Helena Reichel1, Maritza Cuervo2 y Francisco J. Morales3
1 Investigadora, Corporación Colombiana de Investigación Agropecuaria (Corpoica), C.I. Tibaitatá, Mosquera (Colombia). hreichel@rocketmail.com
2 Laboratorio de Sanidad Vegetal, Unidad de Recursos Genéticos, Centro Internacional de Agricultura Tropical (CIAT), Palmira (Colombia). m.cuervo@cgiar.org
3 Jefe, Unidad de Virología Vegetal, Centro Internacional de Agricultura Tropical (CIAT), Palmira (Colombia). fmorales@cgiar.org
Fecha de recepción: abril 10 de 2008. Aceptado para publicación: julio 10 de 2008
Se observaron síntomas de rayado necrótico en las hojas de una planta de Musa coccinea (banano escarlata), procedente de Antioquia (Colombia). Mediante inmunocaptura, transcripción reversa y reacción en cadena de la polimerasa (IC-RT-PCR), se amplificó un fragmento de aproximadamente 377 pares de bases, con una identidad de secuencia de aminoácidos de 57% con el gen de la cubierta proteica del Alstroemeria virus X (AlsVX, AB206396) del género Potexvirus. Este es el primer reporte de un Potexvirus en M. coccinea. El análisis comparativo de la 3’UTR del Potexvirus aislado de M. coccinea con el correspondiente del AlsVX muestra que estos dos virus difieren significativamente en esta región, lo que sugiere que el Potexvirus aislado de M. coccinea en Colombia es una nueva especie del género Potexvirus. Se propone el nombre de virus de la raya necrótica del banano escarlata (Scarlet banana necrotic streak virus (SBanNSV)) para este virus aislado de M. coccinea en Colombia.
Palabras clave: banano escarlata, cubierta proteica, Flexiviridae, SBanNSV, 3’UTR.
ABSTRACT
Necrotic streak symptoms were observed on the leaves of a Musa coccinea (scarlet banana) plant from Antioquia (Colombia). Immune capture reverse transcription polymerase chain reaction (ICRT-PCR) amplified a DNA fragment of approximately 377 base pairs showing amino acid sequence identities of 57% with the coat protein of Alstroemeria virus X (AlsVX, AB206396) genus Potexvirus. This is the first report of a Potexvirus infecting M. coccinea. Alignments of the 3’UTRs of the M. coccinea Potexvirus and AlsVX showed that these two viruses differ in a significant way in this region, which suggests that the Potexvirus isolated from M. coccinea in Colombia is a new specie in the genus Potexvirus. We propose the name of Scarlet banana necrotic streak virus (SBanNSV) for the Potexvirus that was isolated from M. coccinea.
Key words: scarlet banana, protein coat, Flexiviridae, SBanNSV, 3’UTR.
Introducción
Musa coccinea, conocida como banano escarlata, es una especie ornamental de la familia Musaceae (Jones, 2000), nativa de China (Liu et al., 2002). M. coccinea se encuentra ampliamente distribuida en el mundo, incluidos Colombia (Villegas et al., 2005) y Brasil (Lins y Coelho, 2004) en América del Sur. El único patógeno viral anteriormente descrito para esta especie en Colombia es el virus del mosaico del pepino (Cucumber mosaic virus (CMV)) (Villegas et al., 2005). En septiembre 25 de 2001 se observó una planta de M. coccinea afectada por el síntoma del rayado necrótico en las hojas (figura 1), en el departamento del Antioquia (Colombia).
Materiales y métodos
Aislamiento del virus, IC-RT-PCR, clonación y secuenciación
Se utilizó una hoja de M. coccinea como fuente del agente causal. Para amplificar parte del gen de la cubierta proteica (CP) y la región 3’ no codificante, conocida en inglés como untranslated region (UTR), se utilizó el método de immunocaptura, transcripción reversa y reacción en cadena de la polimerasa (IC-RT-PCR) (Sharman et al., 2000). La síntesis de ADNc se realizó según el método de Sharman et al. (2000), con leves modificaciones. La mezcla del ADNc consistió de 30 pmol del iniciador degenerado Poty 1 (Gibbs y Mackenzie, 1997), 20 unidades (U) de RNaseOUT recombinant ribonuclease inhibitor (Gibco, BRL), 4 μL de MgCl2 25 mM, 2 μL de dNTPs 10 mM (Promega), 4 μL de DTT 100 mM (Gibco, BRL), 200 U de transcriptasa reversa Super Script II (Gibco, BRL) y ca. 3 U de E. coli RNase H, en un volumen fi nal de reacción de 40 μL.
La mezcla de la PCR consistió de 2,5 μL de tampón 10X PCR, 2 mM MgCl2, 200 μM de cada dNTP (Invitrogen), 10 pmol del iniciador degenerado Poty1 (Gibbs y Mackenzie, 1997), 30 pmol del iniciador degenerado DCCP (5’-TATGCNGCNTTYGAYTTCTTRGAYG- 3’), 1 U de polimerasa Taq (AmpliTaq DNA polymerase, Perkin Elmer), 2 μL del template de la síntesis del cDNA y agua destilada estéril, para un volumen fi nal de reacción de aproximadamente 25 μL. La PCR (Saiki et al., 1988) se realizó en un termociclador PTC-100 (MJ Research), con el siguiente programa: 94 °C/1 min; 94 °C/20 s; 56 °C/1 min; 72 °C/1 min; por 35 ciclos y un ciclo fi nal de 72 °C/3 min.
El producto de la PCR se purificó usando el kit Magic PCR DNA Purification System (Promega), según las instrucciones del fabricante y luego se clonó en la cepa INVα F’ de E. coli, utilizando como vector el plásmido pCR2.1 del kit TA Cloning (Invitrogen), según las instrucciones del fabricante. Las colonias de E. coli se establecieron en el medio selectivo Luria-Bertani-agar (Sambrook et al., 1989) con ampicilina, X-Gal y el inductor IPTG, para seleccionar los clones recombinantes. Se realizó una PCR con los iniciadores M13 y T7, usando las colonias blancas, para identificar las colonias que contenían el plásmido recombinante; los productos amplificados se analizaron por electroforesis en un gel de agarosa al 1%, usando bromuro de etidio. El ADN plasmídico se purificó usando el kit Wizard Miniprep DNA Purification Systems (Promega). Para determinar la presencia del inserto en el plásmido recombinante, se realizaron digestiones con la enzima de restricción EcoRI, usando 12 U de enzima (Promega) con 3 μL del ADN plasmídico purificado, en un volumen fi nal de reacción de 20 μL. Las digestiones se llevaron a cabo a 37 °C por cerca de 2 h en el tampón de restricción del fabricante. Los productos de las digestiones se analizaron por electroforesis en un gel de agarosa al 1%, teñido con bromuro de etidio.
Se utilizó un secuenciador automático ABI Prism 377 DNA (Perkin-Elmer). Las secuencias obtenidas se analizaron con los programas Sequencher 4.0 (Gene Codes Corporation), BLAST (NCBI, NIH) y DNAMAN versión 5.2.10 (Lynnon BioSoft ).
Se realizaron análisis comparativos de los alineamientos múltiples de las secuencias parciales de aminoácidos encontradas en la región C-terminal de la CP del virus aislado de M. coccinea en Colombia con las correspondientes secuencias parciales de la CP de Alstroemeria virus X (AlsVX, AB206396) y del Narcissus mosaic virus (NMV, AY225449), Lettuce virus X (AM745758), Banana mild mosaic virus (BanMMV, AF314662), Cherry necrotic rusty mottle virus (CNRMV, NC_002468) y Citrus leaf blotch virus (CLBV, AJ318061), de la familia Flexiviridae (Adams et al., 2004; Fauquet et al., 2005; Martelli et al., 2007).
Resultados y discusión
Análisis moleculares ]]>
Se amplificó un fragmento de aproximadamente 377 pb (figura 2a, carril 1) y se obtuvo un plásmido recombinante en una colonia de E. coli mediante la PCR con el par de iniciadores (primers) M13 y T7 (figura 2b, carril 1). La digestión de ADN plasmídico recombinante con la enzima de restricción Eco RI reveló la presencia del inserto (figura 2c).
El análisis con el programa TBLASTX del fragmento amplificado mostró una identidad de secuencia de aminoácidos de 50%-57% con las CP de los Potexvirus Alstroemeria virus X (AlsVX, AB206396), Narcissus mosaic virus (NMV, AY225449), Lettuce virus X (AM745758) y Asparagus virus 3 (AV-3, AB304848).
La región amplificada de la CP del Potexvirus aislado de M. coccinea (localizada en la región 3’ terminal del ORF5), está formada por 220 nucleótidos, incluido el codón de terminación TGA. La composición parcial de la CP del Potexvirus aislado de M. coccinea tiene la composición: 25,9% A; 33,6% C; 22,7% G; 17,3% de T y 0,5% de otros (figura 3).
La secuencia parcial de 220 nucleótidos de la CP del Potexvirus aislado de M. coccinea codifica para 72 aminoácidos (figura 4).
El motivo conservado TGG para una proteasa de treonina se encuentra en la CP de BanMMV (Gambley y Th omas, 2001) y de CNRMV, pero no, en el CP del Potexvirus aislado de M. coccinea, AlsXV (AB206396), NMV y AV-3. Del árbol de homología se concluye que las secuencias parciales de aminoácidos de la CP del Potexvirus aislado de M. coccinea comparte más similitudes con la región correspondiente a la CP de AlsVX, NMV y Lettuce virus X y AV-3 (figura 6).
Un análisis comparativo, mediante alineamiento múltiple de las secuencias parciales de aminoácidos, de la CP del Potexvirus aislado de M. coccinea con la correspondiente región del AlsVX (AB206396), NMV (AY225449), Lettuce virus X (AM745758) y AV-3 (AB304848), reveló la presencia de 32 secuencias de aminoácidos totalmente conservadas y altos niveles de homología (>75%), indicando que las secuencias de aminoácidos de la CP del Potexvirus aislado de M. coccinea en Colombia tiene muchas características en común con la CP de los Potexvirus AlsVX, NMV y Lettuce virus X (figura 7).
El motivo DF(F/L)(D/E)(G/A)VL(S/N) encontrado en la CP del Potexvirus aislado de M. coccinea en Colombia, del AlsVX, NMV, AV-3 y Lettuce virus X es similar al encontrado en la CP de otros virus flexuosos de plantas (Gambley y Th omas, 2001, Henderson et al., 1992; Dolja et al., 1991, Rustici et al., 2000) y probablemente tiene una función en las interacciones del RNA con la CP (Rustici et al., 2000; Gentit et al., 2002).
]]> El análisis comparativo entre los aminoácidos de la secuencia parcial de la CP del Potexvirus aislado de M. coccinea, AlsVX, NMV y AV-3 (tabla 1) mostró el valor más alto de porcentaje de identidad de aminoácido (88%) entre AlsVX y NMV. Un valor alto (50%) de porcentaje de identidad de aminoácidos se encontró entre la CP del Potexvirus aislado de M. coccinea y la CP de AlsVX.
Se realizó el alineamiento múltiple de secuencias de nucleótidos de la 3’UTR del Potexvirus aislado de M. coccinea, con la 3’UTR del BanMMV (AF314662), usando el programa DNAMAN (figura 8).
La región 3’UTR del Potexvirus aislado de M. coccinea y la del BanMMV AF314662 difieren en tamaño (140 nts y 77 nts, respectivamente) y en varias regiones que no son conservadas entre ellos. Sin embargo, se observan motivos conservados que pueden estar involucrados en funciones fundamentales de estos virus, como en la replicación. Un análisis comparativo del alineamiento múltiple de las secuencias de nucleótidos de la 3’UTR del Potexvirus aislado de M. coccinea de Colombia con las de la 3’UTR de AlsVX (AB206396), reveló la presencia de 28 nucleótidos totalmente conservados (figura 9), que están involucrados probablemente en funciones de replicación.
Las regiones 3’UTR del Potexvirus aislado de M. coccinea y del AlsVX difi eren en tamaño (140 nts y 77 nts, respectivamente), y el análisis comparativo mostró variabilidad molecular en varias regiones de ellos. Este análisis comparativo de la 3’UTR del Potexvirus aislado de M. coccinea con la 3’UTR del AlsVX muestra que estos dos virus difieren significativamente en esta región, lo que sugiere que el Potexvirus aislado de M. coccinea en Colombia es una nueva especie del género Potexvirus.
]]> ConclusionesEste estudio mostró que M. coccinea en Colombia es afectada por un Potexvirus aparentemente nuevo, similar pero diferente al AlsVX y al NMV. Se propone el nombre de virus de la raya necrótica del banano escarlata (Scarlet banana necrotic streak virus (SBanNSV)) para este virus aislado de M. coccinea en Colombia. El impacto económico de este virus en especies de Musa cultivadas se desconoce. Se recomienda proseguir la caracterización molecular y biológica de este virus, para poder determinar su modo de transmisión, rango de hospederos, distribución geográfica, etc., con el fin de tomar medidas de control adecuadas.
Agradecimientos
Este estudio fue financiado por la Unidad de Virología Vegetal del Centro Internacional de Agricultura Tropical (CIAT), de Palmira (Colombia), y por el Fondo Nacional de Fomento Hortofrutícola-Asohofrucol (Colombia).
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