Determinación de anticuerpos anti-β2 glicoproteína I en pacientes con síndrome antifosfolípido
ANTI-β2 GLYCOPROTEIN ANTIBODIES IN PATIENTS WITH ANTIPHOSPHOLIPID SYNDROME
ÁNGELA PATRICIA CADAVID JARAMILLO1; GLORIA PATRICIA GARCÍA OSPINA2; MARÍA LEONOR ÁLVAREZ PELÁEZ3; JUAN CARLOS QUINTANA ZAPATA4; RUTH BEATRIZ PEÑA ARBOLEDA5; JORGE HUMBERTO BOTERO GARCÉS6; ÓSCAR URIBE URIBE7
1. Médica, Magíster en Inmunología, Doctora en Ciencias
]]> 2. Bacterióloga, Magíster en Ciencias Básicas Biomédicas3. Bacterióloga, Especialista en Hematología
4. Bacteriólogo, Magíster en Ciencias Básicas Biomédicas
5. Bióloga
6. Médico, Magíster en Inmunología
7. Médico, Especialista en Medicina Interna-Reumatología
Grupo Reproducción-Biogénesis, Universidad de Antioquia. Servicio de Reumatología, Universidad de Antioquia, Hospital Universitario San Vicente Paúl.
Financiado: CODI y Grupo Reproducción-Biogénesis, Universidad de Antioquia
EL OBJETIVO DE ESTE ESTUDIO fue comparar la presencia de anticuerpos anti- β2glicoproteína I (anti-β2GPI) con las pruebas convencionales de laboratorio de anticuerpos anticardiolipina (aCL) y anticoagulante lúpico, y con las manifestaciones clínicas del síndrome antifosfolípido (SAF).
Se incluyeron en el estudio 80 mujeres con SAF; 35 de ellas de la consulta de Reumatología y las otras 45 con historia de aborto recurrente espontáneo (ARE); 5 mujeres de la consulta de Reumatología sin SAF, 27 mujeres con ARE, sin SAF y un grupo control de 20 mujeres sanas en edad reproductiva. Se investigaron la presencia de anticuerpos IgG e IgM anticardiolipina (aCL) e IgG anti-β2GPI por la técnica de ELISA, y el anticoagulante lúpico por la determinación del tiempo parcial de tromboplastina activado. Adicionalmente, se registraron las manifestaciones clínicas asociadas al SAF.
De las pacientes con SAF, 25.7% del grupo de Reumatología (9/35) y 4.4% de las pacientes con ARE (2/45) fueron positivas para anticuerpos anti- β2GPI, mientras que ninguna de las mujeres sin SAF, ni de las mujeres del grupo control, fue positiva. La asociación entre la presencia de anti-β2GPI y los anticuerpos IgG e IgM aCL mostró una diferencia significativa en los títulos de 3+ (altamente positivos) en contraste con los individuos negativos para anti-β2GPI. La positividad del anticoagulante lúpico también se correlacionó con la presencia de anticuerpos anti-β2GPI. No hubo diferencia significativa entre las diversas manifestaciones clínicas del SAF y la presencia de dichos anticuerpos.
En conclusión, la determinación de anticuerpos anti-β2GPI tiene una alta especificidad en pacientes con SAF pero no se asoció con ninguna manifestación clínica en particular.
PALABRAS CLAVE
ANTICUERPOS ANTI-β2GPI, ANTICUERPOS ANTICARDIOLIPINA, PÉRDIDA RECURRENTE DEL EMBARAZO, SINDROME ANTIFOSFOLÍPIDO, TROMBOSIS
SUMMARY
The objective of this study was to compare the presence of anti-β2 glycoprotein (anti-β2GPI) antibodies with the conventional laboratory tests of anticardiolipin antibodies (aCL) and lupus anticoagulant and with the clinical manifestations of the Antiphospholipid Syndrome (APS).
In this study 80 women with APS (35 from the Rheumatology Service and 45 with a history of recurrent spontaneous abortion, RSA) were included, as well as 5 women with rheumatic diseases but no APS, 27 RSA-women without APS and 20 healthy women in their reproductive age. The presence of IgG and IgM anticardiolipin antibodies (aCL), anti-β2GPI antibodies by ELISA method and lupus anticoagulant by the test of activated partial thromboplastin time was investigated. Additionally the clinical manifestations associated to APS were registered.
]]> In the group of women with APS, 25.7% (9/35) of those with rheumatic diseases and 4.4% /2/45) of the ones with RSA were positive for anti-β2GPI while none of the women without APS or the controls had such positive reaction. There was a significant association at titers of 3+ (highly positive) between the presence of anti-β2GPI antibodies and IgG and IgM aCL in contrast to anti-β2GPI-negative individuals. The positivity of lupus anticoagulant also correlated with the presence of anti-β2GPI antibodies. There was no significant correlation between any specific clinical manifestation and the presence of anti-β2GPI antibodies. In conclusion, the determination of anti-β2GPI antibodies was highly specific in patients with APS but did not associate with any clinical manifestation of the syndrome.KEY WORDS
ANTI-β2GLYCOPROTEIN I ANTIBODIES, ANTICARDIOLIPIN ANTIBODIES, ANTIPHOSPHOLIPID SYNDROME, RECURRENT PREGNANCY LOSS, THROMBOSIS,
INTRODUCCIÓN
EL SÍNDROME ANTIFOSFOLÍPIDO (SAF) se define como la presencia de anticuerpos antifosfolípidos asociada a una o varias manifestaciones clínicas como pérdida fetal recurrente, trombosis arterial o venosa, anemia hemolítica, trombocitopenia, livedo reticularis y mielitis transversa, entre otras; se plantea el diagnóstico de SAF primario cuando no se acompaña de ninguna enfermedad concomitante principalmente lupus eritematoso sistémico (1). En el Consenso Internacional de Sapporo en 1999, se redefinió el SAF y sólo se incluyeron las manifestaciones clínicas de trombosis y pérdidas fetales y no las manifestaciones dermatológicas o neurológicas diferentes a las resultantes de trombosis (2). Los títulos de anticuerpos anticardiolipina (aCL) y la determinación del anticoagulante lúpico han sido las pruebas de laboratorio más usadas en el diagnóstico del SAF.
Se ha reportado que los anticuerpos anticardiolipina detectados por la técnica de ELISA no reaccionan directamente contra el fosfolípido, sino que están dirigidos contra un cofactor, la β2glicoproteína-I (β2GPI), o contra el complejo fosfolípido/proteína. Estos anticuerpos reconocen la β2GPI unida a los fosfolípidos, por lo que se requieren ambos para formar el epitope que pueda ser reconocido por los anticuerpos (3,4); la β2GPI, al parecer, cambia la conformación del fosfolípido y lo hace antigénico (5). Algunos investigadores han planteado que los aCL no están dirigidos directamente contra la β2GPI, sino que reconocen los epitopes conformacionales inducidos por la unión de la β2GPI a los fosfolípidos, pero la evidencia de esta unión no excluye que exista un subgrupo de anticuerpos que reaccionan con una porción fosfolipídica del complejo β2GPI/fosfolípido (5,6).
La trombosis es una de las características definitorias del SAF; puede afectar arterias o venas intracerebrales, viscerales o periféricas, dando origen a las diferentes manifestaciones clínicas ya descritas (7). Se han propuesto varios mecanismos para explicar la trombosis asociada al SAF: el primero implica la activación de células endoteliales con el aumento en la expresión de moléculas de adherencia, de citoquinas y del metabolismo de las prostaglandinas; el segundo mecanismo se enfoca en el daño del endotelio vascular mediado por oxidantes principalmente por la lipoproteína de baja densidad oxidada que de alguna manera reacciona cruzadamente con los anticuerpos anticardiolipina; el tercer mecanismo tiene que ver con la interacción de los anticuerpos antifosfolípidos con algunas proteínas reguladoras de la cascada de la coagulación como la protrombina, la proteína C, la anexina V y el factor tisular (8).
El SAF se asocia también con diferentes alteraciones de la gestación que llevan a pobres resultados obstétricos como el aborto recurrente espontáneo (ARE), la muerte fetal y la preeclampsia (9-14). En el caso particular del ARE, se ha considerado tradicionalmente que la causa inmediata de muerte fetal en las gestantes con SAF, es la hipoxia debida al insuficiente flujo uteroplacentario de sangre. Estudios histológicos de placentas revelan una vasculopatía inflamatoria no trombótica de las arterias espirales maternas que produce infarto placentario (15); aunque no se conoce el mecanismo específico, se ha encontrado que los anticuerpos antifosfolípidos reducen los niveles de anexina V en las células endoteliales (16). Además se ha descrito otro mecanismo patogénico, no asociado a trombosis, que se define como una falla placentaria por interferencia de los anticuerpos antifosfolípidos (particularmente fosfatidilserina) con la fusión del citotrofoblasto para formar el sincitiotrofoblasto en la interfase maternofetal (17). Estos anticuerpos afectan además otras funciones trofoblásticas como la producción de la hormona gonadotropina coriónica humana y la invasión del trofoblasto (18). Posteriormente se demostró que también los anticuerpos anti-β2GPI pueden unirse a epitopes expresados por el trofoblasto y contribuir a la placentación defectuosa y a fallas en la implantación y el desarrollo (19,20).
]]> Adicionalmente se ha reportado que los anticuerpos aCL asociados con infecciones como sífilis o tuberculosis no están usualmente relacionados con trombosis y no reaccionan con la β2GPI, pero sí se unen a la cardiolipina. En contraste, los aCL derivados de pacientes con lupus e historia de trombosis, reconocen directamente la β2GPI unida a la cardiolipina. Esto ha permitido sugerir que la medición y la determinación de los subgrupos de anticuerpos antifosfolípidos unidos a la β2GPI tienen una relación más directa con los eventos trombóticos (21,22).Para evaluar la importancia de la determinación de los anticuerpos anti-β2GPI como herramienta diagnóstica y pronóstica de complicaciones en pacientes con SAF, se desarrolló este trabajo de investigación con el objetivo específico de comparar la presencia de anticuerpos anti-β2GPI con las pruebas de laboratorio convencionales de anticuerpos aCL y anticoagulante lúpico y con las manifestaciones clínicas del síndrome antifosfolípido.
MATERIALES Y MÉTODOS
Pacientes
SE INCLUYERON PACIENTES CON DIAGNÓSTICO de síndrome antifosfolípido definido como la presencia de anticuerpos anticardiolipina y/o de anticoagulante lúpico y los antecedentes de uno o más de los signos y síntomas asociados a dicho síndrome (trombosis arterial o venosa, trombocitopenia, livedo reticularis, anemia hemolítica, mielitis transversa, úlceras crónicas de los miembros inferiores, hipertensión pulmonar, accidente cerebrovascular y pérdidas gestacionales) (1). En este estudio se consideraron cinco categorías de pacientes: a) 35 mujeres de la consulta de Reumatología del Hospital Universitario San Vicente de Paúl (9 con SAF primario y 26 con SAF secundario a lupus eritematoso sistémico); b) 5 mujeres de la consulta de Reumatología que no tenían positividad de las pruebas de laboratorio para SAF (3 con lupus eritematoso sistémico y 2 con otros diagnósticos); c) 45 pacientes con historia de dos o más ARE remitidas al Grupo Reproducción de la Universidad de Antioquia y que tenían positiva alguna de las pruebas de laboratorio de SAF; d) 27 pacientes con aborto recurrente con las pruebas de laboratorio negativas para SAF y e) un grupo control de 20 mujeres, aparentemente sanas, sin signos ni síntomas asociados al SAF.
A todas las mujeres incluidas en el estudio se les hizo una encuesta con datos generales sobre manifestaciones clínicas asociadas al SAF; además se les preguntó por antecedentes personales de lúes, endocarditis bacteriana, valvulopatías cardíacas no infecciosas, tuberculosis y hepatopatías.
Toma de las muestras
Previo consentimiento informado escrito, se tomaron una muestra de 5 mL de sangre periférica en tubo sin anticoagulante para separar el suero y otra en un tubo con citrato de sodio para obtener plasma.
Determinación de los anticuerpos contra la Beta2-glicoproteína I
]]> La semicuantificación de la IgG contra β2GPI se realizó en el suero por el método de ELISA con el estuche comercial Quanta Lite tm (Inova Diagnostics, San Diego, California). Para el cálculo de los resultados se obtuvo el promedio de la densidad óptica de los duplicados de cada muestra y de los controles de la curva estándar y se analizó mediante una interpolación cúbica (cubic spline). La curva estándar tenía valores de 150; 75; 37.5; 19 y 9.4 unidades. Se incluyeron los controles de calidad especificados en el estuche comercial. Valores por encima de 20 U se consideraron positivos.Determinación de anticuerpos IgG e IgM anticardiolipina (aCL)
Estos anticuerpos se midieron en suero utilizando el estuche comercial de ELISA Quanta Litetm (Inova Diagnostics, San Diego, CA). El cálculo de los resultados se realizó de igual forma que para la β2glicoproteína-I y la curva estándar incluyó valores de 150; 75; 37.5; 19; 9.4 y 4.7 unidades.
Para la IgG, los resultados se interpretaron así: negativo (valores por debajo de 15.0 GPL); 1+ (levemente positivos, valores de 15.1 a 20 GPL); 2+ (moderadamente positivos, valores de 20.1 a 80 GPL) y 3+ (altamente positivos, valores por encima de 80 GPL).
La interpretación de los resultados para la IgM se hizo con la siguiente escala: negativo (valores por debajo de 12.5 MPL); 1+ (levemente positivos, valores de 12.5 a 20 MPL); 2+ (moderadamente positivos, valores de 20.1 a 80 MPL) y 3+ (altamente positivos, valores por encima de 80 MPL).
Determinación del anticoagulante lúpico
En el plasma pobre en plaquetas, se determinó el tiempo parcial de tromboplastina activado (TPTa) usando el estuche comercial Simplastin® (Organon Teknika), siguiendo las instrucciones del fabricante.
Análisis estadístico
El porcentaje de positividad de los anticuerpos en los diferentes grupos se comparó por la prueba de chi cuadrado y la asociación entre la positividad de los anticuerpos anti-β2GPI y los diferentes grados de positividad de los anticuerpos anticardiolipina, por un chi cuadrado de tendencia.
]]> RESULTADOS
Descripción de la población
Se estudiaron en total 80 pacientes con SAF, todas mujeres, de las cuales 35 tenían enfermedad reumatológica y 45, antecedente de pérdida gestacional a repetición. Las pacientes de Reumatología tenían un promedio de edad de 30 ± 8.13 (con un rango entre 11 y 41 años); el promedio de edad en el grupo de ARE fue de 29 ± 6.25 (de 17 a 41 años). En los otros grupos de estudio el promedio de edad fue de 33.4 ± 14 (de 17 a 50 años) en las 5 pacientes de Reumatología sin SAF y de 30.3 ± 5.4 (de 22 a 43 años) en el grupo de 27 mujeres con ARE sin SAF. El grupo control estaba conformado por 20 mujeres sanas en edad reproductiva con un promedio de edad de 29.9 ± 6.02 (de 22 a 43 años). No se encontró diferencia estadísticamente significativa entre las edades de los diferentes grupos.
Antecedentes clínicos de las pacientes de los diferentes grupos
De acuerdo con los datos obtenidos en la historia clínica y en la encuesta, se presentan los antecedentes clínicos relacionados con el SAF en los diferentes grupos de pacientes (Tabla N°1).
Frecuencia de los diferentes anticuerpos en los grupos de estudioa
En la tabla N° 2 se describe la frecuencia de los anticuerpos anti-β2GPI, IgG e IgM aCL y TPTa en los grupos con SAF y en el grupo control. En los otros dos grupos, Reumatología y ARE sin SAF, no se encontró ninguna paciente positiva para anticuerpos anti-β2GPI; ni, según sus características de inclusión en el estudio, tenían positividad para anticuerpos anticardiolipina ni para el anticoagulante lúpico. Se encontró diferencia estadísticamente significativa entre el grupo de Reumatología y los grupos de ARE y control, en los anticuerpos anti-β2GPI, IgM anticardiolipina y el TPTa (p<0.05). Para la IgG anticardiolipina se encontró diferencia significativa entre el grupo de Reumatología y el de ARE pero no entre el grupo de Reumatología y los controles. Se detectó diferencia significativa entre el grupo de ARE y el control para los anticuerpos IgM anticardiolipina, particularmente en los valores de 2+ (p<0.01); para los anticuerpos IgG anti-β2GPI, IgG anticardiolipina y TPTa no hubo diferencia significativa entre estos dos últimos grupos.
Asociación entre la presencia de los anticuerpos anti-β2GPI y los anticardiolipina (IgG e IgM).
Se analizó la asociación entre la presencia de anticuerpos anti-β2GPI y los diferentes grados de positividad de los aCL en las 11 pacientes positivas de los grupos de Reumatología y ARE y se encontró que a mayor nivel de anticuerpos anticardiolipina (3+), tanto IgG como IgM, mayor posibilidad de ser positivos los anticuerpos anti-β2GPI (p<0.05) (Figuras N° 1 y 2).
]]>
Asociación entre la presencia de anticuerpos anti- β2GPI y el anticoagulante lúpico.
La positividad del TPTa también se asoció con la presencia de los anticuerpos anti-β2GPI (p<0.05) (Figura N° 3).
Distribución de las manifestaciones clínicas en los individuos positivos para anticuerpos anti-β2GPI.
No se encontró diferencia significativa entre las diversas manifestaciones clínicas asociadas al síndrome antifosfolípido y la positividad de la β2GPI (Tabla N° 3).
DISCUSIÓN
La determinación de los anticuerpos anti-β2GPI discriminó a las pacientes de la consulta de Reumatología de las que tenían historia de ARE y del grupo control. La prueba tuvo una baja sensibilidad ya que sólo un 13.8% (11/80) de las pacientes con diagnóstico de SAF, con síntomas clínicos y pruebas de laboratorio, fueron positivas para anticuerpos anti-β2GPI, pero esta prueba fue muy específica ya que no se detectó en ninguna de las mujeres del grupo control ni en las mujeres con ARE o alteraciones reumatológicas sin SAF asociado. Una especificidad similar se encontró para la prueba de anticoagulante lúpico determinada por el TPTa. Por su parte, los anticuerpos anticardiolipina presentaron una especificidad más baja, particularmente la IgG que se encontró positiva en un 40% de las mujeres del grupo control sin diferencia significativa entre los diferentes grupos; excepto la positividad para la IgM anticardiolipina que sí presentó diferencia significativa entre los grupos. Sería importante comparar con otros estuches comerciales para la determinación de IgG anticardiolipina con el fin de descartar problemas con la técnica.
]]> La correlación entre la positividad de los anticuerpos anti-β2GPI y la de los anticuerpos aCL y el anticoagulante lúpico en el diagnóstico del SAF también ha sido descrita por otros autores (23- 27). Wasmuth y col. (26) sugieren que el uso de una sola de estas pruebas tiene la especificidad satisfactoria para confirmar la presencia del SAF. En pacientes con SAF, Samarkos y col. (25) encontraron que la correlación entre los anticuerpos anti-β2GPI y los aCL fue tanto para la IgG como para la IgM pero que en los pacientes con LES fue solo para la IgM.Dektov y col. (24) encontraron que la determinación de anticuerpos anti-β2GPI no identificó más pacientes con SAF que las pruebas convencionales de anticuerpos aCL y anticoagulante lúpico; recomendaron que no sean considerados como un sustituto de estas pruebas pero que su determinación podría ser importante en pacientes con títulos altos de anticuerpos aCL como indicadores de un peor pronóstico de la enfermedad. En una población pediátrica de 110 pacientes, Von Scheven y col. (28) encontraron también que los anticuerpos anti-β2GPI no mejoraron el diagnóstico de SAF cuando se los comparó con los ensayos tradicionales y que además eran los menos sensibles.
En un estudio realizado en mujeres con alteraciones obstétricas como ARE o muerte fetal inexplicada, Lee y col. (27) encontraron que la determinación de anticuerpos IgG e IgM anti-β2GPI tampoco identificaba pacientes con SAF, además de las que ya habían identificado los aCL. Discutieron los inconvenientes agregados que se pueden presentar en el diagnóstico de SAF al incluir la medición de anticuerpos anti-β2GPI, como la menor sensibilidad y el mayor riesgo de resultados falsos positivos con el consecuente incremento en los costos médicos. En una publicación posterior, estos mismos autores reportaron que los anticuerpos del isotipo IgA anti- β2GPI sí fueron útiles en el diagnóstico de SAF en este grupo de pacientes (29).
En la literatura se encuentran resultados contradictorios con respecto a la importancia de los anticuerpos anti-β2GPI en pacientes con ARE; mientras que algunos autores mostraron una relación entre estos anticuerpos (particularmente IgM o IgA) y las pérdidas recurrentes en mujeres con SAF (30), otros (31-34) no encontraron diferencias en los títulos de anticuerpos anti-β2GPI en estas pacientes. Adicionalmente, en las gestantes normales Katano y col. (35) propusieron el uso rutinario de la medición de anticuerpos anti-β2GPI, pero Faden y col. (13) sugirieron que estos anticuerpos no se deberían incluir en el seguimiento de los embarazos de bajo riesgo.
Los resultados de nuestro trabajo no mostraron asociación positiva entre la presencia de anticuerpos anti-β2GPI y el ARE; solo un 4.4% de las mujeres abortadoras con SAF fueron positivas para estos anticuerpos. En las pacientes con SAF de la consulta de Reumatología no se encontró asociación de estos anticuerpos con ninguna manifestación clínica en particular, pero sí se determinó su alta especificidad.
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Recibido: 16 de septiembre de 2004
Aceptado: 17 de noviembre de 2004
