Alvaro Rúa Giraldo^2,3; Victoria Sepúlveda¹; Angela Restrepo¹; Juan McEwen^1,4

1 Corporación para Investigaciones Biológicas. Sección de Biología Celular e Inmunogenética.

2 Estudiante de Maestría. Posgrado Ciencias Básicas Biomédicas.

3 Escuela de Bacteriología y Laboratorio Clínico, Universidad de Antioquia.

4 Facultad de Medicina, Universidad de Antioquia. mcewen@epm.net.co

INTRODUCCIÓN

La Paracoccidioidomicosis es una enfermedad crónica endémica de Latinoamérica causada por el hongo dimórfico P. brasiliensis. Poco se conoce sobre los factores que hacen virulento al hongo una vez en el hospedero, lo que hace necesario implementar sistemas de mutagénesis y tamizaje fenotípico que permitan identificar dichos factores y esclarecer los eventos que ocurren durante la infección.

La transformación genética facilitada por Agrobacterium tumefaciens permite introducir ADN exógeno en células vegetales y micóticas, convirtiéndose en herramienta valiosa en experimentos de mutagénesis dirigida. Recientemente este sistema ha sido empleado en P. brasiliensis (1).

OBJETIVOS

• Realizar la disrupción del gen de la glicoproteína antigénica de 43kDa de P. brasiliensis por medio de la transformación facilitada por A. tumefaciens.
• Evaluar por PCR, Southern blot y western blot, las colonias transformadas en busca de aquellas desprovistas del gen GP43 (knockout)

METODOLOGÍA

Cepas y plásmidos. A. tumefaciens LBA4404 (pAL4404) y GV3101 (pMP90) con los plásmidos AD1624 y AD1625 con secuencias promotoras (pCPC-1 o pGPD), terminadoras (tTRPC), genes de resistencia marcadores de selección (higromicina fosfotransferasa [HPH], ampicilina [Amp-R]), secuencias para transferencia e inserción en el genoma del hongo (región Ti, bordes derecho [right - RB] e izquierdo [left - LB]), sitios de restricción (HpaI y BglII) y fragmentos de aproximadamente 400pb de las regiones 5' y 3' del gen GP43 (figura 1). Los plásmidos serán introducidos en la bacteria por electroporación.

Procedimiento

Los cocultivos se harán en medio AB variando la relación hongo:bacteria. Los transformantes se seleccionaran en BHI con higromicina 200mg/ml. Su estabilidad mitótica se evaluará por repique continuo, la disrupción del gen por PCR y southernblot (2,3) y la producción de Gp43 por medio de western-blot e inmunodifusión en gel empleando sueros de pacientes con paracoccidioidomicosis.

RESULTADOS ESPERADOS

La eficiencia de transformación será mejorada y se obtendrán colonias mutantes para el gen GP43 (no productoras de la proteína).

CONCLUSIONES Las colonias knockout permitirán reconocer en futuros ensayos in vivo, el papel de esta proteína en la enfermedad; además, este sistema podrá emplearse en el estudio secuencial de otros genes del hongo, lo que favorecerá el conocimiento de la biología del hongo.

PALABRAS CLAVE

PARACOCCIDIOIDES BRASILIENSIS, AGROBACTERIUM TUMEFACIENS, DISRUPCIÓN DE GENES, GLICOPROTEÍNA DE 43KDA

1. LEAL C, MONTES B, MESA A, RUA A, CORREDOR M, RESTREPO A, McEWEN J. Agrobacterium tumefaciensmediated transformation of Paracoccidioides brasiliensis. Med Mycol (en prensa).

2. ABUODEH R, ORBACH M, MANDEL M, DAS A, GARGIANI J. Genetic transformation of Coccidioides immitis facilitated by Agrobacterium tumefaciens. J Infect Dis, 2000; 181: 2106-2110.

3. SULLIVAN T, ROONEY P, KLEIN B. Agrobacterium tumefaciens integrates transfer DNA into single chromosomal sites of dimorphic fungi and yields homokaryotic progeny from multinucleated yeast. Eukaryot Cell, 2002; 1: 895-905.