Clemencia Guédez1, 3, Luis Miguel Cañizalez1, Carmen Castillo1 y Rafael Olivar2
1 Laboratorio de Fitopatología y Control Biológico, Núcleo Universitario Rafael Rangel, Universidad de Los Andes, Trujillo (Venezuela).
2 Escuela Técnica Agropecuaria Adolfo Navas Coronado, Ministerio de Educación, Trujillo (Venezuela).
3 Autor de correspondencia. cguedez@ula.ve
Fecha de recepción: 5 de febrero de 2009. Aceptado para publicación: 6 de noviembre de 2009
Los abonos orgánicos se vienen utilizando como ente supresor de enfermedades de la raíz de la planta, debido a la gran cantidad de microorganismos que interactúan en ellos, lo que ha llevado a considerarlos como parte de las estrategias de control biológico. En este contexto, se evaluó la diversidad de la micoflora de dos sustratos orgánicos (suelo orgánico y lombricompuesto) y su efecto sobre el control del hongo Rhizoctonia solani. La diversidad de la micoflora de los sustratos se determinó a través del método de dilución de placas de Warcup, que permitió contar el número de colonias e identificar los hongos. Los aislamientos más abundantes de cada sustrato fueron seleccionados para realizar cultivos duales con Rhizoctonia solani. Se encontraron 16 aislamientos de hongos pertenecientes a tres ordenes y ocho géneros, incluyendo (Penicillium sp., Aspergillus sp., Fusarium sp. y Trichoderma harzianum Rifai). En el lombricompuesto se encontró una micoflora significativamente más abundante (P≤0,05) que en el suelo orgánico. En los cultivos duales, T. harzianum presentó un porcentaje de inhibición de R. solani significativamente superior (P≤0,05) al del resto de los hongos. Con la incorporación del lombricompuesto no se introdujeron nuevos hongos, pero sí se incrementaron las poblaciones existentes en la micoflora nativa. T. harzianum resultó ser el hongo de mayor crecimiento y mayor porcentaje de inhibición, lo que sugiere que es un controlador biológico de R. solani, y que es factible incorporarlo al suelo durante la preparación del mismo.
Palabras clave: control biológico, antagonismo, hongos del suelo, lombricompuesto.
ABSTRACT
The use of organic manures for root disease control, which results from the remarkable diversity of microorganisms that interact there, has led to consider them as part of biological control strategies. In this context, we evaluated the mycological diversity of two organic substrates, (organic soil and vermicompost) and their effect on the control of the fungus Rhizoctonia solani. The mycoflora of the two organic substrates was assessed through Warcup's soil plate method, which allowed identifying the fungi and counting the number of colonies. The most abundant isolates were grown against R. solani in dual cultures. The results allowed identifying 16 isolates belonging to three orders and eight genera of fungi, including Penicillium sp., Aspergillus sp., Fusarium sp. and Trichoderma harzianum Rifai. A significantly more abundant mycoflora (P≤0.05) was found in the vermicompost substrate. In the dual cultures, T. harzianum attained a higher pathogen inhibition percentage (P≤0.05) than the other fungi. The vermicompost substrate did not determine the growth of new fungi, but enhanced the development of the pre-existing native ones. Not only having shown the best results in controlling R. solani, but also the most vigorous growth among the identified fungi, T. harzianum comes up as a promissory biological controller of the pathogen, that can be incorporated to the soil during its preparation.
Key words: biological control, antagonism, soil fungi, vermicompost.
Introducción
Las enmiendas orgánicas constituyen una fuente de carbono y otros nutrientes, lo cual favorece la actividad microbiana y mejora la estructura del suelo, creando así un medio adecuado para el crecimiento de las plantas. Sin embargo, la respuesta es variable y depende del cultivo, tipo de suelo, factores climáticos, prácticas de manejo y de las características del material utilizado (Cotxaterra et al., 2002).
Incorporar abonos orgánicos al agroecosistema provenientes de diferentes materiales vegetales y animales ha demostrado tener ciertos efectos supresivos hacia algunas enfermedades, debido a una situación especial de las poblaciones microbianas (Craft y Nelson, 1996; Hoitink et al., 1997; Hoitink y Bohem, 1999; Bulluck et al., 2002; Cotxaterra et al., 2002). Y muchos autores señalan que el fenómeno de supresión de patógenos de suelo por la adición de enmiendas orgánicas está asociado fundamentalmente al antagonismo ejercido por estimulación de la actividad microbiana y que, como tal, debiera ser considerado como un fenómeno de control biológico (Baker y Cook, 1974). El efecto de las enmiendas sobre la composición cualitativa y cuantitativa de la micoflora ha sido señalado como un indicador de la supresividad potencial de este método (Hoitink y Boehm, 1999; Dissanayake y Hoy, 1999).
El hongo Rhizoctonia solani Kühn es un hongo del suelo que se encuentra repartido por todo el mundo atacando a muchos cultivos, y forma parte de un conjunto de hongos que provocan el Damping off o caída de plántulas producto del estrangulamiento y necrosis del tallo en cuello en plantas recién germinadas. Durante mucho tiempo, su gran variabilidad impedía que se le atribuyese inequívocamente a ciertos hospedadores. Hoy se sabe de innumerables estudios que existen distintas razas clasificadas en grupos de anastomosis, debido a lo cual puede atacar a distintos cultivos. Este hongo se conserva en el suelo en forma de esclerocio o de micelio viviendo de la materia orgánica, y por su alto potencial saprófito puede sobrevivir en forma de micelio durante tres años. La actividad del hongo comienza cuando suben las temperaturas del suelo (>15°C). Después de desarrollarse en la superficie de la raíz, las hifas penetran el tejido vegetal por medio de enzimas que disuelven las paredes celulares (Wiese, 1987).
]]> Las pruebas de antagonismo se realizan a través del enfrentamiento del patógeno y el antagonista en una caja de Petri con medio de cultivo artificial, y tiene por finalidad determinar el crecimiento de ambos hongos, y al mismo tiempo se detectar alguna actividad antagónica, ya sea del tipo micoparasitismo, competencia por sustrato o antibiosis; es considerado un estudio preliminar que permite determinar si un aislamiento de un hongo tiene posibilidades como controlador biológico, realizando posteriormente pruebas in vivo para confirmar su potencial biológico.La diversidad microbiana como indicador de calidad del suelo ha sido muy discutido en la última década con el surgimiento de las técnicas de biología molecular (Johnson et al., 2003). Sin embargo, se le ha dado poca importancia a la cuantificación de la relación benéfica entre diversidad microbiana, funcionamiento del suelo y sustentabilidad del ecosistema (Kennedy y Smith, 1995). El fenómeno de supresividad de R. solani sobre poroto chaucha puede responder a la estimulación general de la micoflora más que al antagonismo de alguna cepa en particular (Nico et al., 2003).
La utilización de índices de diversidad puede funcionar como bioindicador de microorganismos en comunidades microbianas del suelo, que pueden obtenerse en medios de cultivo definidos (Atlas, 1984). El índice de diversidad asume que los individuos fueron muestreados al azar de una población indefinidamente grande y que todas las especies están presentes en la muestra (ecuación 1).
donde, pi es la proporción de individuos encontrados de la iésima especie. Este valor es estimado por ni/N, donde ni es el número de individuos de la especie i y N es el número total de individuos muestreados (promedios totales por hábitat).
En esta investigación se evalúa la diversidad de la micoflora de dos sustratos, y se determina el comportamiento antagónico in vitro de los hongos aislados con más frecuencia frente a R. solani.
Materiales y métodos
Micoflora del sustrato
El estudio de micoflora se realizó sobre dos sustratos (suelo orgánico y lombricompuesto) y dos muestras por sustrato (M1 y M3 para suelo orgánico y M2 y M4 para lombricompuesto), en la localidad de San Pablo, Valera, estado Trujillo (9°13"48' N; 70°40"15' W). El sustrato de suelo orgánico de la zona (materia orgánica [MO] 22,41%; pH 5,9; C/N 8,96; nitrógeno total [NT] 0,45%) y sustrato de lombricompuesto: producto del cultivo de lombriz californiana de suelo franco-arenoso, excremento de caballeriza y materia vegetal (pH 4,20; MO 30,45%; C/N 11,90 y NT 0,60%).
Los promedios obtenidos en los registros de número total de ufc e índice de diversidad fueron sometidos a Anova y separación de medias por Test de Tukey al 5% de significancia. Posteriormente se efectuó análisis de correlación entre abundancia total e índice de diversidad, por un lado, y los valores de índice de supresividad.
Cultivos duales de hongos presentes
En estos sustratos, se realizaron previamente ensayos donde se evaluó el efecto de T. harzianum sobre R. solani, observándose en este estudio que donde se aplicó T. harzianum como controlador no se presentó la enfermedad por R. solani en germinadores de tomate, y donde no se aplicó T. harzianum sin esterilizar el sustrato se presentó, lo que sugiere que existe la posibilidad de supresión de la micoflora presente en los sustratos.
De los hongos identificados del estudio de la micoflora se seleccionaron los aislamientos más abundantes en cada tratamiento y se realizaron estudios de antagonismo in vitro frente a Rhizoctonia solani. La técnica utilizada fue la de cultivos duales (Mariano, 1993): en cajas de Petri con PDA se "sembraron" dos discos de agar, uno con el patógeno y el otro con el antagonista, separados 5 cm entre sí. Las cajas se mantuvieron a temperatura ambiente a 27°C±1 durante 48 h y al cabo de las mismas se midió el desarrollo de ambas colonias para calcular el porcentaje de inhibición del crecimiento del patógeno según la ecuación 2 desarrollada por Camporota (1985).
donde:
I = porcentaje de inhibición del crecimiento del patógeno.
de = radio de la colonia del patógeno en el sentido del eje que enfrenta al antagonista. ]]>
Resultados y discusión
Estudio cualitativo y cuantitativo de la micoflora
Un total de 16 cepas diferentes fueron aisladas de los tratamientos pertenecientes a tres órdenes y ocho géneros de hongos, siendo Penicillium spp., Aspergillus spp., Fusarium sp. y Trichoderma harzianum las cepas más abundantes (Tab. 1). Las muestras de los sustratos presentaron diferencias significativas (P≤0,05) en cuanto a la abundancia total y la diversidad. Las muestras M2 y M4 del sustrato de lombricompuesto mostraron una micoflora significativamente más alta (P≤0,05) que la registrada en las muestras M1 y M3 del sustrato de suelo orgánico, que presentaron poblaciones significativamente menos abundantes que el resto de las muestras de los sustratos.
Los resultados de los índices de diversidad correspondientes a las poblaciones de hongos no exhibieron variabilidad con los valores de abundancia. Las unidades formadoras de colonias (ufc) de población microbiana aislada de las muestras del lombricompuesto (M2 y M4) resultó significativamente más alta en un 30% que las muestras (M1 y M3) del suelo orgánico (P≤0,05).
Las ufc identificadas resultaron diferentes para cada una de las muestras. Aspergillus spp., Penicillium spp. y Trichoderma sp. fueron los géneros que se presentaron con mayor abundancia en las muestras M1 y M3 en el suelo orgánico. En las muestras M2 y M4 del lombricompuesto se encontró a Aspergillus spp., Penicillium spp., Fusarium spp. como los géneros más abundantes. Ávila y Gutiérrez (2000), Budge y Whipps (2001) y Whipps (2001) sostienen que el conocimiento de relaciones ecológicas, como el parasitismo, la competencia y predación ha implicado la búsqueda y evaluación de diversos microorganismos del suelo cuyas estrategias de sobrevivencia les permiten controlar ciertas enfermedades radicales en cultivos hortícolas de importancia económica. La abundancia de los hongos saprofitos Penicillium spp. y Aspergillus spp. se debe a que son hongos que están asociados a las raíces de las plantas, alimentándose de exudaciones radicales, capaces de movilizar el fósforo y el nitrógeno del suelo (Atlas y Bartha, 1998). Según Booth (1971), Fusarium es un hongo ampliamente distribuido en el suelo y sobrevive en asociación con las plantas, posee especies patógenas como saprófitas y es específica para cada cultivo.
Cultivo duales de hongos presentes
Los hongos escogidos para este estudio fueron Aspergillus sp. (A1), Penicillium sp. (P2), Trichoderma sp., hongos más frecuente en las muestras del suelo orgánico M1 y M3; los más frecuentes en las muestras M2 y M4 del lombricompuesto fueron Penicillium sp. (P11), Aspergillus sp. (A22) y Fusarium sp. (F1). Sólo en la muestra M4 del lombricompuesto se encontró el hongo Rhizoctonia solani, debido al control previo con Trichoderma harzianum. T. harzianum presentó un porcentaje de inhibición significativamente superior (P≤0,05) al resto de las especies (Tab. 2). La cepa P1 de Penicillium y la cepa A22 de Aspergillus presentaron porcentajes medios de inhibición que no difirieron significativamente entre sí (P≤0,05), pero sólo Aspergillus sp. cepa A1 provoca inhibición a distancia. El resto de las especies muestra una capacidad antagónica significativamente inferior (P≤0,05). Fusarium sp. (F1) y Penicillium sp. (P11) presentaron un antagonismo débil, por lo cual cabe concluir que no son los responsables de la supresividad mostrada por el sustrato. En cambio Aspergillus sp. cepa A1, el hongo saprófito más abundante, exhibió in vitro una moderada capacidad antagónica.
La adición de un sustrato en particular determina el desarrollo preferencial de aquellas especies más adaptadas al consumo de la fuente de nutrición (Kwasna et al., 2000; Harman et al., 2004) y, a su vez, en el corto plazo, la conformación de poblaciones menos diversificadas. Lewis y Lumsden (2001), Cotxaterra et al. (2002) y Donoso et al. (2008) encontraron que el agregar enmiendas orgánicas al suelo controlaba hongos como Rhizoctonia solani, Fusarium oxysporum, Pythium ultimun y Sclerotinia sclerotiurum.
T. harzianum presentó un comportamiento apropiado en el estudio de antagonismo in vitro, si se considera el porcentaje medio de inhibición del patógeno. Por otra parte existen antecedentes exitosos referidos al control biológico de R. solani con T. harzianum (Elad et al., 1980; Chet y Baker, 1980; Lewis y Lumsden, 2001; Alonso et al., 2002; Ezziyyani et al., 2004; Osorio-Nila et al. 2005; Hoyos-Carvajal et al., 2008). Mónaco et al. (1994) y Alonso et al. (2002) interpretan que un buen comportamiento antagónico in vitro no alcanza predecir un control biológico en condiciones naturales, pero permite descartar ciertos factores como causa probable del fenómeno de supresividad. T. harzianum, además de capacidad biocontroladora, tiene una acción positiva como promotor de crecimiento vegetal, lo que lo convierte en bioproducto potencialmente efectivo.
Broadbent et al. (1971) y Harman (2000) sostienen que puede ocurrir que un antagonista de buen comportamiento in vitro funcione posteriormente mal en campo, pero nunca puede suceder que un agente que haya mostrado ser ineficiente en laboratorio se comporte bien en el terreno; allí radica la importancia de estos estudios in vitro.
Conclusiones
Agregar al suelo sustratos orgánicos no determinó la introducción significativa de nuevos hongos, sino más bien una modificación de la cantidad preexistente de la micoflora nativa y el establecimiento de Trichoderma harzianum.
Trichoderma harzianum resultó tener mayor velocidad de crecimiento en cultivos duales y un alto porcentaje de inhibición del hongo Rhizoctonia solani, lo cual confirma que este hongo controla efectivamente a Rhizoctonia solani, independientemente de la micoflora presente.
Literatura citada
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