Sandra Milena Leal Pinto1, José Gregorio Hernández Barajas2, Leonor Yamile Vargas Méndez3, Vladimir V.
Kouznetsov2, Patricia Escobar Rivero1
1. Centro de Investigaciones en Enfermedades Tropicales CINTROP-UIS. Escuela de Medicina. Departamento de Ciencias Básicas,
Universidad Industrial de Santander. ]]>
RESUMEN
Introducción: La quimioterapia contra la leishmaniasis y la enfermedad de Chagas es inefectiva, condición que agrava el problema de salud pública que estas enfermedades tropicales representan. Objetivo: Determinar la actividad de nuevas N-bencil (2-furilmetil) cinamamidas en las formas libres e intracelulares de Leismania chagasi y Trypanosoma cruzi y en células Vero y THP-1. Materiales y métodos: Los parásitos y las células fueron tratados con diferentes concentraciones de los compuestos y su actividad fue determinada microscópicamente y por la prueba colorimétrica de MTT en el caso de los parásitos y células de mamífero, respectivamente. Los resultados de actividad fueron expresados como la concentración que inhibe o destruye 50% o 90% de los parásitos o células. Resultados: Las N-arilalquilamidas 1, 2 y 5 fueron activos en epimastigotes de T. cruzi con actividades entre IC50 3,71-38,81 μM y IC90 entre 50,87-59,87 μM. El compuesto 2 presentó actividad en amastigotes intracelulares de L. chagasi con IC50 77,76 μM. Las amidas preparadas no presentaron toxicidad en células THP-1 y solo el compuesto 4 fue parcialmente tóxico en células Vero (CC50 65,90 ± 5,71 μM). Conclusiones: La baja toxicidad presentada por los compuestos 1, 2 y 5 y la actividad antiparasitaria mostrada soportan el diseño de nuevas moléculas relacionadas para ser evaluadas en sistemas in vitro e in vivo contra estas enfermedades parasitarias. Salud UIS 2009; 41: 275-279
Palabras Claves: Leishmaniasis, enfermedad de Chagas, amastigotes intracelulares, citotoxicidad,
cinamamidas N-sustituidas
ABSTRACT
Introduction: The chemotherapy against leishmaniasis and Chagas disease is ineffective, a condition that is aggravating the public health problem caused by these tropical diseases. Objective: To determine the activity of new N-benzyl(2-furylmethyl) cinnamamides in the free and intracellular forms of Leishmania chagasi and Trypanosoma cruzi and Vero and THP-1 cells. Materials and methods: The parasites and cells were treated with different concentrations of the compounds and the activity was determined microscopically and MTT colorimetric test in the case of parasites and mammalian cells. Antiparasitic activity of tested compounds was expressed as the concentration that inhibits or destroys 50% or 90% of parasites and cells. Results: The N-arylalkylamides 1, 2 and 5 were active against T. cruzi epimastigotes with a range of activities between IC50 3.71-38.81 μM and IC90 between 50.87-59.87 μM. The compound 2 was active on intracellular amastigotes of L. chagasi with IC50 77.76 μM. The tested amides were not toxic to THP-1 cells; just only compound 4 resulted partially toxic on Vero cells (CC50 65.9 ± 5.71 μM). Conclusions: The low toxicity and the antiparasitic activity showed by the cinnamanide compounds 1, 2 and 5 support the design of new related molecules in order to be evaluated on in vitro and in vivo systems for these parasitic diseases. Salud UIS 2009; 41: 275-279.
Keywords: Leishmaniasis, Chagas disease, intracellular amastigote, cytotoxicity, N-substituted cinnamamides
INTRODUCCIÓN
Las N-arilalquilamidas, derivadas del ácido cinámico son compuestos orgánicos ampliamente distribuidos en la naturaleza. Son moléculas importantes por sus diferentes propiedades fisicoquímicas y farmacológicas, algunas presentando actividad antioxidante y anticonvulsiva1,2.
Recientemente se ha demostrado que algunos derivados inhiben la enzima 17-hidroxiesteroide deshidrogenasa obtenida del hongo fitopatógeno Cochliobolus lunatus. Esta enzima está relacionada con desordenes reproductivos, enfermedades neuronales y neoplasias en humanos3.
Las propiedades fisiológicas en las que se han visto relacionados este tipo de compuestos, crean interés en su evaluación contra microorganismos que afectan a los humanos. La Leishmania y el T. cruzi son protozoos intracelulares pertenecientes a la familia Tripanosomatidae y causantes de dos enfermedades tropicales transmitidas por vectores conocidas como la leishmaniasis y la enfermedad de Chagas. Estas enfermedades son endémicas en varios países de las regiones tropicales y subtropicales y responsables de cerca de 60000 muertes anuales, según reportes de la Organización Mundial de la Salud4.
No hay una vacuna y las opciones de tratamientos son pocas. Para leishmaniasis el tratamiento se basa en el uso de los antimoniales pentavalentes y en caso de falla terapéutica se utilizan anfotericina B, pentamindina, miltefosine y paramomicina5,6. El tratamiento de la enfermedad de Chagas se restringe al uso de dos medicamentos: el nifurtimox y el benznidazole, activos sólo en la fase aguda de la enfermedad7,8. Estos tratamientos presentan inconvenientes especialmente su toxicidad, y eficacia variable y dado que son aplicados en periodos prolongados muchos pacientes abandonan sus tratamientos9,10. Diferentes estrategias terapéuticas como la fototerapia, termoterapia, crioterapia, búsqueda racional de productos naturales activos, síntesis de nuevas moléculas químicas, entre otras, se están teniendo en cuenta para combatir los parásitos responsables de la leishmaniasis y la enfermedad de Chagas11,12.
]]> Tratando de encontrar nuevas moléculas con actividad antiparasitaria, en este trabajo se determinó la actividad de nuevas serie de cinamamidas N-sustituidas contra las formas libres e intracelulares de L. chagasi y T. cruzi y la citotoxicidad en células de mamífero.MATERIALES Y MÉTODOS
Síntesis
A una solución de ácido trans-cinámico (42,2 mmol) en tolueno anhidro (80 mL), se le adicionó el ácido bórico (5,0 mol %) y posteriormente la bencilamina (21,1 mmol); la mezcla obtenida se calentó a reflujo, utilizando una trampa de Dean-Stark, entre 5 y 9 horas dependiendo de la amina, hasta colectar un volumen de agua constante (cercano a la cantidad estequiométrica esperada). Esta información, junto al control por cromatografía en capa fina (CCF) señaló la finalización de la reacción. Luego se eliminó la mayor parte del disolvente. La precipitación de los productos deseados 1-5 se realizó por adición de n-hexano. Su purificación se efectuó mediante cromatografía en columna sobre alúmina, usando mezclas de acetato de etilo y éter de petróleo como eluyentes13.
Compuestos y medicamentos de referencia
Se evaluaron cinco derivados de las N-arialquilcinnamamidas (Figura 1). Como medicamentos de referencia se utilizaron el nifurtimox (donado por el Doctor Simon Croft, London School of Higiene and Tropical Medicine) y la anfotericina B (AmB, Sigma). Las soluciones madre de los compuestos fueron preparadas en dimetilsulfoxido (DMSO) 100 veces diluidas. Las soluciones de trabajo fueron preparadas en medio de cultivo antes de los experimentos.
Parásitos y células de mamífero
Los parásitos L. chagasi (MHOM/BR/74/PP75) y T. cruzi (cepa 320I01)14,15 fueron mantenidos en su forma libre de promastigotes y epimastigotes a 28°C. Los promastigotes de L. chagasi fueron mantenidos en medio de cultivo RPMI 1640 (Gibco) suplementado con hemina (Sigma), HEPES (Gibco) y 5% de suero bovino fetal inactivado con calor (SBFi, Gibco). Los epimastigotes de T. cruzi fueron mantenidos en medio de cultivo de LIT suplementado con 5% de SBFi y hemina.
Las líneas celulares de mamífero utilizadas en este estudio fueron células Vero (ATCC, TIB202y THP-1 (ATCC, CCL-81). Ambas fueron mantenidas en medio de RPMI 1640 suplementado con 5% de SBFi a 37°C, 5%CO2 y 95% atmosfera de humedad.
]]> Actividad antiparasitariaAmastigotes intracelulares de L. chagasi fueron obtenidos infectando células THP-1 con promastigotes en fase estacionaria y amastigotes intracelulares de T. cruzi fueron obtenidos infectando células Vero en monocapa con tripomastigotes de T. cruzi. En ambos casos se utilizó un radio de infección célula: parásito de 1:10 y la infección fue realizada durante 24 horas a 37°C, 5% CO2 y 95% atmósfera de humedad.
Los amastigotes intracelulares fueron tratados con concentraciones de 0,1-100 μM de los compuestos durante 5 días adicionando una segunda dosis al tercer día. Las células fueron fijadas con metanol, coloreadas con Giemsa y observadas al microscopio luz para determinar el porcentaje de infección en 300 células.
Actividad citotóxica en células de mamífero
Las células THP-1 transformadas con forbol miristato acetato (PMA, Sigma) a su fenotipo adherente y las células Vero en monocapa fueron tratadas con 5-300μM de los compuestos durante 3 días a 37°C, 5%CO2 y 95% atmosfera de humedad. Células controles fueron mantenidas sin compuesto. La citotoxicidad se determinó mediante el uso la prueba calorimétrica del MTT (3-(4,5-dimetiltiazol-2-ilo)-2,5-difeniltetrazol)). Las células fueron tratadas con la sal (5 mg/mL) por 4 horas y posteriormente los cristales reducidos de formazan disueltos en DMSO. Las placas fueron leídas en un lector de microplacas (Anthos2020) a una densidad óptica de 580 nm16. El porcentaje de toxicidad fue determinado por la siguiente fórmula: % de citotoxicidad = 1-(número de células del grupo tratado/ número de células del grupo control) x 100.
Análisis de resultados
Los resultados de actividad de los compuestos en los parásitos fueron expresados en concentraciones inhibitorias 50 y 90 (IC50 y IC90) y en las células de mamífero en concentraciones citotóxicas 50 y 90 (CC50 y CC90). Ellos fueron calculados utilizando el software de regresión sigmoidal Msxlfit™ (ID Business Solution, Guildford, UK). Los resultados fueron expresados unidades de μM y corresponden al promedio de dos experimentos con sus desviaciones estándar. El índice de selectividad (IS) fue calculado como el cociente de la CC50 sobre la IC50.
RESULTADOS Y DISCUSION
Preparación de las cinamamidas N-sustituidas ]]>
Preparación de una nueva serie de N-bencilcinamamidas 1-4 y N-(2-furilmetil)cinamamida 5 se logró mediante la condensación entre diversas bencilaminas (o N-2-furilmetilamina) y ácido trans-cinámico, empleando tolueno anhidro como disolvente y haciendo uso de las bondades catalíticas del ácido bórico (H3BO3) en procesos que conducen a la formación de amidas a partir de ácidos carboxílicos y aminas (Figura 1).El proceso de condensación (adición-eliminación) realizado se facilitó a través del poder catalítico del ácido bórico; un catalizador económico y además de escaso impacto ambiental. Los rendimientos alcanzados usando esta metodología superaron los previstos, encontrándose un rendimiento promedio cercano al 81%, destacándose el rendimiento cuantitativo para el proceso de condensación de uno de los derivados (compuesto 1). Todas las cinamamidas obtenidas son sustancias cristalinas, estables y de color blanco (Tabla 1).
Actividad biológica
Los resultados de actividad contra parásitos y células de mamífero se muestran en la Tabla 2. En los ensayos contra L. chagasi, la cinamida 3 mostró ser activo contra la forma de promastigotes de L. chagasi, sin embargo, fue inactivo contra la forma intracelular del parasito. El compuesto 2 inhibió amastigotes intracelulares de L. chagasi con actividad de IC50 77,76 μM, IC90 >100 e IS > 3,85.
En los ensayos contra T. cruzi, los compuestos 1, 2 y 5 inhibieron epimastigotes de T. cruzi con rangos de actividad de IC50 3,71-38,81 μM y IC90 entre 50,87-59,87 μM e IS >3 (datos no mostrados). Ningún compuesto fue activo en amastigotes intracelulares a la máxima concentración utilizada de100 μM. Esto podría deberse a varios factores uno de ellos, a la incapacidad del compuesto de se internalizado por la célula hospedera. Un compuesto activo contra las formas intracelulares de un microorganismo tendría que atravesar barreras celulares como la membrana plasmática y la del fagosoma (en el caso de Leishmania) diferente a lo que sucede en las formas libres de los parásitos donde el compuesto tendría un efecto directo sobre el parásito.
Los compuestos evaluados no fueron tóxicos para las células THP-1 (CC50 >300 μM). En las células Vero, el compuesto 4 fue parcialmente tóxico (CC50 65,90 μM, CC90>300).
A pesar del número reducido de moléculas evaluadas, los resultados encontrados son promisorios. Aunque la amida 2 mostró baja actividad en amastigotes intracelulares de L. chagasi con valores casi 300 veces mayores que el medicamento de referencia AmB, su actividad igual que la actividad presentada por los compuestos 1, 2 y 5 contra las formas libres de T. cruzi, soportan el diseño de nuevas moléculas relacionadas para ser evaluadas contra estos parásitos.
AGRADECIMIENTOS
Los autores agradecen a COLCIENCIAS por la financiación de este trabajo a través del grupo de excelencia CENIVAM (contrato No 432-2004) y a la Universidad Industrial de Santander. LYMM agradece a COLCIENCIAS por su beca.
CONFLICTO DE INTERES
]]> Los autores declaran no tener conflicto de intereses en la realización de este trabajoREFERENCIAS
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