Filtrado de señales en espectrofotometría de absorción mediante wavelets invariantes a la traslación

Absorption spectrophotometry signal de-noising using invariant wavelets

Rubiel Vargas Cañas¹, Humberto Loaiza Correa²

¹ Ingeniero de Sistemas, Universidad Industrial de Santander. Especialista en Electrónica industrial, Universidad del Cauca. Magíster en Ingeniería con énfasis en electrónica, Universidad del Valle. Candidato a doctor en Ingeniería Biomédica, City University, Reino Unido. Afiliación actual, Universidad del Cauca. rubiel@unicauca.edu.co

² Ingeniero Electricista, Magister en Automática, Universidad del Valle. Doctor en Robótica, Universite D'evry Val D'essonne, Francia. Humberto.loaiza@correounivalle.edu.co

RESUMEN

Enfermedades como cáncer, hepatitis y sida, entre otras, ocasionan que la concentración y cantidad de algunas sustancias en fluidos corporales se modifique, por lo que su medición puede servir como técnica diagnóstica. Entre las técnicas más utilizadas para la detección y cuantificación de sustancias biológicas se encuentra la espectroscopía. El principal factor que limita la sensibilidad y calidad en la medida es la presencia de señales indeseadas, denominadas ruido. El ruido tiene diferentes orígenes, los cuales van desde los supuestos físicos hasta la influencia ambiental. Eliminar o reducir el ruido en espectroscopía ha sido objeto de estudio durante muchos años y en los últimos lustros se ha demostrado la aplicabilidad de la transformada wavelet con dicho propósito. Este trabajo presenta una transformada wavelet invariante a la traslación como una alternativa para aumentar la relación señal a ruido en señales provenientes de espectrofotómetros y por ende mejorar la calidad del análisis espectrofotométrico y la cuantificación de sustancias biológicas. La técnica propuesta se aplicó a señales generadas artificialmente y provenientes de dos espectrofotómetros, uno con fuente de radiación continua y otro con fuente de radiación láser. Los resultados obtenidos con esa técnica se compararon con los obtenidos a partir de filtros tradicionales: gaussianos, Wiener y wavelets ortogonales. Las principales ventajas derivadas de la aplicación de esta técnica son: un sustancial aumento de la relación señal a ruido y la preservación de la ubicación y el ancho de los picos espectrales. Estas ventajas incrementan la calidad y veracidad en el proceso de detección y cuantificación de sustancias biológicas y posibilitan un análisis automático del espectro. Además, conducirán a comprender las limitaciones experimentales y permitirán un estudio cuantitativo sobre la influencia de los cambios en la concentración de una sustancia determinada en enfermedades relacionadas.

Palabras clave: espectrofotometría de absorción, filtrado de señales, wavelets invariantes a la traslación, detección de sustancias biológicas.

ABSTRACT

Keywords: absorption spectrophotometry, signal filtering, invariant wavelet, biological substance detection.

Recibido: mayo 20 de 2010 Aceptado: noviembre 24 de 2011

Introducción

Existen diferentes maneras de detectar y cuantificar sustancias biológicas y especies químicas. Dentro de estas técnicas la espectroscopía es especialmente atractiva dado que es altamente sensible, muy rápida, robusta, extensible y su complejidad en la implementación es media. En espectrofotometría de absorción la ley de Bourguer-Lamber-Beer, o ley general de la espectrofotometría, brinda los fundamentos físico-matemáticos para encontrar la concentración de una sustancia a partir de la medida de absorción de esta (Valea y Girón, 1998). Esto es, si se conoce la potencia media radiante que incide sobre una muestra y la potencia transmitida, se puede calcular la cantidad de luz absorbida, la cual se expresa como:

Esta proporción representa la relación de la radiación con una muestra de concentración c en un camino óptico b dado en centímetros, donde A es la absorbancia y a es el coeficiente de absortividad (o de extinción) dado en litros por gramocentímetro. La ecuación 1 está definida para un haz de radiación monocromático y paralelo y suele también escribirse como:

donde T es la transmitancia y expresa la razón entre la intensidad incidente y la transmitida (Valea Pérez y Giron, 1998) según la ecuación 3.

En espectroscopía es muy importante remover o disminuir los niveles de ruido con el fin de obtener datos con mayor veracidad, permitir el análisis automático del espectro y comprender algunas limitaciones experimentales (Werner y Kjell-Arild, 2005). Una alternativa para disminuir las desviaciones instrumentales y por ende aumentar la calidad en la medición es la de procesar digitalmente las señales entregadas por el equipo de medición. La energía radiante es transformada en señal eléctrica, digitaliza-da en algunos casos, filtrada, amplificada, compensada, manipulada matemáticamente y, finalmente, presentada como absorbancia o transmitancia en una escala de medida digital en una pantalla o un medidor. Los métodos tradicionales están basados en: absorción diferencial, filtros digitales (gaussianos o Wiener), y recientemente wavelets ortogonales (Schuck et al., 2010).

En este trabajo se presenta una propuesta para eliminar o minimizar las señales espúreas o de fondo contenidas en una señal de luz proveniente de un espectrofotómetro utilizado para cuantificar la concentración de sustancias biológicas. El propósito final es el de mejorar la relación señal a ruido, aumentar la sensibilidad del instrumento, mejorar el tiempo de medida e incrementar el rango de precisión en la medición. Para esto se hace uso de la transformada wavelet invariante a traslaciones y la evaluación de la técnica se aplica a señales creadas artificialmente y a las provenientes de espectrofotómetros con fuentes de luz continua y láser, luego se cuantifica la relación señal a ruido.

En la sección 2 se presentan los fundamentos básicos del filtrado de señales y los tipos de filtros más utilizados con este propósito. En la sección 3 se describe de manera general la técnica propuesta y el procedimiento seguido en su implementación. Los resultados obtenidos a partir de señales simuladas y reales provenientes de espectrofotómetros de radiación visible con fuente de luz continua y láser se exponen en la sección 4. Las conclusiones son presentadas en la sección 5 y, finalmente, en la sección 6, se suministran las referencias a documentos utilizados como soporte del trabajo descrito.

Filtrado de las señales espectroscópicas

Motivación

El principal factor limitante en la precisión y sensibilidad de cualquier método analítico instrumental es la presencia de señales no deseadas que se sobreponen a la señal generada por la sustancia que se desea analizar (Werner y Kjell-Arild, 2005). En la mayoría de los casos este tipo de señales son inevitables y deterioran la calidad del análisis o degenera en errores en el análisis de resultados si la información útil no puede ser extraída de manera efectiva. El análisis de espectros está basado en la variación de los datos, específicamente ubicación, intensidad y ancho de los picos; por lo tanto, es sensitivo al ruido, incluso en pequeñas cantidades. Por lo tanto, es evidente la necesidad de aplicar una metodología que remueva las señales adicionales manteniendo los detalles de las características de la señal original, dado que incluso las más pequeñas variaciones pueden estar relacionadas con atributos biofísicos de la sustancia de estudio. A esta metodología se la conoce como filtrado y consiste en la eliminación o atenuación del ruido mediante arreglos electrónicos o digitales.

Generalmente las señales se ven afectadas por dos tipos de ruido: aleatorio y periódico (Oppemheim y Willsky, 1998; Van V. y Haykin, 2002). El ruido aleatorio presenta un comportamiento que se puede caracterizar a partir de la función de densidad de probabilidad, mientras que los parámetros del ruido periódico típicamente son estimados por inspección del espectro de la señal porque producen picos en el dominio de la frecuencia. Los parámetros del ruido periódico también pueden estimarse con el conocimiento previo sobre la ubicación de los componentes frecuenciales de la interferencia o de las especificaciones del sensor (Oppemheim y Willsky, 1998). Algunas de las técnicas tradicionales, tales como filtros gaussianos y Wiener explotan el conocimiento previo de los parámetros que caracterizan el ruido, específicamente la media y la varianza, para llevar a buen término su cometido.

Principales técnicas

La técnica más utilizada para suprimir el ruido en espectrofotometría de absorción es la de absorción diferencial (Barnard, 2009), la cual consiste en dividir la señal de luz en una de prueba y una de referencia; esta técnica asume que el ruido afecta por igual las dos señales; luego, al restar o dividir las dos señales, se elimina el exceso de ruido. En la práctica esta suposición no siempre es correcta y por ende la implementación de un restador o divisor no provee los resultados esperados. Por otra parte, el método más común para incrementar la relación señal a ruido en espectrofotometría láser de absorción es cortar - "chopear"- el láser y amplificar la corriente en el detector con un amplificador look-in. Esta técnica presenta algunas fallas debido a la frecuencia del chopper, o cuando la señal de fondo es de baja frecuencia. Otra aproximación consiste en modular en frecuencia la señal y promediar un conjunto de barridos espectrales (Hong et al., 2009). Esta técnica provee muy buenos resultados pero su implementación requiere de un diseño óptico-electrónico muy sofisticado.

Cada técnica posee ventajas y desventajas, y el precio a pagar por la eliminación del ruido es la distorsión en parte de la señal original. Por ejemplo, los filtros Notch no trasladan los picos en tiempo porque tienen una respuesta en fase nula. Sin embargo, la respuesta al impulso no es lo suficientemente corta, lo que degenera en un ensanchamiento de los picos espectrales (Werner y Kjell-Arild, 2005). De acuerdo con la literatura revisada, existe tendencia a utilizar filtros wavelets (Arizmendi et al., 2010; García y Ramírez, 2007; Posú y Landrove, 2008; Werner y Kjell-Arild, 2005) en el filtrado de señales espectroscópicas dado que ellos preservan las características de los picos. A continuación se presenta un resumen de algunos trabajos relevantes en este campo.

Espectroscopia de resonancia magnética y magnética nuclear. Cancino-De-Greiff et al. (2002) analizan, por medio de simulaciones, la potencialidad de wavelet Shrinkage en el filtrado del ruido en espectroscopía de resonancia magnética. En su trabajo también posibilitan la combinación con el algoritmo de Cadzow. Por su parte, Posú y Landrove (2008) presentan una metodología para el procesamiento de los datos obtenidos por espectroscopía de resonancia magnética en la elaboración de mapas metabólicos. Luego de obtener el espectro de potencias este es filtrado con la finalidad de eliminar ruido haciendo uso de wavelets de Haar y su línea base es aproximada mediante un polinomio de tercer orden. Trbovica et al. (2005) aplican una serie de filtros a datos obtenidos experimentalmente de un proceso de espectroscopía magnética nuclear con el propósito de optimizar la eficiencia computacional y minimizar el peso de pequeñas traslaciones químicas. Los mejores resultados fueron obtenidos cuando se aplicaron análisis de componentes principales a los coeficientes de la wavelet.

Espectroscopía de absorción. García y Ramírez (2007) emplearon redes neuronales wavelet en tareas de reducción de ruido en espectros estelares. Para su validación simularon espectros estelares y descubrieron que el resultado obtenido con la red neuro-nal wavelet es aproximadamente igual a la salida deseada, es decir, al espectro estelar sin ruido. Xiaoguo y Dahai (2009) describieron un método de determinación espectrofotométrica simultánea para cobre, zinc, níquel y cobalto en agua. El espectro de absorbancia fue procesado con la transformada wavelet con la finalidad de remover interferencias.

Espectroscopía infrarroja. Zhu et al. (2007) investigaron la influencia de la forma de la wavelet, el número de niveles utilizados y el tipo de umbralización en el filtrado de señales provenientes de un espectroscopio de infrarrojo cercano. Los mejores resultados fueron obtenidos con una wavelet bior3.3, dos niveles de descomposición y umbralización suave. Berry y Ozaki (2002) compararon el filtrado de ruido en espectroscopía infrarroja utilizando difusión, reconstrucción por vectores propios y wavelets, demostrando que el uso de wavelets es mejor que las otras técnicas mencionadas. Zhan et al. (2004), por su parte, aplicaron wavelet al análisis y filtrado del ruido en espectroscopía de correlación infrarroja de medicina tradicional china. Esta técnica les permitió separar picos espectrales que se encontraban sobrepuestos antes del análisis.

Espectroscopía Raman y Terahertz. Gao et al. (2004) discutieron el filtrado de ruido en espectroscopía Raman haciendo uso de una wavelet de Haar estacionaria. La varianza del ruido es estimada para cada nivel wavelet y se utiliza un umbral fijo equivalente a la raíz cuadrada de dos veces el logaritmo natural del número de muestras presentes en la señal. Li-Yinglang y Na Cai (2009) presentaron una wavelet con forma de sombrero mexicano aplicado al análisis de datos de espectroscopía Terahertz en el dominio del tiempo. Los resultados de las simulaciones mostraron su habilidad para remover ruido en señales de baja y alta frecuencia.

Procedimiento

Wavelets

La teoría de wavelets es una rama de las matemáticas cuyo estudio se centra en la construcción de un modelo de sistemas o procesos utilizando un tipo especial de señales conocidas como wavelets. Una wavelet es una onda de duración efectiva limitada que tiene un valor promedio cero y puede representar una señal en términos de versiones trasladadas y dilatadas de dicha onda (Rioul O. y Vetterli M., 1991; Cuesta F. D. et al., 2000). Las wavelets son familias de funciones del tipo:

where a and b are the expansion and translation parameters, respectively. The wavelet transform of a signal is then given by:

Esta técnica matemática ha cobrado gran importancia en los últimos años en aplicaciones de todo tipo relacionadas con el procesado de señales no estacionarias. Su análisis consiste en descomponer una señal en versiones escaladas móviles de la wavelet original ("madre"). Esta descomposición permite observar una correspondencia entre la escala de las wavelets y la frecuencia, por tanto están relacionadas con el análisis armónico de la señal. Las gráficas de los coeficientes de la transformada wavelet son precisamente una representación tiempo-escala, mucho más natural, de la señal. Dicha representación muestra patrones que antes no eran visibles y preserva el aspecto temporal de la señal. La más grande ventaja es su habilidad para realizar análisis local, es decir, analizar un área específica de una señal más grande no estacionaria y de rápida transitoriedad.

El proceso se realiza en dos etapas: análisis y reconstrucción. El análisis de wavelets involucra filtraje y submuestreo, mientras que la reconstrucción involucra sobremuestreo (upsampling) y filtraje. Para hacer su cálculo rápidamente se fija el parámetro de dilatación ^{a=2 j}con jεZ, denominándola en este caso wavelet diádica (Cuesta F. D. et al., 2000), y se utiliza un algoritmo rápido similar al de la FFT para su cálculo computacional.

Filtrado de señales utilizando wavelets

El efecto de la transformada wavelet es el de filtrar la señal mediante filtros de dos tipos: pasa altas, que preservan los detalles; y pasa bajas, que realizan una aproximación de la señal. La elección de los filtros determina la forma de la wavelet a usar para hacer una mejor reconstrucción. La ventaja de este procedimiento respecto de un filtrado por bandas de frecuencia reside en que se obtiene una señal casi libre de ruido, con pequeñas modificaciones de las características de la señal (presencia de picos de alta frecuencia, etcétera). Su resultado es diferente al obtenido con los métodos tradicionales de suavizado, los cuales consiguen eliminar el ruido a costa de suavizar o distorsionar también algunos de los componentes de la señal (Rioul O. y Vetterli M., 1991).

En primer lugar, para la reducción del ruido blanco gaussiano se considera la señal adquirida como:

donde x_nes la señal sin ruido,   representa ruido blanco gaussiano con media nula y varianza unitaria, n es su nivel y Sn la línea base aproximada por componentes de bajas frecuencias.

Las diferencias más significativas entre la mayoría de métodos propuestos en trabajos relacionados con esta aplicación radican en el tipo de umbral utilizado o el peso ponderado dado a los coeficientes (Cuesta F. D. et al., 2000). La especificación del umbral depende de la aplicación y la calidad de los datos. Ling y Ren (2008) combinaron análisis de componentes principales y wavelets en el análisis de señales espectrofotométricas traslapadas y propusieron un método basado en optimización para seleccionar el nivel de umbralización. Gao et al. (2004b) discutieron un método basado en el principio de maximización de la entropía. Este método demostró buena selectividad en señales simuladas y su desempeño fue menos sensitivo a los cambios en la relación señal a ruido. Gao et al. (2004) utilizaron un umbral fijo equivalente a la raíz cuadrada de dos veces el logaritmo natural del número de muestras presentes en la señal.

Invariancia a la traslación

La invariancia a la translación de un operador L significa que si la entrada es trasladada por   entonces la salida también es trasladada por el mismo factor:

Wavelet continua: Sea   una traslación de   por   . La transformada wavelet puede ser escrita como una convolución:

con . Es, por lo tanto, invariante a la La traslación:

Wavelet discreta: Reescribiendo (5) como:

La tralacióm ^u es muestrada uniformente a intervalos proporcionales a la   así:

Este muestreo destruye la invariancia a la traslación.

dando   por   se llega a que:

Si el intervalo de muestreo es relativamente grande, entonces los coeficientes   y   pueden tomar diferentes valores que no están trasladados uno respecto del otro. Por esto es muy bien sabido que la transformada wavelet ortogonal es variante a la traslación (García y Ramírez, 2007; Cuesta et al., 2000), lo cual significa que la transformada de una señal desplazada es diferente a la transformada desplazada de la señal original.

La transformada wavelet mantiene la invariancia a la traslación muestreando únicamente la escala de una transformada wavelet continua. Sin embargo, existen otras estrategias para mantener la invariancia a la traslación, siendo una de ellas la de mantener el intervalo de muestreo lo suficientemente pequeño, entonces las muestras de   serán aproximadamente trasladadas cuando   sea trasladada. Otra alternativa es aproximar la señal mediante traslaciones cíclicas (Rioul y Vetterli, 1991) y promediando los resultados. En otras palabras, desplazar la señal ¿ muestras, y las ¿ muestras al final de la señal son trasladadas al comienzo, por esto se le conoce como cíclico. La idea es obtener una mejor estimación de la señal promediando estimaciones dadas por cada desplazamiento que se realice. En total se pueden hacer N-1 desplazamientos, para lo cual se necesitarían O (N²) operaciones.

Otra manera consiste en implementar la transformación sin realizar el submuestreo, esto es equivalente a descomponer la señal en una familia de N*(j + 1) coeficientes redundantes, donde N es la duración de la señal y j el número de escalas. Sea  ^(t) señal continua caracterizada por ^N muestras a distancia ^N-1.

para cualquier ^j≥0

con

Los coeficientes de la transformada diádica para  ^j>0 están dados por,

así:

Así que la representación de   se puede calcular con una cascada de convoluciones de complejidad computacional   equivalente a la complejidad de la transformada rápida de Fourier. Por esto el método descrito es conocido como transformada wavelet discreta rápida (Mallat, 2009).

Resultados y discusión

Para evaluar el desempeño de la técnica propuesta se generó una señal artificial con diferentes componentes temporales y frecuenciales. Esta señal se distorsionó agregando una señal con densidad de probabilidad de tipo gaussiano con media nula y varianza unitaria, como se puede apreciar en la figura 1.

A esta señal se le aplicaron los filtros gaussiano, Wiener y wavelet ortogonal (Haar) usando umbral fijo. Los resultados obtenidos con los diversos filtros se ilustran en la figura 2.

Como se puede apreciar en la figura 2, la mejor relación señal a ruido es obtenida con el filtro Wiener. Además se observa que el resultado obtenido con la wavelet presenta mejores resultados que el filtro gaussiano, el cual fue implementado utilizando la transformada de Fourier con una ventana de ancho igual a 4, la cual aproxima la varianza unitaria. Un análisis más detallado de esta figura revela que en los resultados alcanzados con el filtro gaussiano los picos afilados aparecen ligeramente trasladados a la izquierda, mientras que Wiener y wavelet preservan su ubicación. En cuanto a la apariencia de la señal, la recuperada a partir de la wavelet es más suave; entre tanto, la que aparece con mayor variación es la obtenida con el filtro Wiener.

La señal de la figura 1 también fue filtrada con una wavelet cíclica invariante a la traslación. La umbralización utilizada fue umbral fijo y el número de escalas 4.

La figura 3 muestra el resultado de filtrar la señal presentada en la figura 1 con una wavelet invariante aplicando el método descrito. Este resultado de la relación señal a ruido supera el obtenido con el filtro Wiener y la apariencia de la señal es mejor a la obtenida con la wavelet ortogonal. También se puede observar que los picos conservan su ubicación original. Para su filtrado se utilizó umbral fijo equivalente a 3σ, el cual provee excelentes resultados en el filtrado de ruido gaussiano (Mallat, 2009).

La tabla 1 muestra un resumen de los resultados obtenidos a partir de la señal simulada y las diferentes alternativas de filtrado. En la columna de la izquierda aparece el método empleado; en la siguiente columna, la relación señal a ruido de la señal filtrada y, finalmente, la columna de la derecha describe la apariencia de la señal filtrada.

Conclusiones

Se presentó y demostró en este trabajo la aplicabilidad de las transformada wavelet invariante a la traslación en el filtrado de señales de luz provenientes de espectrofotómetros. Esta técnica maximiza la relación señal a ruido en comparación con los filtros gaussiano, Wiener y wavelet ortogonal con umbral fijo, lo cual permitirá y conducirá a mejorar la calidad de los resultados en las mediciones realizadas con el espectrofotómetro.

El espectro de una sustancia es como su huella dactilar, por eso preservar la ubicación, el alto y el ancho de los picos espectrales, es de suma importancia. En análisis espectrofotométrico, inevitablemente, los espectros están afectados por ruido. Las técnicas de filtrado muestran ventajas y desventajas en la remoción de este; sin embargo, una mirada de cerca a los resultados obtenidos con wavelets revelan un desempeño superior en el filtrado de señales provenientes de espectrofotómetros dado que preservan las características de los picos espectrales de la señal original.

Aunque la relación señal a ruido no difiere mucho entre los resultados obtenidos con el filtro gaussiano y wavelet ortogonal, esta última es preferida por su mayor relación señal a ruido, en comparación con el filtro gaussiano, especialmente porque no modifica la ubicación de las singularidades de la señal original, lo que hace atractivas las wavelets en el campo de la espectrofotometría.

El filtrado con wavelets invariantes a la traslación presenta la mayor relación señal a ruido y su implementación por medio de la transformada wavelet discreta rápida requiere O(Nlog2(N)) operaciones, lo que la hace más atractiva que la wavelet de giro cíclico, la cual demanda O(N2) operaciones. La complejidad computacional de la transformada wavelet invariante rápida es comparable con la transformada rápida de Fourier.

Las ventajas derivadas de la aplicación de esta técnica en espectrofotometría conducirán a un análisis automatizado del espectro, permitirán comprender las limitaciones experimentales de la técnica y llevarán a un estudio cuantitativo de la variación de la concentración de sustancias biológicas en enfermedades relacionadas. Así, el trabajo futuro se enfocará en dos direcciones: analizar la relación señal a ruido en barridos espectrales más amplios y cuantificar la concentración de sustancias presentes en las muestras.

Agradecimientos

Rubiel Vargas agradece a la Universidad del Cauca por el apoyo durante la ejecución de este trabajo.

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