DOI: http://dx.doi.org/10.15446/abc.v22n2.59703

EVALUACIÓN COMPORTAMENTAL DEL TRASPLANTE DE hMSC-GFP+ EN UN MODELO EXPERIMENTAL DE HEMIPARKINSON EN RATA WISTAR

Behavioral Evaluation of hMSC-GFP+ Transplantation in an Hemiparkinson Experimental Model in Wistar Rat

Jéssica Paola ALCÁZAR ARZUZA¹, Andrea Julieth BAYONA ARCINIEGAS¹, Lina María DE LOS REYES¹, Liliana Francis TURNER¹.

¹ Grupo Modelos Experimentales para las Ciencias Zoohumanas (GME-CZH), Departamento de Biología, Facultad de Ciencias, Universidad del Tolima, Bloque 12. Ibagué, Colombia.

For correspondence. jpalcazara@ut.edu.co

Received: 22^nd August 2016, Returned for revision: 20^th February 2017, Accepted: 23^th March 2017.

Associate Editor: Argel Aguilar-Valles.

Citation/Citar este artículo como: Alcázar Arzuza JP, Bayona Arciniegas AJ, de Los Reyes LM, Turner LF. Evaluación comportamental del trasplante de hMSC-GFP+ en un modelo experimental de hemiparkinson en rata Wistar. Acta biol. Colomb. 2017;22(2):127-136. DOI: http://dx.doi.org/10.15446/abc.v22n2.59703

Se evaluó el efecto del trasplante de hMSC-GFP+ en un modelo experimental de Enfermedad de Parkinson (EP) en 27 ratas Wistar con tres grupos experimentales: control: animales sin cirugía, (CON n=7), lesionado: animales lesionados intracerebralmente con 6-OHDA a nivel de SNpc (LES n = 10) y trasplantado: animales LES con trasplante de hMSC-GFP+ intraestriatalmente (LES-T n = 10). Con el fin de evaluar la influencia del trasplante en el comportamiento motor, un mes después de la lesión, se desarrolló una batería comportamental compuesta por Test Neurológico (compuesto también por Pole Test y Test de Barra transversal, además, de inmunofluorescencia para células de SNpc con TH). Utilizando el test de Anova, se demostró una disminución en el número de giros en animales trasplantados (p=0,005), así como en el test neurológico (p=0,0004) y en el Test de barra transversal, que colocan a este grupo en una posición intermedia con respecto a LES y CON. Existe una posible recuperación de la vía nigroestriatal mediada por el trasplante de hMSC-GFP+.

Palabras clave: terapia celular, células madre mesenquimales, deterioro motor, enfermedad de Parkinson, rata Wistar.

ABSTRACT

The effect of hMSCs-GFP+ transplantation was evaluated in an experimental model of Parkinson's disease (PD) in 27 Wistar rats, or in three experimental groups: control (CON n=7), injured (LES n = 10) and transplanted (LES+T n = 10). In order to evaluate the influence of the transplantation on the motor behavior, one month after the injury, rotation behavior induced by apomorphine, neurological test, transversal bar and SNpc cells positive to TH were developed. Using the Anova test, there was a decrease in the number of turns in transplanted animals (p=0,005) as well as in the neurological test (p=0,0004) and in the transverse bar that lead to this group in an intermediate position regarding LES and CON groups. There is a possible recovery of the transplantation-mediated nigroestriatal pathway of hMSC-GFP +.

Keywords: cell Therapy, mesenchymal stem cells, motor impairment, Parkinson disease, Wistar rat.

INTRODUCCIÓN

La Enfermedad de Parkinson (EP) es un desorden neurodegenerativo que afecta alrededor de seis millones de personas de edad avanzada en el mundo, por lo que se espera que la incidencia aumente a medida que las causas de mortalidad se reducen (Maranis et al., 2011; Crabtree y Zhang, 2012). La EP se caracteriza por manifestaciones motoras como temblor, rigidez, bradicinesia, trastornos de la marcha y del equilibrio (Poletti et al., 2011) y múltiples síntomas no motores como son trastornos cognitivos, del estado de ánimo, gastrointestinales, autonómicos, del sueño, etc. (Wang et al., 2002; Da Cunha et al., 2006; Ardayfio et al., 2008, Aarsland et al., 2010; Aarsland, 2015). En la actualidad, los tratamientos en uso farmacológico con L-DOPA así como la estimulación cerebral profunda mejoran los síntomas parkinsonianos pero no reparan la vía dopaminérgica o previenen su degeneración (Tronci et al., 2012). De esta manera, las nuevas terapias con enfoques nuevos como por ejemplo el trasplante celular, promete restaurar la función dopaminérgica (Bouchez et al., 2008). La terapia celular implica el empleo de células y sus productos para el diagnóstico, tratamiento o paliación de una enfermedad tomando en cuenta que las células se consideran un insumo o su equivalente a un fármaco (Benitez, 2011). En este sentido, el uso clínico de las Células Madre Mesenquimales para la regeneración de tejido, modulación inmunológica, o trasplante ha alcanzado dimensiones de consideración importante y discusión para científicos y comunidades clínicas (Martin et al., 2016). A pesar de la incidencia y prevalencia en la población de la EP, aún es imprecisa la forma en como se desarrolla la EP, para tal efecto, los modelos animales de EP, se han originado a partir de esta idea y se han empleado en una variedad de manipulaciones genéticas y/o de insultos tóxicos exógenos o endógenos para recapitular la sintomatología y/o neuropatología de EP (Da Cunha et al., 2006; Meredith y Kang, 2006). Uno de los modelos más utilizados en los estudios (tanto básicos como aplicados de la EP)es el de lesión de la sustancia negra (SN) utilizando, la 6-hidroxidopamina (6-OHDA) específica para neuronas dopaminérgicas que al ser inyectada estereotáxicamante en la Sustancia nigra pars compacta (SNpc) es capaz de destruir selectivamente las neuronas dopaminérgicas (Masaaki et al., 2010; Blum et al., 2001; Bové et al., 2005). La lesión unilateral de la SNpc provoca un déficit crónico y laterización de la conducta de los animales, los que presentarán actividad rotatoria espontánea, que se ve incrementada con el uso de agonista dopaminérgicos y la indiferencia sensorimotora a los estímulos aplicados en el hemicuerpo contralateral al hemisferio lesionado (Brederlau et al., 2006; Deierborg et al., 2008 Boronat-García et al., 2016). En cuanto a la terapia celular, Luo et al. (2009), concluyen que las CMM trasplantadas intraestriatalmente en un modelo murino de MPTP mejora el comportamiento, no por reemplazo celular sino por reparar mecanismos o por su acción antiinflamatoria. Por otro lado, Glavaski-Joksimovic y Bohn (2013), mencionan que las CM derivadas de médula ósea trasplantadas en el estriado ejercen neuroprotección en contra de la neurodegeneración y mejora la función motora en ratas lesionadas con 6-OHDA. En un ensayo realizado en humanos, se concluyó que éstas células exhiben potencial para diferenciarse a varios precursores dopaminérgicos y en trasplante en modelos animales, induce mejora comportamental en ratas hemiparkinsonizadas (Venkataramana et al., 2010). Varios Test se han usado para calificar modelos en ratones como lo son: actividad locomotora, rotarod, longitud de zancada, test de la rejilla y Pole test. (Taylor et al., 2010), o la prueba de habilidades motoras de las extremidades anteriores (Pavon-Fuentes et al., 2004). Sin embargo, estos test, evalúan el estado motriz del animal representado en el desempeño de la prueba basado en el uso de extremidades anteriores o posteriores, sin ver el modelo experimental como un conjunto complejo de señales comportamentales que involucran todas las extremidades y la cola como un todo. Teniendo en cuenta lo mencionado con anterioridad, este trabajo pretende evaluar si el trasplante de Células madre Mesenquimales positivas a GFP (hMSC-GFP+) tiene un efecto sobre el deterioro motor en un modelo de Hemiparkinson en rata Wistar mediante el uso de una batería comportamental compuesta por: test sensoriomotor, pole test y barra trasversal.

MATERIALES Y MÉTODOS

Se utilizaron 27 ratas Wistar macho de 200 y 250 g de peso corporal, que fueron mantenidas en cajas tipo T-4 en la proporción de cinco animales por caja, con un ambiente convencional controlado (humedad relativa de 60 +/- 5 %, temperatura de 21° +/- 1° C, fotoperiodo de 12:12 luz/oscuridad), en el bioterio de Experimentación de la Universidad del Tolima (BEA-UT), en la ciudad de Ibagué. Recibieron una alimentación controlada 15 g/día/animal (Concentrado Labdiet para Ratas y ratones) y agua ad-libitum acorde a los principios Rectores Internacionales aplicables a las investigaciones biomédicas con animales del Consejo de Organizaciones Internacionales de las Ciencias (Comité consultivo de investigaciones médicas de OMS, 1985), a la ley 84 de 1989 sobre protección animal en Colombia y la Resolución 8430 de 1993. La investigación se revisó y aprobó por el Comité de Bioética de la Universidad del Tolima.

Para comprobar el estado sensorial de los animales se realizó un test neurológico a cada individuo, solo se tuvieron en cuenta, aquellos que ejecutaran la prueba con una eficiencia del 100 %. Se distribuyeron aleatoriamente 27 ratas Wistar así: grupo LES: animales lesionados a nivel de SNpc, a través de una inyección esterotáxica intracerebral con 6-OHDA (n = 10), grupo LES+T: animales lesionados a nivel de SNpc a través de una inyección esterotáxica intracerebral de 6-OHDA y quince días después de comprobada la eficacia de la lesión a través de prueba de rotación inducida por agonistas dopaminérgicos, recibieron el trasplante de células madre mesenquimales humanas (n = 10) y grupo CON: animales intactos (n=7).

Inducción al Modelo de Hemiparkinsonismo con 6-OHDA. Las ratas fueron anestesiadas utilizando un coctel de Ketamina (Gabrica®, Colombia) (80 mg/kg de peso) y Xilacina (Virbac®, Colombia) (5mg/kg de peso) y dispuestas en el aparato estereotáxico (Stoelting® Modelo: 51500; México D.F.) en posición cúbito prono. Los animales recibieron una inyección intracerebral unilateral (hemisferio derecho) de 6-OHDA (Sigma Aldrich, U.S.) (neurotoxina dopaminérgica) a una concentración de 8jjg/3jil de solución salina(0,2 mg/ ml) de ácido ascórbico (Sigma Aldrich, U.S.), mediante una jeringuilla Hamilton (Hamilton®, U.S.) de 10 jl, fueron inyectados 3 jl de la neurotoxina a una velocidad de flujo de 1 jl/min, en las coordenadas AP (antero-posterior)= 4,4 mm posterior de Bregma, ML (medio-lateral) = 1,2 mm a la derecha de la línea media y DV (dorso-ventral) = 7,8 mm por debajo de la duramadre. Después de la inyección la aguja se mantuvo in situ cinco minutos antes de que fuera extraída amablemente para evitar el reflujo.

Aplicación del trasplante. Línea celular MSCh-GFP+. Las células MSCh (células madre mesenchimales humanas) utilizadas para la terapia de reemplazo celular, fueron donadas por el centro Colombiano de Fertilidad y Esterilidad (CECOLFES), obtenidas de un donante sano, previa aprobación por el Comité Institucional de Ética, fueron transfectadas con la proteína verde fluorescente (Green Fluorescent Protein-GFP-por sus siglas en inglés) utilizando la tecnología lentivirus. Pre y post traducción lentivirus, se estudió y caracterizó la morfología de MSC inmunofenotipo, cariotipo, así como a la diferenciación a los linajes osteogénico, adipogénicoa, y neurogénico). Las células se mantuvieron en DMEM bajo en glucosa (Sigma Aldrich, U.S.), 10 % suero fetal bovino (SFB) (Sigma Aldrich, U.S) y 1 %de penicilina /estreptomicina (Ambos reactivos, Thermo Fisher Scientific). Para la preparación de la suspensión celular, las células en cultivo fueron sometidas a una digestión enzimática con tripsina 0,25 %/1mM EDTA. Esta suspensión, se resuspendió en 500uL de medio DMEM sin SFB y se incubaron hasta el trasplante, se realizó el recuento celular en una cámara de Neubauer mediante el test de azul tripán (Thermo Fisher Scientific, U.S.).

Trasplante intracerebral de células madre mesenquimales humanas. Los animales fueron anestesiados con una solución conjunta de Ketamina (Gabrica®, Colombia) (80 mg/kg de peso) y Xilacina (Virbac®, Colombia) (5mg/kg de peso) y colocados en el aparato estereotáxico (Stoelting® Modelo: 51500; México D.F.). Recibieron 2jl de la suspensión celular de MSCh-GFP+, con una concentración de 100.000 en dos puntos esterotáxicos (50.000 cel/uL/punto esterotáxico) en la región estariatal: (1): AP= 1 mm posterior a Bregma, ML= 3,0 mm a la derecha de la línea media y DV=4,5 mm por debajo de la duramadre; y (2): AP= 1 mm posterior a Bregma; ML= 3,0 mm a la derecha de la línea media y DV= 5,0 mm por debajo de la duramadre, respectivamente. El tiempo de cirugía no sobrepaso los 45 minutos posteriores a la preparación de la suspensión celular.

Calidad del Trasplante. Se realizó una expansión de la colonia MSCh-GFP+ donadas, la cual permitió trasplantar en cada animal 2(jl en suspensión celular con una concentración de 100 x 10⁶ (50.000 cel/uL) en la región estriatal, el proceso del trasplante siempre mantuvo el mismo numero de células, puesto que la suspención celular se preparaba simultaneamente al momento de realizar el trasplante en cada animal.

Pruebas comportamentales

Actividad rotatoria. Para evaluar la lesión se llevó a cabo la prueba de actividad rotatoria inducida por inyección intraperitoneal de apomorfina (Sigma Aldrich, U.S.), (0,5 mg/kg de peso) (Mendez y Finn, 1975; Issy et al., 2015), 15 días después de producida la lesión y un mes después del trasplante. La conducta rotatoria se evaluó registrando el número de vueltas completas (360°) contralateral al hemisferio lesionado durante 90 minutos luego de la inyección de apomorfina.

Test neurológico. Consiste en una serie de pruebas que permiten determinar el estado del sistema nervioso central (Bures y Buresova, 1983), se realizan con el fin de determinar la condición sensoriomotriz de los animales para la ejecución de un experimento. Las pruebas que se realizaron fueron las siguientes: 1. Reflejo de Flexión: se apoya el animal en una superficie plana y cerca de los límites al vacío y se retira una de las extremidades para observar la calidad de la reacción flexión y retracción de la extremidad y de apoyo sobre la superficie. 2. Reacción de apoyo o localización por contacto: se acerca al animal desde un plano horizontal a una base plana o mesa y se observa si estira sus extremidades anteriores para hacer contacto con ellas antes que con otra parte del cuerpo. 3. Reflejo de corrección de posición: Se coloca el animal boca arriba sobre una superficie plana. Se espera que el animal asuma inmediatamente la posición correcta (boca abajo y sobre sus cuatro patas). Esto también debe suceder, cuando es sostenido incorrectamente por región lumbosacral y la parte superior del cuerpo que está libre (cabeza, extremidades superiores). Cuando por el contrario la cabeza del animal es sujetada, las extremidades libres, deberán adoptar la posición correcta. 4. Localización visual. Cuando la rata se acerca al borde de una base o mesa desde un plano vertical (de altura), debe localizar la superficie por señales visuales con las vibrisas. Posteriormente, estirar sus extremidades anteriores para posicionarse en dirección hacia el borde de la superficie. 5. Pole Test: Se ubica el animal sobre el extremo superior de un cilindro de aluminio con 1 m de largo x 60 cm de diámetro, forrado con tela gruesa durante un minuto. Se evalúa la corrección de postura del animal para descender de la barra y además el uso de las cuatro extremidades y la cola.

Barra trasversal. La prueba de la barra transversal fue realizada en condiciones apropiadas de silencio e iluminación evaluando sus resultados por observación directa. Las ratas fueron colocadas en el punto medio de una barra de 60 cm de longitud en cuyos extremos se alojaron plataformas de escape redondas de 15 cm de diámetro. Los sujetos experimentales se colocaron en una barra de 2,5 cm de diámetro. La barra se situó a una altura de 60 cm del suelo e inmediatamente debajo de la misma fue colocada una caja de plástico con una toalla con el propósito de proteger a los animales de posibles golpes si caían de la barra. Cada ensayo tuvo una duración de 1 min y durante este tiempo se cuantificaron las siguientes variables: tiempo que demora la rata en alcanzar una de las dos plataformas de escape (latencia de escape, LE); fallo para alcanzar una de las plataformas hasta caer de la barra (latencia de caída, LC); número de errores cometidos por la rata durante la ejecución de la prueba (número de errores, NE).

Estudios morfológicos

El procesamiento histológico de los tejidos cerebrales fue llevado a cabo en el laboratorio de Biotecnología aplicada de la Universidad del Tolima, LABIOAUT. Para el análisis histológico, los animales se sacrificaron con sobredosis de Pentbarbital Sódico (Invet, Colombia) y se perfundieron por el método de gravedad utilizando 250 ml de solución salina 0,9 % y 250 ml de paraformaldehído al 4 % por cada animal; los cerebros fueron extraídos y post fijados en paraformaldehido (Sigma Aldrich, U.S.), al 4 %, y sometidos a un gradiente ascendente de sacarosa (Sigma Aldrich, U.S) (7 %, 25 % y 30 %) a 4 °C. Los tejidos extraídos secriopreservaron a -20°C hasta la realización de los cortes. Los cerebros fueron cortados en secciones coronales de 50 jm de grosor en un vibrátomo Leica VT 1000S (Leica Microsystems, U.S.), previo al corte, se realizó una marca en el hemisferio izquierdo (hemisferio intacto). Se escogieron cortes al nivel de -4,89 de bregma. El estudio de inmunofluorescencia se llevó a cabo al mes de producido el trasplante de MSCh-GFP+; y se evaluó la inmunoreactividad de Tirosina hidroxilasa (TH). Para el desarrollo de la inmunofluorescencia, las secciones coronales , fueron lavados tres veces con PB 0,1M por cinco minutos) y cloruro de amonio (N₄HCl) 50mM durante diez minutos, esto, para evitar la autofluorescencia del tejido, se lavaron los tejidos con PB 0,1 M tres veces por cinco minutos y se adicionó la solución de bloqueo 1 durante 20 minutos a 37 °C, posteriormente se incubaron los tejidos con el anticuerpo primario TH (Sigma Aldrich, U.S) (1:300) por 48 horas a 4 °C. Pasado este tiempo se lavaron los tejidos con PB 0,1M 3 veces por cinco min. Como anticuerpo secundario, fue usado el anticuerpo Goat anti-mouse IgG 594 (Thermo Fisher Scientific, U.S) (1:500) por dos horas a temperatura ambiente, luego los tejidos se lavaron con PB 0,1M cinco veces por cinco minutos y los cortes se organizaron en las placas con previamente tratadas con Poly-L-lisina (Thermo Fisher Scientific, U.S) (0,01 %) debidamente marcadas. Los cortes se fijaron con Fluoromount® para su posterior observación.

Procesamiento estadístico y análisis de los resultados

Los resultados se analizaron utilizando el software Statistica 10,1. Utilizando Anova no paramétrica (Kruskal wallis) y, debido a la normalidad Newman Keuls como análisis pos hoc. El número de células positivas a TH, Número de vueltas, Latencia de Escape, Latencia de Caída y Número de Errores fueron evaluados.

RESULTADOS

Rotación. Todos los animales lesionados mostraron actividad rotatoria inducida por apomorfina acorde con los criterios de inclusión. Un mes después del trasplante con MSCh, las ratas pertenecientes a este grupo experimental, mostraron una diferencia estadísticamente significativa en la conducta de rotación inducida por apomorfina (Fig. 1). El Wilcoxon matched pair test reveló una diferencia significativa entre el número de vueltas contralateral antes y después del trasplante, Z=2,803 (p < 0,01), lo que demostró que el trasplante fue capaz de producir una mejoría en la conducta de rotaciones inducida por la apomorfina en comparación con el grupo lesionado.

Test Neurológico. La respuesta de los grupos al test neurológico permitió valorar la influencia de la lesión en el estado neurológico de los animales pre y post tratamiento, mostrando un soporte valioso que valoró la influencia de la lesión y posteriormente el trasplante; a continuación se muestran las tablas de resultados de las pruebas desarrolladas a cada uno de los grupos.

Barra trasversal. La prueba de Anova para la comparación de grupos demostró una diferencia significativa para la variable latencia de escape (LE), F_{(2, 25gl)} = 7,45, p<0,003. El grupo control intacto tuvo un desempeño superior al grupo LES+T, p<0,002 y p<0,03 respectivamente. Mientras que la latencia de caída (LC), no reveló diferencia entre grupos, si se observó diferencia entre el número de errores (NE) en la realización de la prueba entre los diferentes grupos, F_{(2, 25gl)} = 2, p<0.001. Los animales controles intactos y trasplantados tuvieron un comportamiento similar, alejado del desarrollado por el grupo de animales lesionados (Figs 3a, 3b y 3c).

Comprobación del modelo de Hemiparkinsonismo. La lesión unilateral en el hemisferio derecho por inyección intracerebral de la neurotoxina 6-OHDA, produjo una pérdida drástica (p<0,001) de cuerpos celulares inmunoreactivos a la enzima TH alrededor del sitio de inyección de la (Fig. 4).

DISCUSIÓN

En el presente estudio, se evaluó el efecto del trasplante intraestriatal de Celulas Madre Mesenquimales humanas (hMSC en inglés) transfectadas con GFP sobre la conducta motríz de ratas con lesión neurotóxica unilateral por 6-OHDA unilateral en la sustancia negra evaluadas por una batería comportamental compuesta por Test neurológico, Pole Test y Barra Trasversal. Cabe resaltar que hMSC fueron transfectadas para estimar la posibilidad de diferenciación a distintos linajes celulares del sistema nervioso y a su vez valorar si a través de este mecanismo, se pudiera resarcir el daño causado a lo largo de la vía nigroestrital, sin embargo, dentro de los resultados celulares encontrados, las hMSC-GFP+ se diferenciaron a solo a neuronas (datos no mostrados), y que los resultados que aquí se muestran se refieren al efecto de este trasplante sobre la conducta motora inducida por la inyección intranigral de 6-OHDA. En este sentido, los animales lesionados presentaron una marcada asimetría motora demostrada en la batería de pruebas comportamentales realizadas, sin embargo, hubo una significativa mejoría en los animales que recibieron el trasplante y mediante análisis de inmunofluorescencia de la enzima tirosina hidroxilasa se observó una degeneración de las estructuras involucradas que cuando se analiza junto con los resultados comportamentales, está asociada a la disfunción motriz. Las rotaciones inducidas por apomorfina se utilizaron en este trabajo como predictoras de la efectividad de la lesión y el trasplante, puesto el comportamiento rotatorio inducido por apomorfina, es equivalente a la depleción DAérgica de más del 70 % en el lugar de la inyección. (Xion et al., 2010; Piennar et al., 2012). De acuerdo con el método de evaluación usado, la técnica de lesión empleada dió lugar a diferentes grados de pérdida de dopamina estriatal. El 100 % de los animales a los que se les inyectó la neurotoxina mostraron una conducta de giro que cumplía con los criterios de inclusión establecidos para este estudio (Fig. 1). La comprobación de lesión completa de la vía negroestriatal a través de las siete vueltas contralaterales al hemisferio lesionado, tras la inyección de apomorfina, está de acuerdo con lo propuesto por Pavón et al. (1998) y Blanco et al. (2010). Además, esta prueba también demostró que existe una mejoría en los animales experimentales después del trasplante al reducir el número de vueltas por minutos en contraste con los datos que se habían recogido antes de realizar el procedimiento Boronat-García et al. (2016) y por Piennar et al. (2012). Finalmente, al comprobar histológicamente la lesión, se observó que todos los animales seleccionados para incluirse en los grupos experimentales de trasplante, así como los controles lesionados, mostraron una extensa pérdida de neuronas dopaminérgicas en la SN (Fig. 4). Aunque el sistema nervioso central puede mitigar, al menos parcialmente, la pérdida neuronal en virtud de su plasticidad, las perturbaciones que sobrepasen ciertos límites tolerables ocasionan deficiencias funcionales irreversibles. Esta pérdida ocasiona una intensa disminución en la concentración de dopamina en las áreas de proyección estriatal (caudado y putamen) y se considera fundamental en la generación del defecto motor. Se observó además, una disminución significativa en la conducta de giro inducida por apomorfina, en animales del grupo LES-T, (Fig. 1), mostrando la eficacia del trasplante. Estos resultados están en línea con los de otros autores que afirman que el trasplante de células madre mesenquimales mejora los trastornos conductuales en los animales lesionados con 6-OHDA (Lescaudron et al., 2003; Pavon et al., 2004), además el trasplante de células madre mesenquimales reducen la gliosis producida por la lesion, posiblemente la inflamación y la neurodegeneración- en parte producida por la misma inflamación- también se ve negativamente influenciada, como lo menciona Hoban et al, 2015. Este hecho puede ser responsable, al menos en parte, de la recuperación motora vista en el grupo experimental después del trasplante. Por otro lado, la acción positiva del trasplante puede estar modulada también por la producción de diferentes factores neurotróficos por las células madre mesenquimales trasplantadas, que ejercen su acción sobre las células que están en vía de muerte y/o que circundan los tejidos lesionados (Xion et al., 2010; Levy et al., 2016).

Estos factores potencian la supervivencia de las neuronas, favorecen su diferenciación y funcionamiento e inducen a la formación de sinapsis. En la literatura se han publicado datos referentes a la producción por parte de la células madre mesenquimales de factores neurotróficos, tales como el BDNF (del inglés Brain Derive Neurotrophic Factor) (Levy et al., 2016); por tanto, este podría ser otro mecanismo a través del cual se pueda explicar cómo estas células revierten los efectos de la lesión producida por el 6-OHDA.

Para complementar la evaluación del estado sensoriomotor de los sujetos pre y post-trasplante, se desarrollaron dos tests más, el primero de ellos es el Pole test, que valora los trastornos del movimiento relacionados con los ganglios basales en ratas y ratones, aquí se observó una diferencia significativa entre los animales hemiparkinsonizados y los animales trasplantados en relación con los animales control (p=0,0442). Se conoce que la deficiencia dopaminérgica representa un obstáculo para la aplicación efectiva de la fuerza requerida para los movimientos coordinados de todo el cuerpo (Woodle et al., 2008). en donde se incluyen alteraciones en el procesamiento de la información táctil en la etapa temprana de la EP y deterioro propioceptivo además de daño en el control motor fino en EP, todos afectados directamente por la disfunción sensorial (Uylings et al., 2003) y en los modelos de hemiparkinsonismo (Gerstenberger et al., 2016). Los errores en el Pole test (ver Fig. 2 der) representan la calidad de la respuesta motríz evidenciada a través de la integración de los movimientos necesarios para la realización de una actividad cualquiera, desde la posición de la cabeza y la dirección de la mirada, hasta la simetría corporal y utilización de extremidades y de la cola (Matsura et al., 1997), actividad que merece su éxito a la coordinación funcional de los ganglios basales y la corteza motora que participan en la generación de los movimientos cuando se utiliza la retroacción para el control posicional. Los animales que recibieron terapia celular, mejoraron en este parámetro. Al evaluar los errores cometidos por los animales de los diferentes grupos para realizar el pole test, se observó que el grupo control fue el que desarrolló la prueba con mayor éxito (p =0,004), (= 0,86 SD±1,21) pues utilizó apropiadamente todas sus extremidades correctamente, incluyendo la cola como soporte para descender desde la cima del cilindro hasta la base del mismo, los animales hemiparkinsonizados por el contrario fueron los que presentaron mayor cantidad de errores (= 3,9 SD±0,32) debido a su incapacidad de corregirposición demostrando su asimetría corporal, en contraste, los animales trasplantados mostraron una mejoría significativa con respecto al grupo lesionado en la integración de los movimientos necesarios y uso de sus extremidades y cola para la realización de esta actividad, resultados similares a lo reportado por Garrido (2004). La segunda prueba usada fue la barra transversal que permite observar y comparar el compromiso motor en los sujetos experimentales evaluados.

CONCLUSIONES

Por medio de este estudio se demostró que el trasplante de células madre mesenquimales GFP+ puede disminuir el daño funcional y asimetría motora, característica del modelo experimental en ratas hemiparkinsonizadas. Los resultados comportamentales mostraron en todas sus pruebas que hubo una mejoría significativa en la habilidad para realizar actividad motora de los animales trasplantados con respecto a los hemiparkinsonizados, esto apunta a un mayor compromiso sensoriomotor en la ejecución de las pruebas que el grupo experimental obtuvo gracias al trasplante. Adicionalmente es posible que el lado "no lesionado", contralateral a la inyección de 6-OHDA, sea insuficiente para compensar la deficiencia motora cuando la lesión es de gran extensión.

AGRADECIMIENTOS

Este trabajo fue realizado con el apoyo de la Oficina Central de Investigaciones de la Universidad del Tolima.

CONFLICT OF INTEREST

The authors declare that they have no conflict of interest.

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