Analysis of the production of biobutanol in the acetobutilyc fermentation with clostridium saccharoperbutylacetonicum N1-4 ATCC13564

Juan Jacobo Jaramillo Obando, Carlos Ariel Cardona^*

Departamento de Ingeniería Química, Plantas Piloto de Biotecnología y Agroindustria. Universidad Nacional de Colombia Sede Manizales. Carrera 27 N.° 64-60

Resumen

Se estudiaron las condiciones y características de la producción de biobutanol en la fermentación ABE. Se usó un modelo cinético de crecimiento celular estructurado siguiendo la vía metabòlica propuesta por Embden-Meyerhof- Parnas (EMP) para el Clostridium saccharoperbutylacetonicum N1-4 ATCC13564 en un esquema de reacción de flujo continuo y tanque agitado. Se realizó un análisis de sensibilidad y una optimización con base en las variables de decisión de productividad de butanol, rendimiento de glucosa a butanol y conversión global de glucosa para diferentes concentraciones de alimentación y tasa de dilución resultando en valores de productividad de 27,46 mM h^-1, rendimiento de 0,65 mmol de butanol por mmol de glucosa y conversión de 95,38% finales a una concentración de alimentación óptima de 295 mM y tasa de dilución final de 0,15 h^-1.

Palabras clave: Biobutanol, fermentación ABE, Embden- Meyerhof-Parnas (EMP), Clostridium saccharoperbutylacetonicum N1-4 ATCC13564.

Abstract

The conditions and characteristics of biobutanol production in ABE fermentation were studied. A cell growth kinetic model structured according to the proposed metabolic pathway Embden-Meyerhof-Parnas (EMP) pathway for the Clostridium Saccharoperbutylacetonicum N1-4 ATCC13564 reaction scheme was used in a continuous flow stirred tank. A sensitivity analysis and optimization based on the decision variables butanol productivity, glucose to butanol yield and glucose global conversion for different feed concentrations and dilution rate were performance. Productivity values of 27,46 mM h^-1, yield of 0,65 mmol of butanol per mmol of glucose and final conversion of 95,38% at optimal food concentration of 295 mM and optimal final dilution rate of 0,15 h^-1 were obtained.

Introducción

Diversos procesos microbianos fueron desarro­llados, antes de la Primera Guerra Mundial. Uno de los pioneros de aquel momento fue Chaim Weizmann, quién realizó una importantísima investigación sobre la producción de acetona utili­zada en explosivos, butanol y etanol a través de la fermentación llevada a cabo por la bacteria Clostridium acetobutylicum, denominada luego como la fermentación ABE.

La fermentación ABE (producción biotecnológica de Acetona, Butanol y Etanol) fue utilizada por numerosos países hasta los años 50, momento en que los procesos basados en petróleo reemplazaron a aquellos de fermentación por microorganismos. Las plantas con fermentadores fueron cerradas. Pero en 1973, la crisis del petróleo renovó el interés en la investigación, desarrollo e implantación de los procesos de fermentación.

Gracias a los avances relacionados al genoma del Clostridium acetobutylicum, sumado al abaratamiento de los sustratos utilizados, y con el desarrollo de nuevas técnicas que mejoran el rendimiento, renació el interés por la fermentación ABE en los últimos años acentuada a la producción de butanol.

Este compuesto al ser utilizado como combustible (en forma de mezclas) es llamado "biobutanol" esto con el fin de remarcar su origen vegetal, puesto que el butanol puede producirse también a partir de combustibles fósiles, con las mismas propiedades químicas.
]]> Expertos de diferentes empresas del sector quí­mico como BP y DuPont [1] destacan las venta­jas del butanol como carburante con respecto al etanol:

• Alcanza el 95% de energía que el mismo volumen de gasolina, mientras que el etanol no pasa del 75%.

• Se puede mezclar con la gasolina convencional, sin tener que hacer adaptaciones en los automóviles, en una proporción mayor que el etanol.

• Tolera mejor la contaminación por agua, es menos corrosivo y tiene una menor presión de vapor que el etanol, por lo que se puede mezclar directamente con la gasolina en la refinería y enviarlo por las mismas infraestructuras petroleras de transporte, algo que no es posible con el etanol.

• El proceso fermentativo ABE es completamente anaerobio, por lo tanto no es necesario mantener una oxigenación constante y uniforme en todo el mosto.
]]> • No requiere sacarificación del almidón debido a que el Clostridium acetobutylicum posee y produce las enzimas necesarias para la sacarificación del almidón, con lo cual se ahorra este proceso previo. [1,2]

Después de analizar y simular el proceso de fermentación ABE con el uso de expresiones cinéticas basados en el modelo estructurado propuesto por Embden-Meyerhof-Parnas (EMP) [3] se estudió la forma de aumentar la productividad de butanol, el rendimiento de glucosa a butanol y la conversión global de glucosa en la fermentación ABE. Se analizaron procesos continuos y discontinuos con diferentes arreglos de biorreactor identificando los rendimientos y productividades en cada uno, esto con el fin de proponer una opción tecnológica eficiente para la fermentación ABE.

Fundamento teórico

La tecnología y aplicación de la fermentación ABE para la producción de biobutanol como el combustible del futuro presenta en la actualidad gran desarrollo y objeto de investigación alrededor del mundo. La DuPont y British Petroleum que han presentado sus desarrollos para producir butanol conjuntamente con la British Sugar anunciaron que van construir la 1^a planta de producción de butanol en Norfolk - Inglaterra, la cual tendrá un costo de US$ 46 millones. En este caso, la materia prima será preferentemente remolacha azucarera, aunque también puede obtenerse de maíz, caña de azúcar o cualquier producto rico en azúcar o almidón. En la figura 1 por ejemplo, podemos ver un esquema de un bioproceso para la elaboración de acetona, butanol y etanol en la antigua URSS [4] en el cual la producción es de alrededor de 70000 ton/año de solventes, seguido por una producción secundaria de vitaminas y proteína de levadura. Es interesante observar las posibilidades que brinda el sector agroindustrial y sus residuos a los bioprocesos, y a su vez, el tratamiento de estos para aprovecharlos al máximo en subproductos de alto valor agregado y que tienen un bajo impacto ambiental y residual.

Sin embargo, la fermentación ABE cuenta con desventajas económicas, que son asociadas fundamentalmente a la estequiometria y a la primera ley de la termodinámica, es decir, que el balance de materia y energía durante el proceso fermentativo nunca se va a satisfacer, esto debido a las necesidades de mantenimiento celular y factores de tipo metabólico en el proceso. Para el caso específico de la fermentación ABE, existen ciertas inquietudes en cuanto al desempeño económico del proceso. [5] El rendimiento máximo de la fermentación ABE varía según el microorganismo utilizado, pero se ha llegado a valores de alrededor de Y_PG^max = 37% (se refiere al rendimiento de butanol con respecto al sustrato glucosa).

Aspectos económicos de la fermentación ABE

Las proyecciones hechas por las multinacionales BP y DUPONT para el biobutanol al 2010 indican que este combustible va a ser más caro que los combustibles convencionales mientras entra en el mercado, se desarrollan la tecnología y se montan las plantas de producción masiva. Al respecto, se ha estimado un coste de producción de alrededor 2-3 Euros/Kg [5]. Es clave analizar los costos de inversión para una planta Discontinua y una planta en Continuo (Fig. 2). Si se compara ambas instalaciones, los costos directos son más representativos en el caso continuo debido al grado de equipamiento y especialización de los mismos y representa un 83% del total de inversión de capital. En el proceso Discontinuo este ítem representa tan solo el 60% de la inversión capital, siendo representativos los costos indirectos, (30 % del total), en tanto que este tipo de costos para el proceso en continuo solo es un 7% del costo total de la inversión. La inversión de capital total es mucho mayor en el proceso continuo, pero a una mayor tasa de producción anual, lo cual, puede representar una tasa de retorno rápida en alrededor de 5 a 10 años.

Microorganismos para la fermentación Abe

El microorganismo más estudiado y alterado genéticamente para la producción de acetona, butanol y etanol es el Clostridium acetobutylicum. Las bacterias del genero Clostridium son bacterias Gram positivas, formadoras de endosporas, anaerobias estrictas y entre su gama se encuentran tanto microorganismos patógenos (Clostridium perfringens, Clostridium tetani, Clostridium botulinum) y no-patógenos. Las bacterias del genero Clostridium son fermentadoras pro excelencia, dependiendo del sustrato, la vía metabólica y la cepa, sintetizan variedad de ácidos orgánicos, grasos y solventes.

Sin embargo, el Clostridium acetobutylicum es el microorganismo que resulta más especializado en la producción de solventes, y en este caso, muestra una gran producción de butanol vía metabólica. Los estudios sobre este microorganismo han llevado a descubrir variedades del mismo género y a alterarlo genéticamente para aumentar el rendimiento hacia el metabolito principal de la fermentación ABE [6,7]. Entre los Clostridium involucrados en la fermentación ABE se citan:

Vía metabólica de la fermentación Abe

La ruta metabólica para la producción de acetona- butanol-etanol [3] (Fig. 3) comprende 2 fases distintas pero características de la fermentación, que son nombradas comúnmente como fases de Acidogénesis y Solventogénesis. La primera fase comprende la formación de ácido Acético y Butírico con ATP durante el crecimiento exponencial de las células. A este le sigue una fase de crecimiento estacionario, donde la Solventogénesis toma lugar, los ácidos son reasimilados, y acetona-butanol- etanol aparecen como metabolitos secundarios. Se ha demostrado experimentalmente [8] que se puede acelerar la producción de butanol mediante la alimentación de una cantidad de acido butírico al medio reaccionante.

Las enzimas involucradas se abrevian como PTA: Fosfotransacetilasa; AK: Acetatokinasa; CoAT: CoA transferasa; PTB: Fosfotransbutirilasa; BK: Butirato kinasa; BADH: Butiraldehido deshidrogenada; BDH: Butanol Deshidrogenada

Modelación y discusión

Con base en el modelo estudiado [3], se resolvieron los balances para un CSTBR y se obtuvieron los perfiles de concentración y rendimiento en función del tiempo de residencia en estado estable (Figura 4 y 5). Posteriormente se realizó la optimización de las variables de decisión como productividad de butanol, rendimiento de glucosa a butanol y conversión de glucosa en estado transitorio. Todo esto con el fin de tratar de solventar los problemas de convergencia debido a la alta no linealidad del modelo y los múltiples estados estables que podrían presentarse. El modelo cinético y matemático se observa a continuación:

Modelo cinético

Contempla las velocidades de reacción que se dan en el modelo estructurado de la vía metabólica reportada en la figura 3 y cuyos parámetros se reportan en el estudio de Hideki Shinto, et al. [3]. Así:

Modelo matemático

Se propone un balance completo de masa en estado transitorio considerando las simplificaciones pertinentes para el biorreactor discontinua y CSTBR. En el caso del biorreactor CSTBR se desarrolló el modelo en estado estable para reproducir los perfiles de concentración de cada metabolito y rendimiento, en tanto que se simulo el modelo en estado transitorio para el análisis de sensibilidad y optimización para las variables mencionadas. Los balances generales para cada metabolito son:

Dichos balances alrededor del biorreactor se generalizaron para n reactores según la ecuación (36) en donde el subíndice i indica la salida de cada biorreactor y j la reacción involucrada. Cuando i es igual a cero, se toma como condición de alimentación. Los términos entre corchetes indican la concentración del metabolito en mM y D es la tasa de dilución en h^-1.

En la figura 3 los valores finales de concentración de butanol son alrededor de 78 mM a un tiempo de residencia de 600 h, tiempo a partir del cual, la concentración de butanol no cambia de manera apreciable y se puede considerar en un valor promedio constante. De forma similar se comporta el sustrato o glucosa, agotándose hasta un valor 2,5 mM Este valor es muy importante ya que se encuentra por encima del valor contemplado para el agotamiento energético (menor o igual a 1 mM)) por ende el mecanismo de muerte celular en el modelo nunca se hace efectivo, aspecto que en el esquema Discontinuo es una limitante. Esta primera aproximación lleva a examinar la viabilidad de implantar un esquema de reacción en serie para aumentar la productividad y el rendimiento de glucosa a butanol que para el caso de un solo CSTBR es de alrededor de 1,16 mmol de butanol por mmol de glucosa. Es de anotar que los tiempos de residencia son muy altos y afectaran económicamente el proceso, más aun cuando se habla de la producción de biobutanol como un combustible emergente.

Análisis de sensibilidad y optimización

Para realizar el análisis de sensibilidad en el diseño del bioreactor se escogieron 3 concentraciones de alimentaciones de sustrato válidas y representativas en el intervalo apto del modelo cinético escogido [3] de forma tal que se observe su comportamiento y respectiva respuesta al momento de optimizar las variables escogidas. Las concentraciones de alimentación contempladas fueron de 70,6, 122 y 295 mM dado a que se pueden corroborar experimentalmente acorde a la referencia [3]. Los resultados obtenidos se observan en la figura 6, y figura 7.

Como se puede observar en la figura 6 el intervalo de tasa de dilución contemplado revela para los 3 casos de concentración de alimentación de sustrato, el régimen de lavado, el cual se incrementa conforme disminuye dicha concentración de glucosa alimentada. A su vez, es claro que aumentar la concentración de alimentación, aumenta la concentración de butanol al final de la fermentación, pero también, aumenta la cantidad de glucosa residual. Ahora, si se observa la figura 7 y tomando como variable de decisión la productividad maximizada, vemos que a medida que aumentamos la cantidad de sustrato alimentado, aumenta también la productividad, pero disminuye la conversión de glucosa a rendimientos muy parecidos para cada caso. Una visualización más completa de la situación contemplada lleva a ver el comportamiento de la productividad con respecto a la tasa de dilución y las concentraciones de alimentación con el fin de solventar el problema del tiempo de residencia tan alto hallado anteriormente. En la , se puede apreciar dicha situación de forma clara, en donde la productividad llega a un valor máximo de alrededor de 5 mM h^-1 a altas concentraciones de alimentación de sustrato y tasas de dilución óptimas de 0,1 a 0,15 h^-1. Los rendimientos llegan a valores máximos de alrededor de 0,75 mM para cualquier caso de concentración de alimentación y la conversión claramente demuestra ser grande de casi 95% a valores de concentración de sustrato pequeños, aumentando conforme disminuye la tasa de dilución, que representaría un volumen de reactor grande.

El siguiente paso a realizar para tomar una decisión sobre la concentración de alimentación óptima para diseñar sobre ella y optimizar la tasa de dilución a un máximo de productividad, conversión alta y rendimiento grande es contemplar todos los máximos locales de la figura 8 y encontrar el máximo global o el valor más representativo de productividad de butanol. En la figura 9 se observa que los óptimos de productividad aumentan conforme se aumenta la concentración de sustrato alimentada continuamente, de ahí que tomando como criterio aumentar la productividad de butanol, se toma como ideal la concentración de alimentación de 295 mM de glucosa.

Es de anotar además, que hay un equilibrio y una barrera natural a vencer en este montaje, debido a que en el primer CSTBR hay una baja conversión, lo que indica una gran cantidad de glucosa residual que inhibe al microorganismo por sustrato, y a medida que aumentamos dicha conversión, la inhibición por sustrato disminuye pero la inhibición por producto, es decir, butanol aumenta, llegándose a estar casi completamente inhibido el microorganismo en el 4° biorreactor. Considerando este planteamiento, la batería se optimizó a valores intermedios de productividad a partir del segundo biorreactor, dejando al último biorreactor con una inhibición grande por productos y casi nula por sustrato de modo que el mecanismo de muerte celular entre en operación en el modelo matemático.

Conclusiones

La vía metabólica para la fermentación acetobutilica contempla un estudio de modelos estructurados según Embden-Meyerhof-Parnas (EMP) utilizando como sustrato glucosa, permitiendo la modelación y simulación tanto en estado estable y transitorio. En estado estable, el análisis de rendimiento demuestra que una serie de bioreactores no aumenta el rendimiento de glucosa a butanol haciendo innecesario dicho esquema, al igual que visualiza la alta no linealidad del modelo estudiado y los posibles estados estables que reducen la convergencia hacia las solución física real sobre la que se está simulando.

Un análisis en estado transitorio sobre el estado estable en el cual los límites cinéticos son válidos, revela la capacidad de optimizar las variables de decisión: productividad de butanol, rendimiento de glucosa a butanol y conversión de global de glucosa. Los resultados obtenidos dejan ver un arreglo óptimo de 4 bioreactores de tanque agitado en flujo continuo en donde el primer reactor de la serie se encuentra maximizado hacia la productividad de butanol, a un alto rendimiento de glucosa a butanol y una baja conversión, de donde, la decisión operacional permite que en el segundo y tercer bioreactor se aumente la conversión bajo un equilibrio entre la inhibición por sustrato y por producto para que no disminuya la productividad a valores no deseables y dejando un cuarto biorreactor máximo hacia la conversión e inhibido por butanol casi por completo.

Agradecimientos

Referencias

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(Recibido el 11 de noviembre de 2009. Aceptado el 27 de octubre de 2010)

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