Los linfocitos: modelo de estudio en las enfermedades de Alzheimer y Parkinson

Lymphocytes as a cell model to study Alzheimer's and Parkinson's diseases

Marlene Jiménez Del Rio¹; Carlos Vélez–Pardo¹

1. Profesores Asociados, Facultad de Medicina, Departamento de Medicina Interna, Grupo de Neurociencias de Antioquia, Universidad de Antioquia, Medellín, Colombia

Este artículo fue financiado por el 'Comité para el Desarrollo & la Investigación–CODI–UdeA' proyecto #9805, 9835, 9961; Colciencias #1115–04–10231; y 'Proyecto de Investigación en Enfermedades Neurodegenerativas' #8780.

RESUMEN

Hasta el presente no existe un tratamiento eficaz y definitivo que reduzca o detenga el deterioro clinicopatológico que padecen los pacientes de estas enfermedades.

Por estas razones, los procesos bioquímicos comprometidos en la pérdida neuronal han sido esencialmente estudiados en modelos biológicos. Los autores de este artículo, basados en su propia experiencia y en la de otros investigadores, postulan a los linfocitos como modelo celular de estudio para dilucidar las señales moleculares intracelulares activadas por el estrés oxidativo (EO) en las enfermedades de Alzheimer y Parkinson. Sorprendentemente, los linfocitos poseen una similitud celular y bioquímica con las células nerviosas. De hecho, los linfocitos expresan por lo menos seis sistemas biológicos, considerados como pertenecientes únicamente a las neuronas, tales como los sistemas catecolaminérgico, serotonérgico, acetilcolinérgico, glutamaérgico, noradrenérgico, gabaérgico. Debido a que los linfocitos son células con ciclo celular en la etapa G0, y presentan los sistemas metabólicos de síntesis, transporte y procesamiento de las proteínas precursora del beta–amiloide (APP), presenilinas y parkina, estas células constituyen un modelo celular ideal que permitirá una mejor comprensión de la señalización patológica de los procesos neurodegenerativos, y además permitirá realizar un enfoque racional de los diseños terapéuticos que detengan las causas de deterioro neuronal en los pacientes que padecen estas enfermedades.

PALABRAS CLAVE: ALZHEIMER, APOPTOSIS, LINFOCITOS, MODELO, PARKINSON

SUMMARY

ALZHEIMER’S DISEASE (AD) AND PARKINSON’S disease (PD) are two common progressive neurodegenerative disorders that affect a large group of individuals in Antioquia, Colombia. Up till now, there is not an effective and definitive therapeutic treatment aimed to reduce or retard the clinic and pathologic symptoms induced by both devastating diseases. Thus, the biochemical mechanism(s) involved in neural loss has mainly been studied in biological models. In this article the authors, based on their own scientific experience and others, have proposed lymphocytes as a cellular model to study the molecular signalling mechanism induced by oxidative stress in AD and PD. Remarkably, lymphocytes and neurons are cellularly and biochemically alike.

Indeed, lymphocytes express at least six different biological systems such as catecholaminergic, serotonergic, acetylcholinergic, glutamatergic, noradrenergic and GABAergic systems considered to be exclusively pertain to neural cells!. Given that lymphocytes are post–mitotic cells (i.e. G0 cell cycle) and possess the synthesis, transport and processing systems of amyloid–beta precursor protein (AβPP), presenilins and parkin proteins, these cells constitute not only an ideal bio–model to better understanding of the pathological signalling in those neurodegenerative processes, but also represent a meaningful tool to design innovative and rational therapeutic strategies focussed to arrest the neuronal death in Alzheimer’s and Parkinson’s patients from Antioquia.

KEYWORDS: ALZHEIMER, APOPTOSIS, LYMPHOCYTES, MODEL, OXIDATIVE STRESS, PARKINSON

INTRODUCCIÓN

Patológicamente, la EAF se caracteriza por atrofia cerebral severa y por la presencia de cinco marcadores típicos: una marcada reactividad de la glía, despoblamiento neuronal, excesivo depósito de placas neuríticas (PN), de ovillos neurofibrilares (ONF), y de hierro.^4,5 Notoriamente, el principal componente de las PN es un fragmento proteico denominado beta–amiloide (Aβ [ 1–42 ] ). Este péptido se genera a partir del procesamiento proteolítico de la proteína precursora de β–amiloide (PPA) de 695/771 amino ácidos por la acción enzimática combinada de la β aspartil proteasa de membrana denominada BACE–1, (por su sigla en inglés β–site APP–cleaving enzyme), γ secretasas (complejo multiproteico compuesto de la proteína presenilina (PS), nicastrina (Nct), APH–1 (por su sigla en inglés anterior pharynx–defective phenotype), PEN–2 (por su sigla en inglés PSenhancer), las cuales generan además del fragmento Aβ1–42 amiloidogénico, un fragmento soluble PPAsβ y un dominio intracelular AICD (por su sigla en inglés APP intracellular domain) de función desconocida. Por otra parte, si la PPA es proteolizada por la acción combinada de las enzimas α(de la familia de metaloproteasas ADAM, por su sigla en inglés a disintigrin and metalloproteases) γ secretasas, no se produce el fragmento patogénico Aβ1–42, sino que se generan tres fragmentos: uno soluble PPAsα, un péptido p3 y el dominio intracelular AICD.^6,7

Hasta el presente, tres genes causales (presenilina–1 [ PS–1 ], presenilina–2 [ PS–2 ], APP) localizados en los cromosomas 14, 1, 21, respectivamente, y un gen de riesgo (apolipoproteína E, APOE) localizado en el cromosoma 22, han sido asociados con un depósito exagerado de Aβ [ 1–42 ] en el parénquima cerebral y en la vasculatura (angiopatía cerebral) en la EAF. Sorprendentemente, se han identificado 177 mutaciones en los tres genes⁸ (PS–2: 11 mutaciones; APP: 25 mutaciones; PS–1: 141mutaciones), de las cuales resulta la mutación en el exón 8 (cambio en el nucleótido 839 de una adenina por una citosina, gAa—>gCa) de la PS–1,⁹ y que codifica para la proteína (467 amino ácidos) mutada E280A (resultado de un cambio del residuo de ácido glutámico por una alanina en la posición 280). Infortunadamente, hasta el momento, el grupo familiar más numeroso del mundo con una mutación puntual en el gen de la PS–1 ha sido descrito en Colombia.^1,9

Efectivamente, se ha demostrado que la mutación E280A induce un incremento exagerado en la producción y acúmulo del Aβ [ 1–42 ] en el parénquima cerebral y en las paredes de los vasos sanguíneos, resultando en una lesión cerebral grave que lleva finalmente a un inicio clínico temprano o precoz (menos de 60 años) de la enfermedad.^10–14 Como resultado de estos cambios genético–moleculares, se prevé un aumento alarmante de nuevos casos de EAF en los próximos años. Por otra parte, la EPF se manifiesta en Antioquia como una enfermedad de Parkinson juvenil autosómica recesiva (EPJAR),² y se caracteriza clínicamente por la manifestación de movimientos lentos del cuerpo, rigidez muscular, temblor, pérdida del balance en la postura, y por su aparición temprana en sujetos menores de 40 años.¹⁵ Patológicamente, se caracteriza por una degeneración selectiva de las neuronas dopaminérgicas de la región pars compacta de la sustancia negra y por la presencia de abundantes depósitos de hierro.¹⁶ A diferencia de la EP esporádica, los pacientes que padecen EPJAR responden al tratamiento con L–DOPA, no presentan las típicas inclusiones eosinofilicas neurofilamentosas compuestas principalmente por la proteína α–sinucleína, denominados cuerpos de Lewis, y genéticamente se caracterizan por presentar una mutación en el gen de la parkina–2, que resulta de un cambio de una cisteína por una tirosina. Esta mutación es conocida como mutación paisa parkina–C212Y.^2,17

Estudios clínicos, patológicos y genéticos han aportado información importante para el conocimiento de estas dos entidades neurológicas,^{1,2,10–14,17} pero aún no se ha logrado establecer claramente cuáles son los mecanismos moleculares y patológicos de señalización celular que desencadenan la pérdida neuronal en el cerebro de los pacientes con EAF, EPF, o en los que tienen manifestaciones clinicopatológicas de ambas enfermedades. Además, aunque los pacientes de Alzheimer y Parkinson reciben tratamientos que mejoran sus manifestaciones clínicas, hasta el presente no existe una terapia eficaz y definitiva que reduzca o detenga el deterioro clinicopatológico que padecen los pacientes de estas enfermedades neurodegenerativas. Por estas razones, los procesos bioquímicos comprometidos en la muerte neuronal han sido esencialmente estudiados en modelos animales, en células primarias neuronales o en líneas celulares de origen neuronal o no neuronal. Por lo anterior, es imperativo responder a dos preguntas críticas: 1) ¿Cuáles son los mecanismos moleculares que inducen la muerte neuronal selectiva en las enfermedades de Alzheimer y Parkinson? 2) ¿Qué estrategias terapéuticas moleculares tempranas podrían implementarse para prevenir, retardar o interrumpir el impacto patológico en estas enfermedades?

UNA HIPÓTESIS + UN MODELO = UNA EXPLICACIÓN

Para responder a estas dos preguntas, la investigación científica dispone de dos procedimientos básicos: 1) Planteamiento de una hipótesis del fenómeno que se va a estudiar. De hecho, las hipótesis expresan lo que estamos buscando o tratando de probar y se definen como explicaciones tentativas del fenómeno investigado, formuladas a manera de proposiciones que relacionan dos o más variables (v. gr. EO y enfermedades neurodegenerativas) que se apoyan en conocimientos organizados y sistematizados y que deben ser sujetas a comprobación empírica y verificación en la realidad. 2) Selección de un modelo (in vivo, in vitro o in situ) que nos permita comprobar, verificar o rechazar dichas suposiciones o hipótesis, como primera aproximación explicativa del objeto observado. Finalmente, la experimentación y la compilación rigurosa de observaciones, nos permitirá formular una teoría, la cual es una explicación conveniente y convincente del mundo observable, que será aceptada como un hecho empleando un modelo de estudio.

Por definición, un modelo es una descripción simplificada (¡pero no simplista!) de la realidad. Se utiliza para propósitos de predicción y control, y nos permite mejorar nuestra comprensión de las características del comportamiento de la realidad estudiada de una forma más selectiva que si se la observara directamente. Específicamente, entendemos un modelo biomédico como un organismo unicelular o pluricelular que pueda reemplazar y/o representar total o parcialmente los aspectos fisiológicos o patológicos del ser humano, con la capacidad de aportar nueva información para comprender el funcionamiento normal o anormal desde un gen hasta un fenotipo, y poder alcanzar el objetivo final que es una intervención preventiva o terapéutica en las enfermedades humanas. Nótese, sin embargo, que para ser seleccionado un modelo biomédico no necesariamente debe ser una réplica exacta de una condición o enfermedad humana.

Durante los últimos años se han propuesto varias hipótesis con el propósito de explicar las causas de la pérdida neuronal de la región hipocampal y de la sustancia negra en los pacientes con Alzheimer y Parkinson familiares, respectivamente. De hecho, la hipótesis de mayor impacto y aceptación postula que estas enfermedades neurodegenerativas resultan de un proceso de (EO), definido como un desequilibrio entre la producción excesiva de especies reactivas de oxígeno [ ERO ] tales como el anión superóxido [ O^.2 ], el peróxido de hidrógeno [ H2O2 ], radicales de hidroxilo [ ^.OH ], y la disminución o ausencia de los sistemas celulares de respuesta antioxidante, sean enzimáticos o no enzimáticos, generado dicho EO por el péptido de Aβ1–42 en la EAF, o por alteraciones en la proteína parkina en la EPF, respectivamente. Es de anotar que, hasta el presente, no se han establecido completamente los mecanismos moleculares exactos que inducen la muerte neuronal en el sistema hipocampal, catecolaminérgico o serotonérgico. En este sentido, hemos presentado la hipótesis que en la EAF y la EPF intervienen cascadas de eventos de señalización moleculares y patológicos comunes inducidos por el EO.¹⁸ Por lo tanto, una terapia unificada podría beneficiar a los pacientes con Alzheimer y Parkinson. Con el fin de profundizar más en estos aspectos, nuestro grupo de investigación se ha propuesto los siguientes objetivos: 1) establecer los mecanismos moleculares de señalización de muerte inducidos por el EO generado por el dominio tóxico del Aβ[ 1–42 ], el fragmento Aβ[ 25–35 ], los metales (v. gr. hierro, cobre, manganeso, zinc), las monoaminas (dopamina, serotonina) y sus toxinas relacionadas (6–OHDA, 5,6 y 5,7–DHT); 2) establecer los mecanismos moleculares de señalización de supervivencia celular inducidos por moléculas de origen animal o vegetal (con capacidad antioxidante) contra el EO, para diseñar nuevas estrategias terapéuticas; 3) identificar mutaciones génicas (nuevas o establecidas) que puedan ser causales o modificadoras en los procesos de pérdida neuronal en los trastornos neurodegenerativos; 4) identificar biomarcadores de EO para realizar un diagnóstico precoz en los pacientes con EAF y EPF. Como modelo de estudio hemos seleccionado los linfocitos de sangre periférica (LSP) humana. Pero, ¿por qué los linfocitos?

LOS LINFOCITOS: UN MODELO NEURONAL

Si aceptamos que un modelo es por definición 'una descripción simplificada de la realidad…, [ que ] nos permite mejorar nuestra comprensión de las características del comportamiento de la realidad estudiada de una forma más selectiva que si se la observara directamente…, [ y que el modelo ] no necesariamente debe ser una réplica exacta de una condición o enfermedad humana para ser seleccionado…', este sería por sí solo un enfoque suficiente para dar una respuesta satisfactoria. Sin embargo, la selección de los linfocitos como modelo de estudio neuronal va más allá de la curiosidad o del simple gusto de los investigadores. De hecho, ¡nos deja sorprendidos la similitud celular y bioquímica de los linfocitos cuando se los compara con las neuronas! Por lo tanto, es clara por varias razones la justificación para postular los linfocitos como un modelo ideal de estudio del EO y la muerte celular en las enfermedades neurodegenerativas, y en especial de la EP. En primer lugar, los linfocitos y las neuronas presentan la misma maquinaria molecular que lleva a una morfología de muerte celular típica de apoptosis. Este tipo de muerte celular fue descrito por primera vez por Kerr y colaboradores en 1972,¹⁹ y ampliamente ilustrado utilizando linfocitos en 1995.²⁰ En este último estudio se muestran claramente, utilizando la técnica de microscopía electrónica, las características que definen hasta el presente la apoptosis: condensación y fragmentación de la cromatina en masas granulares uniformes bien definidas, condensación del citoplasma con preservación estructural de sus organelos, vacuolización del citoplasma y formación de vesículas con fragmentos de núcleo u organelos, denominados cuerpos apoptóticos. Naturalmente, la maquinaria molecular responsable de esta morfología apoptótica hace parte del programa de muerte, de tal suerte que los linfocitos fueron posteriormente utilizados para definir las características bioquímicas de la apoptosis. Es decir, la vía de muerte extrínseca, o dependiente de receptores (v.gr. FasL) y la vía de muerte intrínseca, o dependiente de la señalización desencadenada por despolarización mitocondrial. De hecho, estas dos observaciones (morfológica y bioquímica) han sido esenciales para explicar y describir la muerte neuronal.^21,22 En segundo lugar, las neuronas y los linfocitos son células postmitóticas en fase G0 en su ciclo celular. Es decir, estas células permanecen sin proliferar toda su vida funcional. En tercer lugar, aunque su origen embrionario es diferente –las neuronas provienen del ectodermo y los linfocitos, del mesodermo– se ha demostrado en estudios in vitro e in vivo que las neuronas pueden originarse por diferenciación de células madre mesenquimatosas provenientes de la médula ósea o de células madre hematopoyéticas.^23,24  En cuarto lugar, ¡los linfocitos despliegan al menos seis sistemas biológicos, considerados como pertenecientes únicamente a las neuronas!, y comparten otros sistemas con similar función (véase tabla).

Finalmente, los linfocitos presentan los sistemas metabólicos de síntesis, transporte y procesamiento de la APP,⁴⁸ expresan presenilinas,⁴⁹ y expresan la proteína parkina.⁵⁰ Adicionalmente, en los últimos años se han publicado aproximadamente 490 artículos científicos relacionados con diferentes aspectos de la biología celular y molecular de las enfermedades de Alzheimer y de Parkinson (búsqueda www.scopus.com, desde el año 1990 hasta el presente, 2005).

Por estas razones, consideramos que los linfocitos constituyen un excelente modelo para el estudio de los procesos moleculares de neurodegeneración inducidos por EO, extrapolables a condiciones neuropatológicas y comparables con investigaciones en modelos neuronales.

LOS LINFOCITOS: MECANISMOS DE SEÑALIZACIÓN MOLECULAR QUE EXPLICAN EL EO COMO AGENTE CAUSAL EN LAS ENFERMEDADES DE ALZHEIMER Y PARKINSON

En un trabajo previo publicado por Walkinshaw y Waters⁵¹ se demostró que la 6–OHDA inducía apoptosis en la línea neuronal PC–12. Este artículo, y una búsqueda cuidadosa en la literatura científica, nos indicaron que no existían reportes sobre los efectos tóxicos de la 6–OHDA, 5,6–DHT y 5,7–DHT en un modelo celular único. Por lo tanto, con el objetivo de ampliar el conocimiento con estos estímulos tóxicos in vitro, y aprovechando la posibilidad técnica de evaluar directamente la morfología celular normal y apoptótica con la tinción de viabilidad naranja de acridina/bromuro de etidio (NA/BE), inicialmente logramos evidenciar que concentraciones crecientes (50, 150, 250 µM) de las toxinas dopaminérgicas y serotonérgicas inducían apoptosis (10%, 50% y 78%, respectivamente, con 6–OHDA) en LSP. Este resultado nos condujo a determinar si el efecto apoptótico ocurría por un mecanismo específico intracelular y si este efecto era dependiente de los productos de oxidación (quinonas y ERO) de dichas toxinas. Efectivamente, empleando el inhibidor específico de transporte de monoaminas, la desipramina, y los antioxidantes como el ácido ascórbico, N–acetil–cisteína, 17β–estradiol, observamos una reducción de su efecto tóxico comparable al observado con LSP sin ningún tratamiento (<1% de índice apoptótico). Estos resultados claramente mostraron que la acción nociva de estos estímulos ocurría en el interior de la célula y que requería un proceso de oxidación.

Posteriormente, nos interesamos en investigar cuál era específicamente la especie reactiva de oxígeno generada durante el proceso de oxidación de estas neurotoxinas. De hecho, no fue una sorpresa encontrar que el H2O2 es la especie que mayoritariamente se genera en este proceso de oxidación, pero lo más interesante fue determinar cuál era la conexión entre el H2O2 y la morfología apoptótica. Para dar respuesta a esta pregunta realizamos cuatro experimentos básicos: 1) determinamos la cinética de producción de H2O2 por las tres toxinas y, simultáneamente, evaluamos la morfología de apoptosis; 2) inhibimos la acción de la proteasa caspasa–3, principal molécula ejecutora de muerte neuronal por apoptosis, utilizando el bloqueador específico Ac–DEVD–cho; 3) también bloqueamos la síntesis de proteínas y del mRNA, utilizando los inhibidores actinomicina–D y cicloheximida, respectivamente; 4) finalmente, utilizando la técnica de reconocimiento por immunohistoquímica, determinamos si los factores de transcripción como el factor nuclear kappa–B (por su sigla en inglés NF–κB), p53 y c–Jun estaban implicados como moléculas activas en el proceso de muerte programada. De acuerdo con este diseño experimental, logramos demostrar que la generación de H2O2 es concomitante con la morfología típica de apoptosis, y que esta depende de la activación de la caspasa–3.

Es de anotar que estudios reportados por McLlelan et al., (2003)⁵⁵ han corroborado nuestras observaciones. Esencialmente, estos investigadores han demostrado que las placas de Aβ in vivo en un modelo transgénico de Alzheimer y ex vivo a partir de tejido humano postmortem de Alzheimer eran capaces de producir radicales libres de oxígeno y H2O2.

Más aún, observaciones recientes en nuestro laboratorio mostraron la activación del NF–κB, p53, c–Jun y Par–4 en tejido postmortem (in situ) de pacientes con Alzheimer.⁵⁶ Interesantemente, también demostramos que (25µM) Fe²⁺ incrementa de dos a cinco veces el efecto tóxico del Aβ en un intervalo de 24 a 48 horas. Este incremento apoptótico resultó de la propiedad química del Fe²⁺ de potenciar el Aβ para la generación de ERO y la producción de radicales libres de oxígeno. Es de anotar que el efecto nocivo del Aβ en presencia del Fe²⁺ fue independiente de la activación de NF–κB, p53 y c–Jun.⁵⁴ Con estas observaciones logramos establecer un mecanismo operacional alternativo y modulado por el metal, en el cual, [ Aβ ] > H2O2 + Fe²⁺ > ERO > caspasa–3 > fragmentación nuclear = apoptosis. En conclusión, tomadas en su conjunto, estas investigaciones brindan una explicación del efecto nocivo de las neurotoxinas y del programa de activación molecular de muerte que se desencadena a partir de la molécula H2O2, en concordancia con las características típicas de la apoptosis. Es de resaltar que aunque la cascada de eventos moleculares inducida por las neurotoxinas y el Aβ presenta características bioquímicas comunes, no se había establecido una relación directa entre estos eventos moleculares (EO) y los factores genéticos. Este fue un objetivo que nos propusimos en la siguiente investigación.

Gracias a un estudio previo realizado por Pineda–Trujillo y colaboradores en Colombia (2001),² en el cual se había reportado una nueva mutación consistente en la sustitución de una cisteína por una tirosina en el codón 212 en el gen parkina–2, en individuos provenientes de dos grupos familiares diagnosticados con la enfermedad de Parkinson juvenil autosómica recesiva (PJAR), nos interesamos en determinar la relación entre los factores genéticos y el impacto del EO en la PJAR. Con este propósito, y dado que los linfocitos expresan el isoformo 3 de la parkina, proteína comprometida en la regulación y degradación de las proteínas no plegadas resultantes de un proceso de estrés, seleccionamos 3 pacientes homocigotos recesivos (C212Y), un paciente heterocigoto (C212Y/C), y cuatro individuos normales (C212C). Efectivamente, logramos establecer que la mutación C212Y causa un aumento en la sensibilidad o susceptibilidad de los linfocitos de los pacientes homocigotos recesivos al EO generado por los estímulos tóxicos de H2O2, Fe²⁺ y DA, comparados con linfocitos de pacientes heterocigotos o normales. Adicionalmente, evidenciamos que la DA induce apoptosis por cuatro vías moleculares alternativas, convergentes en la activación de la caspasa–3: 1) una vía dependiente del NF–κB; 2) una vía dependiente de la alteración directa de la mitocondria por exposición al H2O2; 3) por exposición a radicales de hidroxilo (OH); y 4) por incremento de las proteínas no plegadas inducidas por estrés.⁵⁷ Estos hallazgos muestran por primera vez que los factores genéticos, los ambientales y el Fe²⁺ contribuyen a la patogenia de la enfermedad de PJAR.

Curiosamente, el acúmulo de Fe²⁺ en el cerebro es una característica neuropatológica notable en la enfermedad de PJAR similar a la observada en la EAF y la EP. Evidentemente, esta característica sugiere que el Fe²⁺ juega un papel central en la patogénesis de estas enfermedades. Sin embargo, no se había dilucidado claramente si el Fe²⁺ constituye una causa primaria o secundaria en el deterioro neuronal en estas enfermedades; si la toxicidad del Fe²⁺ se debe a alteraciones en su metabolismo y/o cuál es su mecanismo de toxicidad. Por lo tanto, nos interesamos en investigar el mecanismo citotóxico del Fe²⁺ en el modelo de LSP. Adicionalmente, evaluamos otros metales tales como el Cu²⁺, Mn²⁺ y Zn²⁺ involucrados en otras enfermedades neurológicas. Con este propósito, expusimos LSP a concentraciones crecientes (50, 100, 250, 500, 1.000 µM) de estos metales. Usando el análisis morfológico con la tinción NA/BE, logramos observar que 500 µM de los metales provocan un porcentaje máximo de apoptosis (22–30%) y un porcentaje mínimo de necrosis (3–7%). Por otra parte, concentraciones menores de 500µM fueron inocuas, mientras que 1.000 µM provocaron principalmente necrosis (>40%). Estos resultados nos permitieron seleccionar la concentración de 500 µM para los siguientes experimentos. De hecho, esta concentración utilizada como estímulo deletéreo es comparable con los niveles de metales reportados in situ en las placas de los cerebros provenientes de pacientes con la EA (1mM Fe²⁺) y en la región de la sustancia negra de los cerebros de pacientes con la EP (13–15 µg de Fe²⁺/ por kilogramo de peso de tejido seco). Con este procedimiento experimental, evidenciamos por primera vez que los metales inducen apoptosis en LSP a través de la producción de H2O2 y radicales de hidroxilo (^.OH), los cuales causan despolarización mitocondrial, activación de la caspasa–3, y fragmentación nuclear independientemente de la activación de los factores de trascripción NF–κB y p53.⁵⁸ Estos datos sugieren efectivamente que los metales podrían constituir la causa primaria de los procesos neurodegenerativos en la EA y la EP, iniciada por una generación per se de H2O2 por los estados activos de óxido–reducción de los metales y OH formados por la reacción de Fenton (Fe²⁺ + H2O2 = Fe³⁺ + ^.OH + ^–OH). Estos hallazgos ilustran la importancia de los LSP como modelo de búsqueda para las estrategias antioxidantes que remuevan el H2O2 y el OH asociados a las reacciones catalizadas por metales en las enfermedades neurodegenerativas.

En resumen, estas investigaciones sugieren que las enfermedades de Alzheimer y Parkinson comparten un mecanismo común de señalización molecular de muerte neuronal y que el H2O2 es una molécula cardinal desencadenante del proceso neurodegenerativo. Actualmente, nuestra teoría titulada 'Mecanismo molecular unificado de EO en las enfermedades de Alzheimer y Parkinson', postula un posible escenario de los eventos fundamentales que llevan a apoptosis neuronal en estas enfermedades (véase figura).

Dado que hasta el momento no existen terapias efectivas contra estos trastornos neurológicos, se han investigado nuevas alternativas terapéuticas tales como el desarrollo de vacunas, la neuroprotección con factores de crecimiento y las moléculas derivadas de la botánica popular, entre otros. En este sentido, hemos demostrado que el 17β–estradiol^57,59 y la testosterona⁵⁷ protegen los linfocitos contra la muerte celular por apoptosis inducida por la combinación de dopamina y hierro. Recientemente hemos investigado el efecto citoprotector del factor de crecimiento insulínico–1 y los canabinoides como agentes moduladores en la señalización de supervivencia celular contra el EO estimulado por el Aβ(25–35), H2O2 y la dopamina.

En la literatura científica se reporta el IGF–1 y los canabinoides como moléculas neuroprotectoras contra el EO generado por el Aβ y el H2O2. Sin embargo, su mecanismo molecular de acción no se había establecido completamente. Aprovechando que los linfocitos expresan los receptores de IGF–1,^43,44 conocidos como IGF–1R y que expresan el receptor canabinoide 2 (CB2),⁴⁷ en condiciones experimentales análogas realizadas en trabajos previos, logramos demostrar claramente que el IGF–1⁶⁰ y los canabinoides⁶¹ desencadenan una cascada de eventos moleculares dependientes de sus receptores, que activan a su vez la proteína Akt/PκB, la cual está ligada a la activación (por fosforilación) de otras proteínas como el NF–κB (recordemos que en investigaciones previas habíamos asociado el factor NF–κB con apoptosis). ¿Cómo logra entonces este factor regular la decisión de muerte o supervivencia celular si transcribe simultáneamente señales evidentemente contradictorias, de muerte y de supervivencia?

Inicialmente pensamos que habría otras proteínas que interactuaban con el NF–κB, y que eran capaces de modular y/o regular su actividad transcriptora. Esta suposición resultó ser verdadera, y la respuesta a esta inquietud se dedujo de la observación que el NF–κB transcribe genes proapoptóticos y antiapoptóticos, los cuales, dependiendo de su relación numérica, deciden el destino de la célula. En otras palabras, si las proteínas proapoptóticas superan a las antiapoptóticas, el resultado será la muerte celular, y en el caso contrario el resultado será la supervivencia celular. Esta conclusión está sustentada por dos observaciones experimentales: en primer lugar, el factor NF–κB transcribe el gen p53, el cual a su vez transcribe genes proapoptóticos como Bax. En segundo lugar, la activación de la Akt/PκB no solo activa el NF–κB, sino que fosforila y activa la proteína Mdm2, la cual a su vez causa la eliminación de p53. De tal modo que esta última acción deja a las proteínas antiapoptóticas (Bcl–2) en cantidad numérica superior a las proteínas proapoptóticas (Bax), para evitar el colapso de la mitocondria y la muerte celular (véase figura, señal de supervivencia). No obstante, por procedimientos experimentales adicionales, logramos demostrar que los canabinoides no solo ejercen una acción citoprotectora contra el EO a través de la señalización del receptor CB2, sino que también son capaces de operar como moléculas antioxidantes, actuando directamente como barredores del H2O2.⁶¹

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Recibido: noviembre 28 de 2005

Aceptado: febrero13 de 2006