Juan Carlos Herrera¹

¹ Investigador científico II, Disciplina de Mejoramiento Genético y Biotecnología, Centro Nacional de Investigaciones del Café (CENICAFE), Chinchiná, Caldas. e-mail: juanc.herrera@cafedecolombia.com

Fecha de recepción: 21 de noviembre de 2006 Aceptado para publicación: 06 de junio de 2007

Resumen: La citogenética es la disciplina que estudia las implicaciones genéticas de la estructura y el comportamiento de los cromosomas. Durante las últimas dos décadas los estudios citogenéticos avanzaron gracias a la información generada por métodos clásicos, los cuales permitieron establecer los primeros modelos citogenéticos en especies como tomate, trigo y arroz. Al final del siglo pasado los estudios citogenéticos mostraron un avance significativo gracias a la implementación de nuevas técnicas destinadas al análisis de cromosomas, tanto mitóticos como meióticos, entre las cuales se destacan el bandeo de cromosomas y la hibridación in situ sobre cromosomas. Actualmente, la mayoría de las técnicas de citogénetica molecular se basan en la tecnología de la hibridación in situ fluorescente o FISH (fluorescent in situ hybridization). Esta tecnología abrió la posibilidad de estudiar regiones específicas de la cromatina directamente sobre los cromosomas, gracias a la información derivada de la secuencia misma del ADN, y no solamente por simples características morfológicas. Como consecuencia, la citogenética molecular ha adquirido una importancia cada vez mayor en los diferentes proyectos de mapeo genético que se adelantan actualmente. En la presente revisión se hace una descripción breve de la progresión que han tenido las técnicas de citogenética, desde la llamada ‘citogenética clásica' hasta las técnicas actuales de alta resolución. Esta descripción histórica es seguida de varios ejemplos concretos que ilustran la utilización de la FISH, no sólo en el mejoramiento genético de los cultivos, sino también en el estudio estructural y funcional de los genomas vegetales.

Abstract: Cytogenetics would be defined as a discipline concerned with the genetic implications of chromosome structure and behavior. During past twenty years cytogenetics studies were carried out due to the information derived from classical methods based on chromosome deletions and translocations. As a result of such studies, the first cytogenetic models in such species as tomato, wheat, and rice were created. Significant advances in most plant cytogenetic systems have occurred in the last quarter of the 20 century with the introduction of chromosome banding, in situ hybridization, and other techniques for the analysis of somatic and meiotic chromosomes. Most of current cytogenetic protocols are based on the fluorescent in situ hybridization (FISH) technology. This DNA:DNA in situ method had opened a possibility to address chromatin regions of individual chromosomes on the basis of DNA sequence information in addition of mere morphological features. With genome mapping projects underway sequencing chromosomes and genomes, cytogenetic research had become more relevant. In this review, a historical perspective of chromosome research during the last 80 years is presented. It shows the progression of the ‘classical cytogenetics' up to current ‘molecular cytogenetics' founded on high resolution techniques such as FISH. The diversity of applications is illustrated through some practical examples of valuable current utilization of FISH-based methodologies in plant breeding programs, as well as in structural and functional genomics.

Key words: in situ hibridization, FISH, plant breeding, plant chromosomes, cytogenetic map.

Introducción

EL TÉRMINO CITOGENÉTICA define en un sentido amplio aquella disciplina que trata sobre la estructura y el comportamiento de los cromosomas, así como de las implicaciones genéticas derivadas de su estudio (Gill y Friebe, 1998). Los trabajos citogenéticos realizados en los últimos veinte años se han concentrado principalmente en el estudio de la estructura y evolución del genoma de diferentes especies vegetales, tanto silvestres como cultivadas. En estas últimas, la citogenética ha facilitado grandemente el entendimiento de la organización y estructura de los genomas, de ahí la importancia que ha empezado a tener en los proyectos de mapeo genético que se adelantan actualmente en distintas especies.

Los llamados mapas citogenéticos o cromosómicos constituyen una etapa intermedia entre los mapas físicos (basados en el ordenamiento secuencial de grandes fragmentos cromosómicos) y los mapas genéticos (derivados de los análisis genéticos o de ligamiento). La disponibilidad de un mapa citogénetico permite posicionar los genes, y los marcadores ligados a éstos, con respecto a los marcadores de tipo estructural propios de regiones cromosómicas específicas (por ejemplo, centrómeros, telómeros, constricciones secundarias). En consecuencia, una información citogenética detallada resulta indispensable para combinar de manera coherente, la información genética disponible con la estructura física de los cromosomas.

Orígenes de la citogenética clásica

La citogenética clásica propiamente dicha nació en los albores del siglo XX con los estudios sobre la estructura y comportamiento de los cromosomas del maíz, los cuales dominaron una buena parte de las ciencias biológicas de la época (Longley, 1927; Randolph, 1941; Roman, 1947). Gracias a estos primeros resultados, hacia 1930 ya se contaba con mapas detallados de los cromosomas paquiténicos del maíz, donde cada cromosoma podía ser diferenciado con base en su tamaño, la posición del centrómero, el largo de sus cromátides y los patrones de coloración de la cromatina. Como resultado de ello, diferentes mapas citogéneticos estuvieron rápidamente a disposición de los genetistas, cada vez más interesados en el estudio detallado del genoma. Dentro de los muchos estudios citogéneticos realizados cabe destacar las contribuciones pioneras de la Dra. Barbara McClintock al conocimiento de la dinámica de los ‘elementos móviles' en los cromosomas del maíz (Jones, 2005). Años más tarde, Rick y colaboradores desarrollarían el primer sistema citogénetico para el tomate, basados en la información generada por los estudios sobre los cromosomas paquiténicos. Fue justamente este complejo sistema el que sirvió de base al grupo de Tanksley para la clonación del primer gen de resistencia sobre una especie vegetal (Martin et al., 1993).

Luego del descubrimiento en 1953 del código genético por Watson y Crick, la mayor parte de los trabajos científicos en el área de la citogenética se orientaban a la descripción minuciosa de la forma y el número de cromosomas, así como a la caracterización detallada de las mutaciones. El rápido desarrollo de nuevas metodologías de tinción y manipulación de los cromosomas llevó sentar las bases para el gran desarrollo que habría de tener la citogenética en los años venideros. Fue por aquella época que se logró determinar el número exacto de cromosomas del genoma humano (Tijo y Levan, 1956) e identificar las estructuras proteicas responsables del apareamiento cromosómico durante el proceso de división celular (Moses, 1968).

La nueva era de la citogenética molecular

El punto de partida de la citogenética molecular remonta a los primeros experimentos de hibridación con sondas de ADN y de ARN marcadas radioactivamente (Jhon et al., 1969; Pardue y Gall, 1969). A pesar de la importancia de estos resultados, por aquella época la técnica per se no tendría el auge esperado por dos razones fundamentales: a) la existencia de limitaciones técnicas relacionadas con la detección autoradiográfica de las sondas radioactivas, y b) la ausencia de protocolos eficientes para la clonación de secuencias de interés. No obstante, una observación derivada de estos trabajos daría comienzo a una importante innovación en el campo de la citogenética. En efecto, durante sus experimentos, Pardue y Gall (1969) notaron una alteración en las propiedades de coloración de los cromosomas cuando éstos eran sometidos a condiciones de denaturación específica (por ejemplo, lisis alcalina y alta temperatura). Este hecho sugería que era posible obtener bandas específicas que a priori permitirían diferenciar individualmente los cromosomas. Un año después los trabajos de Caspersson et al. (1970) mostraron que algunos agentes fluorescentes como la quinacrina, permiten obtener patrones de bandas específicos cuando se fijaban sobre regiones cromosómicas ricas en guanina. Este tipo de bandeo diferencial, conocido como ‘bandas Q', sirvió de base para la identificación completa de los cromosomas en humanos y más tarde en otras especies (Comings, 1978; Schweizer, 1980; Vosa, 1985).

La verdadera revolución en el campo de la citogenética se dio en los últimos 15 años, particularmente en el área humana y animal. Las innovaciones técnicas en la microscopía confocal y epifluorescente, así como el desarrollo de componentes ópticos de excelentes características (lentes, filtros, captores), mejoraron de manera decisiva el desempeño de los clásicos microscopios de luz transmitida. A estos cambios se sumó la implementación progresiva de una amplia gama de métodos de hibridación con sondas fluorescentes, basadas en la utilización de una gran variedad de fluorocromos que abarcaban prácticamente toda la gama del espectro luminoso, desde el infrarrojo hasta el ultravioleta. En fin, el desarrollo de métodos rápidos y precisos para la marcación y detección de sondas, así como la utilización de software especializado para el tratamiento de imágenes, darían un gran empuje a las técnicas modernas basadas en la llamada hibridación in situ fluorescente o FISH (por fluorescent in situ hybridization) utilizadas en la investigación médica y biológica actual.

La hibridación in situ de alta resolución

A diferencia de las técnicas citogenéticas convencionales, las técnicas FISH se basan en reacciones moleculares específicas entre el ADN cromosómico y otra secuencia cualquiera denominada ‘sonda'. El principio de la técnica FISH sobre cromosomas consiste en la hibridación de sondas de ADN previamente marcadas con un fluorocromo específico directamente sobre el ADN cromosómico, aprovechando la homología existente entre éstas. Las sondas utilizadas pueden ser de dos tipos: secuencias repetitivas o secuencias únicas o de ‘copia simple'. Para la detección de tales sondas los preparados cromosómicos se exponen a la luz ultravioleta, lo cual provoca la excitación de los electrones de la molécula fluorescente. Esta excitación se caracteriza por una emisión de rayos cuya longitud de onda varía según el tipo de fluorocromo empleado. Las principales ventajas de esta técnica radica en su seguridad, su rapidez y, sobre todo, en su potencial para la identificación simultánea de diferentes sondas (Jiang y Gill, 1994; Heslop- Harrison y Schwarzacher, 1996; Lichter, 1997).

Los primeros estudios de FISH en diferentes especies vegetales se orientaron principalmente al mapeo de secuencias repetitivas y de familias de multigenes (Jiang et al., 1996). Sin embargo, el rápido progreso de la técnica ha permitido optimizar cada una de las diferentes etapas, trayendo como consecuencia una mejora sustancial tanto en la sensibilidad como en el poder de resolución espacial, hasta el punto de permitir la detección de secuencia únicas (Herrick y Bensimon, 1999). El término ‘sensibilidad' designa el tamaño mínimo de una secuencia de ADN que puede ser detectada de manera no ambigua bajo el microscopio. Por su parte, ‘la resolución espacial' puede definirse como la distancia física mínima a la que dos secuencias adyacentes (en el ADN cromosómico) pueden ser identificadas bajo un microscopio de fluorescencia (De Jong et al., 1999).

Los trabajos recientes que han usado la microscopía electrónica de barrido han permitido tener una visión más realista de la estructura de los cromosomas mitóticos de las plantas. De acuerdo con el modelo propuesto por Wanner et al. (2005), los cromosomas se estructuran en diferentes niveles de condensación, que van desde la fibra desnuda de ADN de apenas dos nanómetros (nm) hasta los llamados cromómeros, que corresponden a estructuras en bucle de 200 a 300 nanómetros (figura 1). Es el ‘super-enrollamiento' de estos cromómeros lo que va a formar los brazos (o cromátidas) de los cromosomas. En la práctica, bajo condiciones óptimas de hibridación y de detección, la sensibilidad de la técnica FISH depende en buena parte de la accesibilidad de la sonda a la región homóloga sobre el ADN, la cual está determinada a su vez, por el grado de condensación del ADN cromosómico. En otras palabras, entre menos condensados se encuentren los cromosomas, la molécula de ADN estará menos enrollada y, en consecuencia, la accesibilidad de las sondas al ADN cromosómico será mejor (Van de Rijke et al., 2000). El grado de condensación de la cromatina varía de forma importante, no solamente entre las diferentes fases de la división celular (figura 2), sino también entre los diferentes tipos de configuración adoptada por el ADN cromosómico (tabla 1).

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El primer material utilizado para realizar análisis FISH fueron los cromosomas mitóticos en metafase. Este tipo de cromosomas se caracterizan por mantener su morfología básica, lo cual permite inferir de manera general la ubicación de las sondas en el genoma. Sin embargo, la elevada condensación de la cromatina que caracteriza la metafase reduce grandemente tanto la resolución como la sensibilidad obtenidas al utilizar este tipo de cromosomas. Ante tal limitante, la fijación de cromosomas mitóticos en estadios más tempranos (como la interfase) es una alternativa interesante dado el menor grado de condensación que presentan. Si bien la resolución mejora sensiblemente, la pérdida de la estructura cromosómica, a causa de la descondensación de la cromatina, impide la localización precisa de la sonda respecto al cromosoma (De Jong et al., 1999). La utilización de cromosomas meióticos, y más exactamente en fase de paquiteno, ofrece dos ventajas importantes con respecto a los cromosomas mitóticos: a) son naturalmente menos condensados y, por tanto, de mayor longitud (hasta 40 veces más largos que los cromosomas mitóticos), lo cual mejora sensiblemente la resolución obtenida; y además b) muestran una diferenciación clara entre las regiones de eucromatina y heterocromatina que facilita la identificación de regiones específicas dentro de cromosomas individuales (Lavania, 2001; Cheng et al., 2002). A pesar de esto, la obtención de cromosomas paquiténicos sigue siendo difícil y tediosa, particularmente en lo que respecta a la obtención de los tejidos florales (por ejemplo, las anteras) y a la interpretación correcta de las diferentes fases del ciclo meiótico entre especies.

Aunque el poder de resolución obtenido con los cromosomas paquiténicos es elevado (entre 105 y 106 bases, según el tipo de cromatina), el mayor progreso en la detección de secuencias mediante la FISH se obtiene cuando se usan fibras desnudas de ADN, método conocido como ‘fiber-FISH' (De Jong et al., 1999). Este método supone el aislamiento de los núcleos y la posterior liberación de las fibras de ADN, previa degradación de la matriz nuclear. Recientemente, Valàrik et al. (2004) propusieron un método alternativo que se fundamenta en la preparación de cromosomas ‘super-extendidos'. Sin embargo, aunque ésta técnica ofrece elevados niveles de resolución, la necesidad de tener que aislar cromosomas individuales constituye una limitación mayor para una aplicación generalizada.

Algunas aplicaciones de la FISH en el estudio de los genomas vegetales

La adaptación de protocolos de FISH en un número cada vez más creciente de especies vegetales ha abierto nuevas posibilidades para el estudio de los genomas vegetales permitiendo, entre otras cosas, los desarrollos siguientes: a) identificar cromosomas específicos, b) estudiar el origen y la estructura de los genomas híbridos, c) comparar regiones genómicas homologas, d) estudiar el comportamiento cromosómico, y e) localizar secuencias específicas de ADN (como por ejemplo, transposones y otros fragmentos cromosómicos). A continuación se presentan ejemplos de algunas de estas aplicaciones.

Identificación de cromosomas. La FISH, combinada con otras técnicas como el bandeo de cromosomas, permite en algunos casos generar nuevos patrones de polimorfismo útiles en la identificación y caracterización de cromosomas (cariotipaje). Un ejemplo de esto es el trabajo de Schrader et al. (1997) en el girasol (Helianthus annuus); estos autores combinaron la técnica de bandeo con Giemsa con la detección de genes específicos mediante la FISH con el fin de diferenciar cada uno de los cromosomas de ésta especie. En forma similar, Koo et al. (2004) utilizaron la hibridación in situ para caracterizar los cromosomas de una especie cultivada de colza (Brassica rapa). Combinando los patrones heterocromáticos producidos por la coloración fluorescente con DAPI (4'-6-diamino-2-fenilindol) y la presencia de secuencias repetitivas específicas, lograron construir un mapa citogenético completo. De otro lado, Andras et al. (2000) fueron capaces de obtener patrones diferenciales en cromosomas de diferentes especies vegetales, mediante la combinación de dos fluorocromos: el ioduro de propidio y el DAPI. En la figura 3 (a, b y c) se ilustran algunos ejemplos de la utilización de la FISH para la localización de secuencias repetitivas con el fin de diferenciar cromosomas de arroz, pino y maíz.

LaGISH también ha sido utilizada con éxito para el análisis de la introgresión en híbridos interespecíficos e intergenéricos, aprovechando la diferencia estructural entre genomas y, particularmente, la presencia de secuencias genoma-específicas (para revisión ver Anamthawat-Jonsson, 2001). La organización nuclear y el comportamiento de los cromosomas han sido también objeto de intensos estudios, no sólo sobre híbridos F₁ (Anamthawat-Jonsson et al., 1993; Poggio et al., 1999) sino también, sobre genotipos avanzados (Schwarzacher et al., 1992; Hou y Peffley, 2000; Ji et al., 2004). La GISH se ha revelado igualmente eficiente para localizar regiones cromosómicas portadoras de genes de resistencia (Tang et al., 1997).

Estudios comparativos entre genomas. La FISH ha sido empleada para el análisis comparativo entre genomas gracias a la técnica conocida como hibridización genómica comparativa o CGH (por comparative genome hybridization). Esta técnica, propuesta por Zoller y colaboradores (2001), se basa en la utilización del ADN genómico de una especie patrón (por ejemplo, Arabidopsis) que se usa como sonda para hibridizarlo sobre los cromosomas de otra especie. Esta hibridación cruzada genera una serie de bandas sobre los cromosomas de la especie estudiada, las cuales corresponden a regiones genómicas conservadas (por lo general, secuencias repetitivas) entre las dos especies.

La ventaja principal de la CGH es que permite analizar el cariotipo de una especie dada con un enfoque molecular, sin necesidad de utilizar secuencias específicas que son difíciles de obtener. La utilización de Arabidopsis como especie patrón tiene la ventaja del acceso a la información genética completa, gracias a que todo su genoma ya ha sido enteramente secuenciado. Una modificación de la CGH es el mapeo comparativo in situ o ISCM (por in situ comparative mapping) el cual permite la co-localización de secuencias particularmente conservadas entre dos genomas. Este tipo de análisis ha sido utilizado para el estudio de la colinearidad entre genomas de diferentes especies, y en particular, de la estructura de los cromosomas homeólogos (Cabrera et al., 2002).

Mapeamiento físico de secuencias de ADN. Dado que los extendidos de fibras de ADN dejan al descubierto la posición linear de las secuencias a lo largo de un fragmento cromosómico, la hibridación in situ sobre fibras de ADN o fiber-FISH permite localizar y ordenar secuencias específicas de interés (figura 3, f). De esta forma es posible obtener una imagen detallada e integral de la secuencia y de su colinearidad con los marcadores asociados a dicha región. Además, permite calcular la distancia física que las separa. El desarrollo de la técnica de fiber-FISH ha sido una herramienta decisiva para el mapeo de regiones asociadas con diferentes enfermedades en el genoma humano (Herrick y Bensimon, 1999). Si bien la adaptación de esta técnica para el estudio del genoma de las plantas se encuentra actualmente restringido a unas pocas especies, los resultados obtenidos son prometedores.

La localización de genes presentes en regiones teloméricas o centroméricas es de particular interés para los estudios de mapeo genético en plantas. Sin embargo, el estudio genético de estas secuencias es generalmente una tarea difícil por la presencia de regiones ricas en heterocromatina, las cuales perturban la recombinación meiótica. Ante las limitaciones del análisis genético, la técnica FISH ofrece una alternativa rápida y precisa para el estudio de este tipo de secuencias. La utilidad de la FISH sobre fibras de ADN para la localización de sondas de pequeña longitud (hasta 40 kilobases, kb) fue demostrada por primera vez en el arroz (Jiang et al., 1995).

El trabajo realizado por Zhong et al. (1999) es un ejemplo práctico de la utilización de la FISH en fibras de ADN para el estudio de genes de interés. Con base en la información genética disponible, los autores lograron ubicar físicamente los genes Mi y ApsI presentes en la región centromérica del cromosoma 6 del tomate, particularmente rica en secuencias repetitivas. Gracias a la hibridación con sondas portadoras de secuencias ligadas a tales genes se logró establecer de manera precisa la distancia física entre estos dos genes.

Otros estudios permitieron confirmar la importancia de esta técnica como una herramienta complementaria para la generación, y posterior verificación, de mapas físicos en especies como arroz y Arabidopsis (Zhang y Wing, 1997; Jackson et al.,1998). La fiber-FISH ha sido utilizada igualmente para el mapeo de fragmentos de ADN-T transferidos por transgénesis en plantas de papa (Wolters et al.,1998) y en la localización física de diferentes fragmentos cromosómicos estrechamente asociados con genes de resistencia (Xu et al., 2001).

Limitaciones de la técnica FISH

Como toda nueva tecnología, las técnicas basadas en la hibridación in situ traen consigo algunas limitaciones, las cuales deben tenerse en cuenta al momento de considerar su utilización. Algunos de los problemas más recurrentes en los experimentos de FISH en plantas tienen que ver con la sensibilidad de detección (determinada principalmente por el tamaño de las secuencias usadas como sonda), y con la especificidad de las sondas (dependiente de la homología genética entre genomas). Estos problemas parecen explicarse por las diferencias existentes respecto del tipo de secuencias (únicas o repetitivas) y de su distribución (localizada o generalizada) a lo largo de los genomas, tanto animales como vegetales.

Conclusiones y perspectivas

Gracias al avance vertiginoso de la citogenética molecular de alta resolución, hoy se dispone de un gran arsenal de herramientas destinadas al estudio estructural y funcional de los genomas. El constante adelanto en la tecnología de los equipos de microscopía, así como el desarrollo de métodos de marcación y detección cada vez más sensibles, hacen presagiar un futuro promisorio para las técnicas de hibridación in situ sobre ADN en los campos de la genómica y la post-genómica.

Dentro de las nuevas técnicas que se están aplicando para la detección de secuencias en plantas, aquella conocida como PRINS (por primed in situ labeling) ofrece una elevada sensibilidad de detección respecto de la FISH convencional (Kubaláková et al., 2001). Esta técnica se basa en la hibridación de sondas no marcadas sobre el ADN cromosómico, seguida de una amplificación enzimática vía PCR, en presencia de nucleótidos marcados con fluorescencia. De otro lado, la disponibilidad actual de una amplia gama de fluorocromos, permite la coloración simultánea de diferentes cromosomas en un solo experimento de hibridación. Si bien esta técnica, llamada mcGISH (por multicolor GISH), ha sido ampliamente utilizada en el análisis del genoma humano y otras especies de mamíferos (Langer et al., 2004), su aplicación en plantas es aún limitada (Lysak et al., 2003). A estas nuevas metodologías se suma la posibilidad técnica de poder aislar cromosomas enteros o partes de un cromosoma con el fin de obtener librerías específicas de utilidad para el aislamiento de secuencias y genes de interés presentes sobre un cromosoma particular.

La caracterización futura de los genomas animales y vegetales mediante las técnicas de citogenética molecular va, sin duda, más allá de la simple genómica descriptiva. Un ejemplo de ello son algunos trabajos recientes que combinan el uso de técnicas de inmunocitogenética y de citogenética molecular para el estudio de la arquitectura nuclear y de los procesos bioquímicos implicados en la transcripción y la replicación del ADN (Tessadori et al., 2004). La utilización progresiva de todas estas tecnologías en los proyectos de genómica que se desarrollan actualmente en diferentes cultivos, servirá sin duda para mejorar nuestra comprensión sobre la organización y la expresión de los genes, uno de los objetivos fundamentales de cualquier programa de mejoramiento genético.

Agradecimientos

El autor desea expresar sus agradecimientos a M. Rodier y F. Anthony por la lectura y sugerencias aportadas durante la escritura de este documento.

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