarburos y alcoholes, utilizando la producción de biosulfactantes para la disolución de los hidrocarburos (Carvalho y Fonseca, 2002; Chang et al., 2009; Song et al., 2011;) y también presentan buena tolerancia a ambientes salinos (Langdahl y Ingoorsen, 1996; Heald et al.,2001; Liu et al., 2009), haciéndolas buenas candidatas para biorremediación de suelos contaminados.

En este trabajo se realizó una experiencia con barros contaminados provenientes de un lavadero industrial y se ensayó la utilización de la cepa R. erythropolis ohp-al-gp, de buena capacidad de biodegradación y adaptación a suelos patagónicos, en el saneamiento de barros contaminados con petróleo provenientes de estaciones de servicio, previo a su disposición final. Para ello se realizó un perfil de utilización de hidrocarburos puros y destilado del petróleo, su capacidad de degradar gasoil en deficiencia de nitrógeno y la inoculación en un suelo contaminado.

MATERIALES Y MÉTODOS

Aislamiento e identificación de la cepa

La cepa bacteriana fue aislada de un suelo contaminado con aceite de turbinas de la zona norte de la provincia de San Cruz, Argentina. El suelo contenía 0,1 % de hidrocarburos totales de petróleo formado por las siguientes fracciones, 86,2 % de hidrocarburos alifáticos, 2,1 % de hidrocarburos aromáticos y 11,7 % de hidrocarburos polares. La identificación de la cepa bacteriana se realizó por su perfil de ácidos grasos de membrana (FAMEs) utilizando el sistema Sherlock de MIDI (versión6.0). La cepa fue identificada como R. erythropolis ohp-al-gp.

La habilidad para la utilización aeróbica de hidrocarburos fue realizada en frascos de 30 ml conteniendo 10 ml de medio base mineral (Pucci y Pucci, 2003) adicionando 0,5 % de los siguientes hidrocarburos: hexano, heptano, n-octano, pristano, pentadecano y hexadecano; y de las mezclas complejas kerosene, gasoil, nafta y aceite de turbina como fuente de carbono y energía. Los frascos se inocularon con 100 µl de una suspensión del microorganismo en solución fisiológica (0,85 % NaCl) con una densidad óptica de 0,5 a 600 nm. La producción de biomasa fue determinada por seguimiento de la densidad óptica de los sistemas a 600 nm (Hosokawa et al., 2010). Todos los hidrocarburos se probaron por triplicado y se incubaron durante 30 días a 28 °C en agitador orbital a 120 r.p.m.

Inoculación de la cepa bacteriana al suelo

Para la realización de la experiencia se confeccionaron dos microcosmos, por triplicado, con 100 g de suelo contaminado con hidrocarburos. El mencionado suelo contenía 2,2 % de hidrocarburos totales del petróleo (TPH), distribuidos en 75,2 %, 18,6 % y 6,2 % de hidrocarburos alifáticos, aromáticos y polares respectivamente. Ambos microcosmos se fertilizaron con nitrógeno y fósforo para lograr una relación C:N:P de 100:5:1 y se les incorporó agua destilada estéril para lograr una humedad igual al 50 % de la capacidad de retención de agua del suelo. Finalmente, uno de los sistemas se inoculó con 2 ml de una suspensión de la cepa bacteriana en estudio de densidad óptica de 0,5 a 600 nm y el otro microcosmo se utilizó como control. La cinética de degradación se efectuó monitoreando el dióxido de carbono producido en los biorreactores, previa captura en una solución de hidróxido de sodio de concentración conocida (Bartha, 1979).

Degradación de gasoil con y sin fuente de nitrógeno

La cepa bacteriana se cultivó en dos tipos de medios de cultivo líquido, uno con nitrógeno denominado MM1 ((NaCl 5 g, K₂PO₄H 0,5 g, NH₄PO₄H₂ 0,5 g, (NH₄)₂SO₄ 1 g, MgSO₄ 0,2 g, KNO₃ 3 g, FeSO₄ 0,05 g, SL 10 B (HCl (25 %) 7,7 mL, FeSO₄. 7H₂O 1,5 g, ZnCl₂ 0,07 g, MnCl₂.4H₂O 0,1 g, H₃BO₃ 0,3 g, CoCl₂.6H₂O 0,19 g, CuCl₂.2 H₂O 0,002 g, NiCl₂.6 H₂O 0,024 g, Na₂MoO₄.2H₂O 0,036 g, agua destilada 1000 ml) 10 ml, agua destilada 1000 ml) y el segundo denominado MM2 con deficiencia de nitrógeno (NaCl 5 g, K₂PO₄H 0,5 g, NaPO₄H₂ 0,5 g, NaSO₄ 1 g, MgSO₄ 0,2 g, FeSO₄ 0,05 g, SL 10B 10 ml, extracto de levadura 0,025 g, agua destilada 1000 ml).

Se diseñaron seis tipos de microcosmos, tres con 100 ml de medio MM1 y tres con 100 ml de MM2 a los que se les adicionaron, por separado, 0,1 % de hexadecano, 0,05 % de naftaleno y 0,1 % de gasoil. Todos los sistemas fueron inoculados con 10 ml de una suspensión del microorganismo en estudio con una densidad óptica de 0,5 a 600 nm. Los sistemas se incubaron a 28 °C en agitación constante a 80 rpm durante 30 días.

Luego de transcurrido este tiempo, los hidrocarburos remantes se extrajeron por agitación durante una hora con 10 ml hexano, se redujo el volumen a 1 ml y la cuantificación se realizó inyectando 2 µl en un cromatógrafo Varian CP-3800 equipado con una columna capilar (VF5ms) de sílicagel fundida de 30 m por 0,25 mm por 0,25 µm y un programa de temperatura de 45 °C iniciales por tres minutos, seguido de una rampa de 45 °C a 275 °C a 12 °C.min^-1, finalizando con 12 min a 275 °C, con una temperatura del inyector y el detector de 200 °C y 300 °C respectivamente, y un detector por ionización de llama. Para la identificación y cuantificación de los hidrocarburos se utilizaron los testigos propuestos por la Environmental Protection Agency en su norma 8015D (2003).

Análisis de datos

los valores obtenidos fueron estudiados utilizando análisis de la varianza (ANOVA) con tres réplicas por nivel, mediante el programa BIOM (Applied Biostatistics Inc., 3 Heritage, Setauket, NY 117II USA) con un nivel de significancia de 5 %. Los resultados mostrados en gráficos y tablas se expresa el valor medio de los triplicados.

La cinética de crecimiento de la cepa R. erythropolis ohp-al-gp, hace de esta una buena candidata por su rápido crecimiento y su gran capacidad de biodegradación de hidrocarburos alifáticos de peso molecular elevado como los que están presentes en aceite lubricante. La formación de biomasa a partir de destilados de petróleo (Fig. 1.a) fue mayor para aceite lubricante, seguido de gasoil y kerosene, no observándose esta capacidad con nafta. Entre los hidrocarburos puros la cepa R. erythropolis ohp-al-gp utilizó n-heptano, n-octano, n-pentadecano, n-hexadecano y pristano (Fig. 1.b). Sin embargo, R. erythropolis ohp-al-gp, no utilizó como única fuente de carbono y energía a ciclohexano, ciclohexanona, benceno, tolueno, xileno, antraceno, fenantreno, benzoato, m-toluato y asfaltenos. En las pruebas, la biodegradación de gasoil, naftaleno y hexadecano en deficiencia de nitrógeno fue inferior. La degradación del gasoil fue un 20 % menor en carencia de nitrógeno, aunque presentó valores de 61 % en estas condiciones. Con el aumento de número de carbono disminuye su degradación en ausencia de nitrógeno, el C12 disminuye su degradación en un 9,8 % menos, pero el carbono C20, lo hace en un 74 % menos que cuando hay nitrógeno en el medio de cultivo (Tabla 1). Los hidrocarburos poliaromáticos se utilizan en el mismo porcentaje con excepción del naftaleno con un 17,68 % menos en ausencia de nitrógeno, sin embargo, el 2-Metilmaftaleno se degradó un 11 % más en ausencia de nitrógeno. El índice de degradación pristano /C17 se encuentra afectado debido a que la cepa estudiada puede utilizar el pristano como fuente de carbono y energía, por lo que también se modifica su valor y el índice no se puede calcular.

La utilización de la cepa como inoculante para la estimulación de la degradación mostró un efecto positivo en la misma aumentando en 100 % la acumulación de dióxido de carbono, en la utilización del hidrocarburo presente en la muestra. En la Fig. 2, se presentan las dos curvas de los promedios de las cinéticas que corresponden a los microcosmos con y sin inoculación de cepa R. erythropolis ohp-al-gp. El seguimiento durante 60 días indica que, para el barro tratado, la opción más rápida corresponde al tratamiento con inoculación, es de hacer notar que la cantidad del inóculo fue importante, siendo la óptima 2 ml de una densidad óptica de 0,5 unidades de absorbancia. El valor final de la mineralización a los 60 días duplica al valor del sistema sin la inoculación de la cepa R. erythropolis ohp-al-gp.

DISCUSIÓN

La cepa fue aislada de un suelo contaminado con aceite, en donde el mayor porcentaje de hidrocarburos es alifáticos de cadena larga, y el suelo en donde se inoculó es proveniente de una estación de servicio que posee contaminaciones con hidrocarburos livianos y pesados, provenientes de los combustibles y aceites lubricantes usados, 75 % hidrocarburos alifáticos, 18,6 % hidrocarburos aromáticos y 6,2 % hidrocarburos polares. La degradación de hidrocarburos depende, entre otros parámetros, de la composición química del residuo, los hidrocarburos aromáticos son los que poseen mayor dificultad de degradación, pero se pueden eliminar de una forma más lenta (Pucci y Pucci, 2003; Acuña et al., 2012), y los hidrocarburos polares poseen una velocidad de degradación muy baja, debido a su baja solubilidad y gran tamaño molecular siendo similares al humus, esta conformación molecular es la que induce su alta persistencia. Los microorganismos presentes en el suelo después de un tiempo variable para cada caso, se adaptan y lo comienzan a utilizar como fuente de carbono y energía, como es el caso de esta cepa bacteriana y de otras cepas bacterianas (Hosokawa et al., 2010).

Los géneros Rhodococcus y Athrobacter son conocidos por su habilidad de degradar un amplio rango de hidrocarburos alifáticos y aromáticos (Ganesh y Lin, 2009; Greer et al., 2010), algunos pueden producir surfactantes (Ganesh y Lin, 2009). La degradación de los alcanos está fuertemente asociada a la solubilidad del hidrocarburo. Los de cadenas cortas (C5 a C9) pueden ser tóxicas para los microorganismos debido a la solubilidad de las mismas en agua (Rojo, 2009), esta es una posible causa de los resultados negativos del ensayo en medio líquido con nafta cuya composición es de carbonos menores a C12, mientras que los hidrocarburos con cadenas superiores a 22 átomos de carbono son poco solubles y generan residuos cuya degradación es dificultosa dada su baja biodisponibilidad para las bacterias. Concordando con lo comentado por Margenise et al. (2012), los mejores resultados se obtienen para la utilización de los hidrocarburos que van de C12 a C18, en nuestro caso C16 y C15 que son hidrocarburos menos tóxicos para las membranas bacterias que el hexano y heptano. Los hidrocarburos ciclohexano y ciclohexanona, no se utilizaron coincidiendo con Solano et al. (2000) en que se pueden utilizar en medios sólidos, pero no permiten el desarrollo en medio líquido, la degradación del ciclohexano se puede dar como un cometabolismo pudiendo degradarse por una comunidad bacteriana (Solano et al., 2000), sin embargo Carvalho y Fonseca (2002) comunicaron de una cepa de Rhodococcus que podía utilizarlo. En nuestro caso, la cepa R. erythropolis ohp-al-gp no pudo utilizarlos al igual que a los aromáticos benceno, tolueno, xileno, tal vez debido a que estos aumentan la fluidez de la membrana causando la muerte del microorganismo en las concentraciones utilizadas. Los hidrocarburos obtenidos de la destilación del petróleo kerosene, gasoil y aceite lubricante se utilizaron obteniéndose los mayores valores que los hidrocarburos puros. Al ser mezclas de diferentes alifáticos, los aromáticos que poseen en menor proporción, no generaron toxicidad, estas mezclas son contaminaciones más frecuentes.

La inoculación de bacterias es cuestionada por muchos debido a que la cantidad bacteriana disminuye 1 log por día (van Elsas et al., 2002). por otro lado, la adición de bacterias a un suelo y la depredación de la misma puede favorecerse por el agregado de nutrientes (Acuña et al., 2008). El agregado de los mismos nutrientes en los suelos patagónicos, genera siempre un resultado positivo, solo si se les adiciona en la cantidad necesaria (debido que en concentraciones mayores se produce una inhibición del desarrollo bacteriano). De un trabajo anterior se concluyó que para optimizar la degradación, la concentración óptima era de C:N:P 100:5:1, y no valores de 100:1:0.1 ya que producían una menor mineralización (Acuña et al., 2007). La sobrevida de esta cepa, está asociada a que es una cepa patagónica extraída de un suelo con características similares y expuestas a un mayor grado de estres debido a la latitud en que se encuentra el suelo de donde se extrajo. Algunos autores proponen encapsular la cepa inoculada con el objetivo de aumentar aumentar su supervivencia (Briglia et al., 1990; Wier et al., 1996). El inóculo mejoró sustancialmente la degradación de los hidrocarburos presentes en el suelo, el mismo realizó una simbiosis con los organismos presentes para una mejor degradación de la mezcla completa, al ser un residuo de una estación de servicio contenía aceites lubricantes usados, y el lavado de los tanques de combustibles, los hidrocarburos livianos como la nafta tienen a eliminarse por evaporación en el sitio, pero los más pesados no. R. erythropolis ohp-al-gp mostró degradación casi paralela del aceite lubricante y la mezcla de gasoil que se siguió con cromatógrafo gaseosa.

La ausencia de nitrógeno en el medio de cultivo produjo una menor degradación de los hidrocarburos (comparado con el medio con nitrógeno), pero igualmente hubo una degradación, tal vez por la probable presencia de enzimas del tipo nitrogenasas que pueden estar presentes en los Rhodococcus (Banerjee et al., 2002). La mayoría de los poliaromáticos se degradaron quedando el naftaleno y el 2-metilnaftaleno en el medio de cultivo con nitrógeno, y en cambio en el medio de cultivo sin nitrógeno solo quedo el naftaleno concordando con Acuña et al., (2012), quienes encontraron que los sistemas con ausencia de nitrógeno poseen una mejor degradación de poliaromáticos.

CONCLUSIONES

La cepa R. erythropolis ohp-al-gp presenta un excelente potencial de biorremediación de hidrocarburos conflictivos como son los aceites lubricantes, su posible empleo en la eliminación de barros provenientes de lavados de motores o de estaciones de servicio sería su aplicación más importante. La velocidad de degradación, en condiciones óptimas de cultivo, le confiere una ventaja adicional. Además, posee una degradación baja en ausencia de nitrógeno, factor limitante y frecuente en los suelos patagónicos.

AGRADECIMIENTOS

Esta publicación ha sido posible gracias al financiamiento del Centro de Estudios e Investigación en Microbiología Aplicada (CEIMA).

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