Expresión de los receptores
hormonales (RE/RP) y sobreexpresión
de la proteína HER-2/neu en
carcinoma ductal infiltrante
Olga T. Anteliz B.1, Jaime O. Ayala1, Carlos A. Garcia2, Laura I. Valencia3, Olga M. Álvarez O.2
1. Departamento de Ciencias Básicas, Escuela de Medicina, Bucaramanga, Universidad Industrial de Santander.
2. Departamento de Patología, Escuela de Medicina, Bucaramanga, Universidad Industrial de Santander.
3. Centro de Investigaciones Epidemiológicas, Universidad Industrial de Santander.
Correspondencia: Olga T. Anteliz. Bacterióloga, Facultad de Salud, Departamento de Ciencias Básicas, Universidad Industrial de Santander, ]]>
RESUMEN
Introducción: El grado de diferenciación tumoral, la expresión de los receptores de estrógeno y progesterona y la sobreexpresión de la proteína HER-2/neu son factores de tipo pronóstico y predictivo importantes en la evolución y conducta terapéutica del carcinoma mamario infiltrante. Se ha encontrado en diversos estudios que los inmunofenotipos que no expresan los receptores hormonales o que sobre expresan la proteína HER-2/neu se asocian con pobre diferenciación tumoral. Objetivo: Determinar el perfil inmunofenotípico del carcinoma ductal infiltrante y establecer su relación con el grado de diferenciación tumoral. Metodología: Usando técnicas de inmunohistoquímica se determinaron los receptores de estrógeno (RE) y progesterona (RP), y la sobreexpresión de la proteína HER-2/neu en muestras de carcinoma ductal infiltrante y se identificaron sus fenotipos basados en la clasificación de Cheang. La variedad histológica y el grado de diferenciación tumoral en los carcinomas ductales infiltrantes fueron evaluados en tejido coloreado con hematoxilina-eosina. Resultados: Se incluyeron las muestras de 58 pacientes con carcinoma ductal infiltrante. El 15,5% de los carcinomas eran bien diferenciados, 63,8% moderadamente diferenciados y el 20,7% restante pobremente diferenciados. El inmunofenotipo triple negativo se presentó en 29,3% de las muestras, HER2+ en el 20,7%, luminal/ HER2+ en el 1,7%, luminal A en el 43,1% y ER-/PR+/HER2- en el 5,2%. Conclusión: En nuestro estudio, no se encontró asociación entre el grado de diferenciación tumoral y los inmunofenotipos. Salud UIS 2011; 43 (2): 149-158
Palabras Clave: Carcinoma ductal infiltrante, grado de diferenciación tumoral, receptores de estrógenos y progesterona, HER-2/neu
The susceptibility to infection by Leishmania panamensis and the
sensitivity to drugs differ according to the macrophage type
ABSTRACT
Introduction: The degree of tumor differentiation, the expression of estrogen and progesterone receptors and HER-2/ neu protein overexpressing are important prognostic and predictive factors in the evolution and therapeutic management of invasive breast carcinoma. In different studies were found that the immunophenotypes that do not express hormonal receptors or the HER-2/neu protein overexpressing have been associated with poor tumor differentiation. Purpose: To determine the immunophenotypic profile of invasive ductal carcinoma and establish its relationship with the histological grade. Methodology: Using immunohistochemistry were determined the estrogen receptor (ER) and progesterone (PR) and HER-2/neu protein overexpression in invasive ductal carcinoma samples and their phenotypes were identified based on classification of Cheang. The histological subtype and degree of tumor differentiation in invasive ductal carcinomas were evaluated in tissue stained with hematoxylin-eosin. Results: In this study were included 58 patients with invasive ductal carcinoma. 15.5% of the carcinomas were well differentiated, 63.8% moderately differentiated and the remaining 20.7% poorly differentiated. The triple-negative immunophenotype was show in 29.3% of the samples, HER2+ in the 20.7%, luminal/HER2 + in the 1.7%, luminal A in the 43.1% and the phenotype (ER-/PR+/HER2) in the 5.2%. Conclusion: In this study don't was found association between the degree of tumor differentiation and the immunophenotypes. Salud UIS 2011; 43 (2): 149-158
Keywords: Invasive ductal carcinoma, degree of tumor differentiation, estrogen and progesterone receptors, HER- 2/neu
El carcinoma de mama es una enfermedad cuya etiología es desconocida, presenta múltiples factores de riesgo; su clasificación, comportamiento clínico y respuesta al tratamiento varía de acuerdo con sus características morfológicas y moleculares, lo que hace complejo su manejo1.
Informes de la Agencia Internacional para la investigación sobre el cáncer registran una tasa de incidencia ajustada por 100.000 habitantes, de 37,4 en el mundo, 67,8 en países industrializados, 23,8 en subdesarrollados y de 30,3 en Colombia2. La tasa de 37,3 encontrada en el área metropolitana de Bucaramanga entre los años 2000 y 2004 supera las cifras nacionales e iguala la tasa mundial3.
Para definir los subtipos biológicos del cáncer mamario, Cheang et al4 utilizaron un primer esquema basado en la expresión de los receptores para estrógeno (RE) y progesterona (RP) y la sobreexpresión de la proteína HER-2/neu (Receptor tirosina quinasa), estableciendo los fenotipos triple negativo (FTN), HER2+, el luminal A y el luminal/HER2+, (Tabla 1). Con la posterior introducción de los biomarcadores para los receptores del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) y la citoqueratina 5/6 (CK5/6), se redefinió el FTN, creando un segundo esquema con dos nuevos fenotipos, el fenotipo basal (core basal) y el fenotipo quíntuple negativo (5NP). Para el presente trabajo se tuvo en cuenta el primer esquema de clasificación más un quinto perfil definido como RE-/PR+/HER2- en estudios realizados por William et al5, Kenneth Chu et al6 y Gerson et al7. La ausencia de expresión de los receptores hormonales y la sobreexpresión de la proteína HER-2/neu en los carcinomas ductales infiltrantes se ha relacionado directamente con los fenotipos de mal pronóstico (FTN y HER2+), los cuales se han asociado con mayor frecuencia de recurrencia, un patrón metastásico agresivo y alta mortalidad8.
Existen numerosos estudios que han intentado establecer factores pronósticos para el comportamiento clínico del carcinoma mamario teniendo en cuenta sólo parámetros morfológicos. Entre los métodos más utilizados encontramos el sistema de graduación histológica de diferenciación tumoral de Scarff Bloom Richardson, en el cual se evalúa la formación de túbulos, el pleomorfismo nuclear y el conteo mitótico. Cuando además de los criterios mencionados se tiene en cuenta la evaluación del estado de los nódulos linfáticos y el tamaño del tumor se determina el índice pronóstico de Nottingham (IPN)1.
El presente estudio busca establecer la relación entre el perfil inmunofenotípico del carcinoma ductal infiltrante de mama y el grado de diferenciación tumoral en muestras de pacientes con carcinoma mamario infiltrante, analizadas en el laboratorio del Departamento de Patología de la Universidad Industrial de Santander y Empresa Social del Estado Hospital Universitario de Santander (ESE–HUS) en el período comprendido entre julio del 2009 y marzo de 2011.
METODOLOGÍA
Diseño y población
Este es un estudio de corte transversal; en el que se incluyeron las biopsias de pacientes diagnosticadas como carcinoma ductal infiltrante en el Laboratorio de Patología de la Universidad Industrial de Santander – Empresa Social del Estado Hospital Universitario de Santander entre julio de 2009 y marzo de 2011.
Metodología ]]>
Las muestras incluidas en parafina fueron cortadas con un espesor de dos a tres micras. Una lámina fue coloreada con hematoxilina-eosina para la evaluación del grado de diferenciación tumoral basado en la escala de Bloom Richardson modificada por Elston y Ellis (Tabla 2). La confirmación del diagnóstico y grado de diferenciación tumoral fueron realizados por un médico patólogo. En el estudio inmunohistoquímico se utilizaron anticuerpos monoclonales de conejo SP1, SP2 y SP3 de la marca Neo Markers® para la evaluación de los receptores hormonales de estrógenos, progesterona y sobreexpresión de la proteína HER-2/ neu respectivamente. El procedimiento realizado en tres láminas, incluye desparafinación, recuperación antigénica con buffer citrato, bloqueo de peroxidasas endógenas y exógenas y revelado con diaminobenzidina. Las láminas fueron coloreadas, para obtener un contraste, con hematoxilina.La calidad de la técnica tanto para los receptores hormonales como para la sobreexpresión de la proteína HER-2/neu se evaluó mediante el uso de controles externos de inmunorreactividad conocida y como control interno para los receptores hormonales se utilizó el tejido epitelial no tumoral existente en cada muestra.
La lectura de las placas de inmunohistoquímica fue realizada por dos médicos patólogos, quienes para la valoración de los receptores hormonales contaron 500 células neoplásicas, tomadas de zonas representativas del tumor, en las cuales se determinó el porcentaje que presentaba inmunorreactividad nuclear, (Figura 1 y 2). Para el estudio de la sobreexpresión de la proteína HER-2/neu se evaluó la intensidad y distribución de la tinción en la membrana citoplasmática de las células tumorales, (Figura 3).
La interpretación de la sobreexpresión de la proteína HER-2/neu y los receptores hormonales se basó en los criterios establecidos en los consensos del 20079 y del 201010 respectivamente, publicados por The American Society of Clinical Oncology (ASCO) and the College of American Pathologists (CAP). (Tabla 3 y 4). A las muestras de aquellos casos donde la sobreexpresión de la proteína HER-2/neu fue equivoca (2+) se les evaluó la amplificación del gen c-erb B2 mediante la técnica de FISH (Fluorescence In Situ Hibridization) para esclarecer así, su resultado.
Una vez realizadas todas las evaluaciones, se definieron los inmunofenotipos basados en la determinación de los receptores hormonales y la sobreexpresión de la proteína HER-2/neu. (Tabla 1).
Se utilizó un microscopio Olympus CH30 en objetivo de 40X para la evaluación del sistema de graduación tumoral, la determinación de los receptores hormonales y la sobreexpresión de la proteína HER-2/neu.
Análisis estadístico
El estudio estadístico se realizó mediante un análisis descriptivo de las variables y algunas características de la población como la menarquia, tiempo de lactancia, edad del primer embarazo y número de partos. La prueba exacta de Fischer fue utilizada para buscar la asociación entre los inmunofenotipos y el grado de diferenciación tumoral.
RESULTADOS
Características de la población ]]>
Durante el período de estudio se evaluaron 58 pacientes cuyas edades oscilaron entre 29 y 81 años con promedio (X) de 55 años. La edad de la menarquia tuvo un rango de nueve a 18 años (X:13,22 y desviación estándar (DS) de 1,73); el tiempo promedio de duración de la lactancia fue de 17,94 meses (DS:13,24); en cuanto a la edad del primer embarazo el promedio fue de 22,37 años, con una mediana (M) de 21 y Rango intercuartilico (RIC) de 15 - 40 años; el número de embarazos (M:3, RIC: 2-5); el número de partos (M:3, RIC:2 – 4). Dentro de los antecedentes de existencia de neoplasias previas se encontró que una paciente presentó carcinoma de mama, otra presentó cáncer de cuello uterino y otra en cabeza.Inmunofenotipos y grado de diferenciación tumoral
El promedio de edad encontrado en las pacientes clasificadas por fenotipo es 54 años con rango de 37 a 76 años para FTN; 52 años con rango de 29 a 73 para el fenotipo HER2+; 57 años para el fenotipo luminal/ HER2+; 57 años con rango de 31 a 81 para el fenotipo luminal A y 51 años con rango de 41 a 58 años para el fenotipo (ER- PR+ HER2-).
Las variables en estudio se muestran en la Tabla 5, donde de acuerdo con la definición de los inmunofenotipos se observa que el 29,3% fueron FTN; 20,7% fenotipo HER2+; 1,7% fenotipo luminal/HER2+; 43,1% fenotipo luminal A y 5,2% fenotipo (ER-/PR+/HER2-).
Conforme a la evaluación del grado de diferenciación tumoral se encontró que el 15,5% fueron grado I; 63,8% grado II y el 20,7% grado III; de las nueve pacientes con grado de diferenciación tumoral I se tiene que el 22,2% son fenotipo triple negativo; 11,1% es fenotipo HER2+ y el 66,7% son fenotipo luminal A; en las 37 pacientes que presentaron grado de diferenciación tumoral II, el 29,7% es FTN; 16,2% es fenotipo HER2+; 2,7% es fenotipo luminal/HER2+; el 43,2% es fenotipo luminal A y el 8,1% es fenotipo (ER-/PR+/HER2-); de las 12 pacientes que presentaron grado de diferenciación tumoral III se encontró que el 33,3% es FTN; el 41,7% es fenotipo HER2+ y el 25,0% es fenotipo luminal A.
DISCUSIÓN
La edad promedio (55,0 años) registrada en el presente estudio es consistente con los hallazgos obtenidos por Jaramillo et al en Cali-Colombia11 cuya edad promedio fue de 55,3 años y con el Registro Poblacional de Cáncer del Área Metropolitana de Bucaramanga-Colombia (año 2007)3. Estos resultados se encuentran por debajo de los registrados (64,0 años) en la literatura de referencia12 y por encima de la edad promedio (49,9 años) de un estudio realizado en el Reino Unido por Rakha et al13.
En las muestras estudiadas el fenotipo de mayor frecuencia fue el luminal A con una presentación de 43,1%, seguido por el FTN con 29,3%, el fenotipo HER2+ con 20,7%, el fenotipo (ER-/PR+/HER2-) con un 5,2% y el fenotipo luminal/HER2+ con 1,7%. El fenotipo más frecuente fue el luminal A, al igual que lo descrito por Bhargava et al14 y Gerson et al7 con reportes del 55% y 47,3% respectivamente.
El hallazgo del fenotipo HER2+ en la población de estudio es semejante a lo establecido por Perou et al22 con un 20-30%; Owens et al23, quienes encontraron un 20%, y Gerson et al7 con un 22,7%, pero superior al registrado por Bhargava et al14 quienes sólo reportaron un 13%.
Las cifras obtenidas para el fenotipo luminal/HER+ son menores que los encontrados en estudios como el de Bhargava et al donde fué del 5%14 y en el de Rakha et al13 donde correspondieron al 12,7%, esta diferencia puede atribuirse al tamaño de la muestra. Caso similar se evidenció para el fenotipo (ER-/PR+/HER2-) cuyos datos son inferiores al 14,5% registrado en el estudio de Gerson et al7.
]]> El hallazgo obtenido en nuestra investigación para el FTN (30,8%) dobla en cantidad los datos de los estudios de Bhargava et al 14 y Gerson et al7 quienes registran un 15,6% y un 15,4% respectivamente y los expuestos en la revisión de Foulkes15 quien determinó su presencia entre el 12 y el 17%. Nuestros hallazgos son similares a los encontrados por Díaz et al21 en una población similar a la nuestra dela ESE-HUS donde se evidencia que el FTN es de 28,57%.Al analizar nuestros resultados de FTN se puede pensar que este hallazgo podría estar afectado por la sensibilidad y la especificidad de los clones usados. La ASCO/ CAP, en el consenso del 201010, recomiendan que para la determinación de los receptores de estrógenos se deben utilizar los clones 6F11, 1D5, ER.2.123+1D5 o SP1, siendo este último el usado en este estudio. En la determinación de los receptores de progesterona sugieren el uso de los clones 1294, 1A6 y 312; el clone SP2 utilizado en este estudio no se encuentra listado dentro de los recomendados, sin embargo Huang Zhida et al 16 y Cano et al17 realizaron estudios (n=107 y n= 40 respectivamente) comparativos entre los clones 1A6 y SP2, concluyendo que el clone SP2 presenta una sensibilidad y especificidad equiparable con el clone 1A6 recomendado por la ASCO/CAP.
La ASCO/CAP en el consenso del 20079 propone el uso de los clones A085 (anticuerpo policlonal-Hercep test-Dako) y el clone CB11 (anticuerpo monoclonal) para la determinación del HER-2/neu). El estudio de Hanley et al18 en 52 casos estableció una concordancia de 94,1% entre el SP3 y el FISH, resultados similares a de Wludarski y Bacchi (n=179), quienes también compararon el clone SP3 con el del Hercep Test encontrando concordancias similares con el FISH de 94,6% y 95.1%, respectivamente19 mientras que el estudio realizado por Nassar et al en 52 casos refiere una concordancia similar (93,8%) entre el SP3 y el FISH pero de 46.9% entre el Hercep Test y el FISH20|. Un hallazgo importante establecido por Wludarski es la ventaja del SP3 sobre el Hercep Test en su poder discriminatorio (72,1% contra 34,1%)19. Por todo lo anterior, asumimos que los clones usados en nuestro trabajo para la evaluación de los biomarcadores PR y HER-2/neu son equivalentes a los sugeridos por el consenso dada su sensibilidad y especificidad.
La técnica usada en los procedimientos podría haber afectado los resultados de nuestra investigación, y para asegurar la calidad de las mediciones, se usaron controles externos de inmunoreactividad conocida, los cuales fueron satisfactorios en todos los casos evidenciando una calidad óptima de las mediciones.
Las anteriores consideraciones y la consistencia de nuestros resultados con los de Díaz et al, nos llevan a pensar que el alto porcentaje del FTN obedece a una característica propia de la población evaluada, por lo que se hace necesario la realización de estudios complementarios con otros biomarcadores como EGFR y CK 5/6.
El grado de diferenciación tumoral describe las diferencias microscópicas que presentan las células tumorales respecto de las células normales de un mismo tejido en apariencia y función. Su determinación es importante porque establece el pronóstico del paciente y orienta la conducta terapéutica, al igual que lo hace la expresión de los receptores de estrógenos y progesterona y la sobreexpresión de la proteína HER-2/neu.
En la literatura se ha relacionado la buena diferenciación tumoral con la expresión casi invariable de los receptores de estrógenos y la pobre diferenciación con desarrollo de metástasis, evento que empeora el pronóstico1.
En nuestro estudio se identificó el grado de diferenciación tumoral II como predominante en los fenotipos determinados y no se estableció una asociación entre éstos y el grado de diferenciación tumoral (prueba exacta de Fischer p=0,541).
Rakha et al, en su revisión de 20101 refieren que los carcinomas mamarios que presentan grado de diferenciación tumoral III, tienden a ser recurrentes y a hacer metástasis en los 8 años subsiguientes al diagnóstico y aquellos carcinomas bien diferenciados presentan un mejor pronóstico. En el metaanálisis realizado por Desmedt et al8 se concluye que el FTN y el fenotipo HER2+ están asociado a un mal pronóstico. En otro estudio por Rakha et al13 realizado en 1944 casos se describió una asociación entre el FTN y un mayor tamaño tumoral, pobre grado de diferenciación tumoral, mayor recurrencia, menor supervivencia y patrón metastásico agresivo. En nuestro estudio la mayoría de los fenotipos triple negativo (11/17) y HER2+ (6/12) presentaron grado de diferenciación tumoral II, sin embargo 2/17 pacientes con FTN y 1/12 paciente con fenotipo HER2+ presentaron grado de diferenciación tumoral I.
Los fenotipos relacionados con buen pronóstico son los que expresan los receptores hormonales y su grado de diferenciación tumoral es bueno o moderado12. En este estudio, los fenotipos luminal/HER2+, luminal A y (ER-/PR+/HER2-) presentaron en su mayoría grado de diferenciación tumoral II.
]]> AGRADECIMIENTOSNo se encontró asociación entre los inmunofenotipos y el grado de diferenciación tumoral en las muestras estudiadas.
Los hallazgos obtenidos del FTN en la población estudiada, generan una hipótesis alrededor de una frecuencia del FTN que podría ser superior a la registrada en la literatura y crean un interrogante acerca de los factores que podrían estar influyendo en este aparente incremento.
Es necesario incluir en el análisis de futuros estudios las condiciones pre analíticas del proceso: la manipulación del tejido en sala de cirugía, el control de los tiempos de isquemia caliente y frío, la inmersión inmediata del tejido en la sustancia fijadora, la técnica de procesamiento de la muestra en el laboratorio para garantizar la adecuada preservación antigénica, especialmente en el caso de lumpectomías, cuadrantectomías y mastectomías, el uso del formol tamponado al 10%, y el manejo de los tiempos adecuados para la fijación entre 6-72 horas.
AGRADECIMIENTOS
A la Universidad Industrial de Santander y al Comité de la Maestría de Ciencias Básicas Biomédicas, personal del Laboratorio de Patología de la UIS, Laboratorio de Patología del Hospital Universitario La Samaritana de Bogotá, área de Estadística y Unidad Oncológica del Hospital Universitario de Santander, a las diferentes Instituciones de Salud de la ciudad, Laboratorio de Patología de la UNAB.
CONSIDERACIONES ÉTICAS
Para la realización del presente estudio se obtuvo aprobación del comité de ética de la Universidad Industrial de Santander así como el consentimiento por parte de las pacientes involucradas. Desde el punto de vista bioético, el presente trabajo de investigación se fundamenta en los principios establecidos en la Declaración de Helsinki proclamada por la Asociación Médica Mundial24 y en la Resolución 8430 de 1993 expedida por el Ministerio de Salud de Colombia25.
CONFLICTOS DE INTERÉS
Declaramos no tener conflicto de intereses pertinentes que puedan influir en los resultados de este artículo.
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