Juan Cubillos-Hinojosa1, 2, Nelson Valero1 y Lauris Mejía1
1 Departamento de Microbiología, Universidad Popular del Cesar, Valledupar (Colombia).
2 Autor de correspondencia. juancubillos@unicesar.edu.co
Fecha de recepción: 20 de agosto de 2008. Aceptado para publicación: 19 de febrero de 2009
Se realizó un experimento en condiciones de laboratorio e invernadero, con el propósito de evaluar el efecto de la cepa nativa TCN-014 y la cepa comercial TCC-005 de Trichoderma harzianum sobre la germinación y el crecimiento temprano del maracuyá. Se adecuaron inóculos de 104, 106 y 108 conidias/mL para cada cepa y se aplicaron a semillas de maracuyá; se evaluó el número de semillas germinadas durante 15 días; se calculó el porcentaje de germinación, el índice de velocidad de germinación y el tiempo medio de germinación. Posteriormente las semillas germinadas se llevaron a condiciones de invernadero, y transcurridos dos meses se midió la altura de las plántulas, el grosor del tallo, el número de hojas, la longitud de la raíz y el peso seco total. Todos los tratamientos estimularon la germinación de las semillas y el desarrollo de las plántulas; sin embargo la cepa nativa en concentraciones 106 y 108 conidias/mL mostró resultados superiores frente a la cepa comercial. Los resultados sugieren una acción efectiva de T. harzianum como promotor de crecimiento vegetal, mostrando que tiene potencial para la elaboración de un bioproducto útil para el manejo ecológico del cultivo de maracuyá.
Palabras clave: semillas, plántulas, cepa nativa, cepa comercial, Colombia.
ABSTRACT
A greenhouse and laboratory experiment was conducted with the aim of evaluating the effect of a native (TCN-014) and a commercial (TCC-005) T. harzianum strains on passion fruit germination and early growth. Seed germination was evaluated during two weeks under 104, 106 and 108 conidia/mL inoculation treatments of each strain. Calculations of germination percentage, germination rate index, and average germination period were based on measurements of number of germinated seeds. The latter were then grown under greenhouse conditions for two months, after which measurements of plant height, stem basal thickness, number of real leaves, root length and total dry biomass were taken. All treatments proved to stimulate seed germination and plant early growth. However, the 106 and 108 conidia/mL native strain treatments exhibited better results when compared to the commercial strain. The results point at the effectiveness of the native strain of Trichoderma harzianum as a plant growth promoter, and reveal its potential for the creation of a useful bio-product for the ecological management of passion fruit.
Key words: seeds, seedlings, native strain, commercial strain, Colombia.
Introducción
El género Trichoderma está compuesto por un grupo de especies de hongos saprofitos del suelo y de la madera (Jensen y Wolffhechel, 1995) y es ampliamente conocido por el efecto antagónico contra un amplio rango de fitopatógenos. Debido a su ubicuidad, facilidad de aislamiento y cultivo, crecimiento rápido en un gran número de sustratos, y al hecho de no atacar a las plantas superiores, diferentes especies de Trichoderma son utilizadas para el control de hongos patógenos del suelo, principalmente de los géneros Phytophthora, Rhizoctonia, Sclerotium, Colletotrichum, Pythium y Fusarium, entre otros (González et al., 2002). Los mecanismos de acción de hongos del género Trichoderma frente a fitopatógenos son fundamentalmente de tres tipos: competición directa por el espacio o por los nutrientes (Chet e Inbar, 1994; Belanger et al., 1995), producción de metabolitos antibióticos de naturaleza volátil o no volátil y parasitismo directo de determinadas especies de Trichoderma sobre los hongos fitopatógenos (Chet et al., 1997; Sid-Ahmed et al., 2003).
El maracuyá (Passiflora edulis var. flavicarpa Degener) es un cultivo tropical promisorio para Colombia, que ocupa el segundo lugar en producción a nivel mundial. La zona bananera del departamento del Magdalena tiene características agroecológicas adecuadas para su cultivo (Gómez, 2005). Sin embargo, desde el año 2006 se ha registrado una importante disminución de la producción en esta zona, originada por el desestímulo en el manejo agronómico del cultivo y el abandono por problemas fitosanitarios, provocados principalmente por patógenos como Fusarium oxisporum y F. solani, causantes de la enfermedad conocida como pudrición seca, marchitez, fusariosis o secadera. En la Estación Experimental Caribia de la Corporación Colombiana de Investigación Agropecuaria, Corpoica, se han realizado ensayos de antagonismo in vitro e invernadero para controlar estos patógenos, utilizando cepas comerciales del hongo T. harzianum (TCC-001, TCC-005, TCC-006 del Centro de Investigaciones El Roble). Sin embargo, en suelos de cultivo de palma africana en la zona bananera se han aislado y seleccionado tres cepas nativas de este hongo (TCN-009, TCN-010, TCN-014), de las cuales la cepa TCN-014 presentó un efecto antagónico frente a Fusarium oxisporum y F. solani, superior a las cepas comerciales (Suárez et al., 2008).
Además del efecto biocontrolador de patógenos, se ha comprobado que la inoculación de T. harzianum aporta otros beneficios a las plantas; a través de la descomposición de materia orgánica, libera nutrientes en formas disponibles para la planta (Howell, 2003; Godes, 2007), y presenta actividad solubilizadora de fosfatos (Valencia et al., 2007; Valero, 2007; Vera et al., 2002), por lo cual se utiliza frecuentemente como un organismo biofertilizante en diferentes productos comerciales (Moreno et al., 2007); promueve el crecimiento y desarrollo de los cultivos produciendo metabolitos que estimulan los procesos de desarrollo vegetal (Sutton y Peng, 1993); tiene la capacidad de multiplicarse en el suelo y colonizar las raíces de las plantas liberando factores de crecimiento (auxinas, giberelinas y citoquininas) que estimulan la germinación y el desarrollo de las plantas (Altomare et al., 1999). Se ha reportado la producción de ácido 3-indol acético (AIA), sustancia que actúa como hormona vegetal favoreciendo el desarrollo del sistema radical, entre otros beneficios (Valencia et al., 2005). Estas sustancias producidas por T. harzianum actúan como catalizadores o aceleradores de los tejidos meristemáticos primarios en las partes jóvenes de la planta, acelerando su reproducción celular, logrando que las plantas se desarrollen más rápido en comparación con plantas que no han sido tratadas con dicho microorganismo (Valencia et al. 2007), T. harzianum también ha sido reportado como promotor del crecimiento vegetal en cultivos de berenjena, arveja, fríjol, café, tomate, papa, especies forestales, entre otros (Zambrano, 1989; Börkman et al., 1998; Dandurand y Knudsen, 1993).
]]> La presente investigación tuvo como objetivo comprobar la potencialidad de la cepa nativa TCN-014, frente a la cepa comercial TCC-005 de T. harzianum, como inoculante biopromotor del crecimiento del maracuyá, mediante la evaluación de su efecto sobre la germinación y el desarrollo temprano de las plantas, con el propósito de contribuir al desarrollo de una estrategia para el manejo integrado del cultivo, mediante la elaboración, evaluación y aplicación de bioproductos con un efecto multifuncional ocasionado por la actividad biocontroladora de patógenos, sumada a la actividad fitoestimuladora y biofertilizante.Materiales y métodos
La investigación se realizó en el Laboratorio de Microbiología y Fitopatología y en el Invernadero de la Estación Experimental Caribia de Corpoica, ubicado en la zona bananera, corregimiento de Sevilla (departamento del Magdalena), con una altitud de 40 msnm, localizado en un ecosistema de bosque seco tropical (Rodríguez, 1998), con una temperatura promedio de 29°C, precipitación anual de 1.400 mm y humedad relativa de 83% (Carbonó de la Hoz y Cruz, 2005).
La cepa nativa TCN-014 de T. harzianum fue aislada del suelo del cultivo de palma africana (Elaeis guineensis) en la Estación Experimental Caribia de Corpoica, y la cepa comercial TCC-005 se obtuvo del cepario del Centro de Investigación El Roble (Suárez et al., 2008). Las cepas se reactivaron en cajas petri con agar avena, incubándose a una temperatura de 25°C durante 5 d. A partir de estos cultivos esporulados, se prepararon suspensiones del orden de 104, 106 y 108 conidios/mL en agua destilada estéril.
Germinación in vitro de semillas
En cajas de Petri se colocaron círculos de papel filtro sobre algodón y fueron esterilizadas en autoclave a 121°C con 15 PSI por 15 min. Posteriormente a cada caja se le adicionó agua destilada estéril hasta saturar el soporte, y seguidamente se colocaron 15 semillas de maracuyá obtenidas de frutos maduros previamente desinfectadas con alcohol a 70% e hipoclorito de sodio al 1%. Se siguió un diseño experimental de bloques al azar en arreglo factorial con tres repeticiones por tratamiento, tomando como factores las cepas TCC-005 (comercial) y TCN-014 (nativa) de T. harzianum y tres concentraciones del inóculo (104, 104 y 108 conidios/mL). Cada unidad experimental fue inoculada con 1 mL de la suspensión de T. harzianum de la cepa y la concentración correspondiente; al tratamiento testigo (sin inocular) sólo se le agregó 1 mL de agua destilada estéril. Todas las cajas se mantuvieron en oscuridad a 28±2°C. Se realizaron observaciones diarias durante 15 d, registrando el número de semillas germinadas, considerando semillas germinadas aquellas cuya radícula alcanzó 2 mm de longitud.
A partir de los datos registrados se determinó el porcentaje de germinación (PG) expresado como el porcentaje total de semillas germinadas a los 15 d. A esta variable también se le llama capacidad de germinación. El índice de velocidad de germinación (IVG) se calculó de acuerdo a la fórmula propuesta por Brown y Mayer (1988):
donde: P = número de semillas germinadas; T = tiempo en que germinaron; y n = d del último control.
]]> El tiempo medio de germinación (TMG) se calculó de acuerdo con García, et al. (1982):
donde: x1, x2, x15 son las semillas germinadas en el d 1, 2,...15; d1, d2,... d15 son los días de incubación, y X15 es el número total de semillas germinadas en el d 15 cuando se realizó el conteo final de semillas germinadas.
Desarrollo de plántulas
Una vez evaluada la germinación, se tomaron cinco semillas de cada tratamiento y cada una fue sembrada a 1 cm de profundidad en recipientes con 250 g de suelo abonado con lombricompuesto previamente esterilizado en autoclave a 121°C con 15 PSI por 30 min. Después de trasplantadas las semillas al suelo, fueron inoculadas nuevamente con 4 mL de las suspensiones de 104, 106 y 108 conidios/mL de T. harzianum TCN-014 y TCC-005, respectivamente, y un testigo sin inocular. Las plántulas se mantuvieron en condiciones de invernadero con humedad relativa de 70-80% y temperatura de 31-34°C, donde el volumen de aire, luminosidad y ataque de plagas se encontraban controlados con riego diario por nebulización cada 30 min durante 10 s. Se utilizó un diseño de bloques completos al azar, con dos factores, conformado por las dos cepas, nativa y comercial, y las tres concentraciones del inóculo. Cada tratamiento contó con cinco repeticiones. Después de dos meses se registró el número de hojas verdaderas, se midió la altura, el grosor del tallo en la base y la longitud de la raíz con la ayuda de un metro, y se determinó el peso seco total de cada una de las plantas.
Para los dos experimentos se realizaron análisis de varianza y comparación de los promedios de tratamientos mediante la prueba de rangos múltiples de Duncan (P≤0,05) utilizando el paquete estadístico STATGRAPHICS plus versión 5.1.
Resultados y discusión
Germinación in vitro de semillas
Los datos obtenidos para el porcentaje acumulado de germinación diaria muestran que todos los tratamientos excepto TCC-005 104 (42,2%) incrementaron la germinación de las semillas de maracuyá, con valores que oscilan entre 64,4% y 93,3%, de semillas germinadas en comparación con el tratamiento testigo que presentó un porcentaje de germinación de 53,3% (Fig. 1). Los tratamientos TCN-014 106, TCN-014-108 y TCC-005-108 presentaron los porcentajes de germinación (PG) más altos, con valores de 93,3%, 91,7% y 91,1% respectivamente, y diferencia estadísticamente significativa (P≤0,05) en comparación con el tratamiento testigo, de acuerdo con la prueba de rangos múltiples de Duncan (Tab. 1). Este resultado muestra un mayor efecto estimulador de la germinación a mayor concentración del inóculo para la cepa comercial, y un efecto similar de la cepa nativa a concentraciones de 106 y 108 conidios/mL, indicando además que con una concentración más baja del inóculo de la cepa nativa se obtienen resultados similares a los presentados al aplicar una concentración mayor de la cepa comercial.
Resultados similares fueron reportados para semillas de café tratadas con T. harzianum (ingrediente activo del producto comercial Tricho-D) donde se obtuvo 90% de germinación en comparación con 70% en el tratamiento testigo (Castro y Rivillas, 2005). Estos resultados concuerdan con los reportes sobre la producción de factores de crecimiento (auxinas, giberelinas y citoquininas) por T. harzianum, los cuales son liberados al medio y estimulan la germinación y los desarrollos de las plantas (Altomare et al., 1999; Valencia et al., 2005).
Los valores del IVG para todos los tratamientos fueron mayores con respecto al tratamiento testigo sin inocular (Tab. 1), lo que indica que semillas de maracuyá tratadas con T. harzianum germinan a mayor velocidad, con valores de IVG que van desde 1,25 hasta 2,62 con respecto al testigo, que presenta un IVG de 0,99, lo cual demuestra que T. harzianum TCN-014 y TCC-005, en concentraciones de 104,106 y 108, favorecen la velocidad de germinación. Sin embargo, únicamente la concentración de 108 conidias/mL presenta diferencia significativa (P0,05) con respecto al tratamiento testigo, de acuerdo con la prueba de Duncan, con valores medios de IVG de 2,62 y 2,28 para TCN-014 y TCC-005, respectivamente. Según estos resultados, se deduce que a mayor concentración de conidias de T. harzianum inoculado, mayor es la velocidad de germinación de las semillas.
El TMG indica el tiempo requerido para que germine 50% de las semillas. Los resultados muestran que el TMG para todos los tratamientos fue menor que para el tratamiento testigo, pero únicamente los tratamientos TCN-014 106 y TCN-014 108 presentaron diferencias significativas (P≤0,05), con un TMG de 6,5 y 6,0 d al compararlos con el testigo, que presentó un TGM de 9,1 d (Tab. 1). De lo anterior se deduce que la inoculación con la cepa nativa disminuyó el tiempo de germinación de las semillas de maracuyá, con respecto al control y a la cepa comercial. En concordancia, Besnard y Davet (1993) reportaron que semillas de pepino inoculadas con T. harzianum germinan en promedio dos días antes que aquellas sin inocular.
Los resultados demuestran que se alcanza mayor velocidad de germinación en la concentración de 108 para las dos cepas evaluadas, pero la concentración de 106 de la cepa nativa favorece un mayor número de semillas totales germinadas, y solamente la cepa nativa reduce el tiempo promedio de germinación, lo cual demuestra que, en conjunto, esta cepa presenta mejor comportamiento, hecho que puede ser atribuido a una mejor adaptación de la cepa nativa a las condiciones ambientales locales.
Desarrollo de plántulas
En la Tab. 2 se presentan los valores promedio para las variables evaluadas después de dos meses de la inoculación con las dos cepas de T. harzianum en las diferentes concentraciones. Los tratamientos TCN-014 106 TCC-005 108, y TCN-014 108, en su orden, presentaron mayores efectos sobre la longitud del tallo (LT) con diferencia estadísticamente significativa (P≤0,05), con respecto al control. Todos los tratamientos, excepto TCC-005 104, presentaron efecto positivo significativo sobre el grosor del tallo en la base (GTB), siendo TCN-014 106 el tratamiento con mejor efecto. Todos los tratamientos ocasionaron un efecto superior significativo sobre el número de hojas verdaderas (NHV) con respecto al control, siendo TCN-014 108 el tratamiento con mayor efecto, el número de hojas osciló entre 7-8 por plántula tratada y de 5 por plántula no tratada. Todos los tratamientos mostraron efecto positivo sobre la longitud de la raíz (LR), con mejores resultados para las plantas tratadas con TCN-014 108, TCC-005 108 y TCN-014 106, con incrementos de 89%, 73% y 63%, respectivamente, en comparación con el tratamiento testigo. Los tratamientos TCN-014 108, TCN-014 106 y TCC-005 106 y TCC-005 108 presentaron resultados significativamente superiores sobre el peso seco total (PST), con incremento de 210%, 125%, 125% y 117%, respectivamente, con respecto al control.
Los resultados anteriores concuerdan con reportes de varios autores que han señalado importantes incrementos en el crecimiento de plántulas inoculadas con T. harzianum. Por ejemplo, el aumento de la biomasa de plantas de fríjol Dandurand y Knudsen, 1993), plántulas de manzana más largas y vigorosas (Windham et al., 1986), incremento en la biomasa de plantas de tomate (Zambrano, 1989), mayor crecimiento del sistema radicular de plantas de maíz (Börkman et al., 1998) y mejor desarrollo de plantas de crisantemo, petunia, pimienta, tomate, lechuga, zanahoria, col, pepino, algodón, guisantes, fríjol, entre otras, tras la aplicación de un producto comercial a base de Trichoderma, llamado Promot Plus® (Trichoderma fungi, Promot growth, fight diseases). Igualmente, se puede inferir que los resultados benéficos de T. harzianum observados sobre el crecimiento de las plantas de maracuyá en el presente trabajo (Fig. 2) se deben posiblemente a la sumatoria de varias características reportadas previamente para diferentes aislamientos de esta especie en suelos cálidos tropicales, entre las cuales se puede mencionar su capacidad de producir ácido indolacético (Valencia et al., 2005), sustancia que favorece el alargamiento de las raíces permitiendo una mejor captura de nutrientes en el suelo por parte de la planta: la capacidad de transformar la materia orgánica del suelo y solubilizar fosfatos orgánicos e inorgánicos (Vera et al., 2002 y Godes, 2007), contribuyendo de esta manera a una mejor nutrición vegetal, y finalmente su efecto biocontrolador de fitopatógenos en el suelo, razón por la cual diferentes aislamientos han sido utilizados como ingrediente activo de diferentes bioprodutos comerciales para la agricultura en Colombia (Moreno et al., 2007).
Conclusiones
Además del efecto antagónico reportado contra F. oxysporum y F. solani, causantes de la secadera del maracuyá, por parte de las cepas nativa (TCN-0014) y comercial (TCC-005) de Trichoderma harzianum, estas cepas también tienen un efecto estimulador de la germinación in vitro de semillas de maracuyá, pero la inoculación con la cepa nativa mejora los resultados en porcentaje de germinación, aumenta la velocidad de germinación y disminuye el tiempo promedio de germinación hasta 3 d. Igualmente las dos cepas evaluadas promueven significativamente el desarrollo de las plántulas, con importantes incrementos en todas las variables evaluadas, sobresaliendo el efecto sobre la biomasa total y la longitud de raíces. Sin embargo, la cepa nativa presenta un efecto superior en todas las variables con respecto a la cepa comercial; este hecho indica la conveniencia de usar microorganismos locales para la elaboración de productos biofertilizantes, biopromotores o biocontroladores, dada su mejor adaptación a las condiciones climáticas y edáficas de la zona agroecológica donde se esperan aplicar en condiciones de campo. Por lo anterior se concluye que es pertinente avanzar en el desarrollo y la evaluación en campo de un bioproducto multifuncional para el control de hongos fitopatógenos y para promover el crecimiento y desarrollo del maracuyá en la zona bananera del Caribe colombiano.
Agradecimientos
Los autores del presente trabajo expresan sus agradecimientos a la Corporación Colombiana de Investigación Agropecuaria (Corpoica), Estación Experimental Caribia, donde se desarrolló la investigación, a la Compañía Envasadora del Atlántico (CEA) por la cofinanciación y a la Universidad Popular del Cesar, Valledupar.
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