Empleo de la técnica hibridación
in situ fluorescente para
visualizar microorganismos
Raúl Rodríguez Martínez1
1. Grupo de Recursos Naturales. Facultad de Salud. Universidad de Pamplona, Norte de Santander, Colombia
Correspondencia: Raúl Rodríguez Martínez. Bacteriólogo y Laboratorista Clínico, MSc, PhD. Grupo de Recursos Naturales.
Docente de la Facultad de Salud. Universidad de Pamplona. Dirección: Pamplona (N.S) Ciudadela Universitaria, Km. 1 vía
Bucaramanga. Teléfono: 3186938622. Correo electrónico: rrodriguez@unipamplona.edu.co
Recibido: 22 de Agosto de 2011- Aceptado: 3 de Septiembre de 2011
La hibridación in situ fluorescente (FISH), es una técnica que emplea sondas de oligonucleótidos marcadas con fluorocromos las cuales van dirigidas hacia secuencias específicas del ácido ribonucleico ribosomal (ARNr), lo que permite la identificación rápida y específica de células microbianas ya sea que estén como células individuales o se encuentren agrupadas en su ambiente natural. El conocimiento de la composición y distribución de los microorganismos en los hábitats naturales, proporciona un soporte sólido para comprender la interacción entre las diversas especies que componen el micro hábitat. El objetivo de la revisión es presentar la forma como ha evolucionado la hibridación, el empleo del ARNr como molécula diana, los tipos de marcaje, los marcadores fluorescentes empleados hoy en día, la metodología, así como las mejoras que se le han hecho a la técnica FISH al emplearse en conjunto con otras técnicas en la identificación microbiana. Salud UIS 2011; 43 (3): 307-316
Palabras Clave: FISH, sonda de oligonucleotidos, ARNr, diagnóstico microbiano, fluorocromo, hibridación
Use of fluorescence in situ hybridization
technique to visualize microorganisms
ABSTRACT
Fluorescence in situ hybridization (FISH), is a technique that uses oligonucleotides probes labeled with fluorochromes which are directed to specific sequences of ribosomal ribonucleic acid (rRNA), this allows the rapid and specific identification of microbial cells whether as individual cells or grouped cells in their natural environment. Knowledge of the composition and distribution of microorganisms in natural habitats provides a solid support to understand interaction between different species in the microhabitat. This review shows how hybridization has evolved, the use of rRNA as target molecule, the type of labeling, the labeled uses today in fluorescent and the methodology, as well as the improvements that have been made to the FISH technique when is used in conjunction with other techniques in microbial identification. Salud UIS 2011; 43 (3): 307-316
Keywords: FISH, oligonucleotides, probes, rRNA, microbial diagnostic, fluorochromes, hybridization
INTRODUCCIÓN
Uno de los objetivos primordiales que se tienen en cuenta al momento de realizar el diagnóstico microbiano, es lograr la identificación en tiempos cortos y a la vez con gran precisión de los organismos que se encuentran presentes en su ambiente natural. Los métodos tradicionales basados en el aislamiento del microorganismo en medios de cultivo, muchas veces necesitan de periodos largos de incubación así como el empleo de medios complejos y enriquecidos, sin que en ocasiones reflejen la población exacta o la mezcla de las comunidades bacterianas presentes en el microhabitat1,2.
]]> El análisis microscópico usando tinciones como Gram o Ziehl Nelsen, tienen la ventaja de ser técnicas rápidas y económicas, permiten la visualización directa y proporcionan características básicas de la bacteria al proveer información de la estructura de la pared celular. Sin embargo, debido a la escasa diferencia morfológica que se presenta entre familias bacterianas, estos métodos de coloración microbiológica no permiten una adecuada identificación, además requieren que el microorganismo se pueda cultivar en el laboratorio.Con la llegada de técnicas moleculares como la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) y sus diferentes variantes, se facilitó la detección rápida y sensible de casi cualquier organismo independiente de si estos pudieran ser o no cultivados. Aun así, estos métodos no dan información acerca de la morfología, número, distribución espacial o el microambiente en el que se desarrolla el organismo3. Otro método de detección ha sido mediante técnicas de inmunofluorescencia que utilizan anticuerpos monoclonales específicos para cada especie. Sin embargo, esta técnica es difícil de implementar por las uniones inespecíficas que se presentan, a la vez que depende de la variación y expresión de antígenos fenotípicos y así mismo, el tamaño del anticuerpo puede limitar el acceso del antígeno a los tejidos o biopelículas4,5.
En contraste con los métodos expuestos, la identificación empleando la técnica de FISH combina la precisión de la genética molecular, con la información visual de la microscopía, lo cual permite la identificación y visualización de la célula microbiana individual dentro de su microhabitat natural o tejido en el que se encuentre presente6,7.
Es necesario destacar que la visión de la sistemática microbiana ha cambiado debido al análisis comparativo de secuencias homólogas de ácidos nucleicos, en especial de moléculas de ARN ribosomal (ARNr) y los genes que ellos codifican8. Desde su primera aplicación como "tinción filogenética" en 1989, nombre que se dio a la técnica en la que se empleaba la sonda de oligonucleótidos marcada con un reactivo fluorescente y dirigida hacia la molécula de ARNr 16S, se ha constituido en una herramienta de uso común para la identificación directa de células bacterianas individuales, independientemente de si puedan o no ser cultivadas9.
Esta revisión se enfoca hacia los desarrollos metodológicos de FISH mostrando las diversas formas que se marcan las sondas de ADN que van dirigidas hacia una zona específica del ARNr, así mismo los tipos de fluorocromo existentes, los pasos a tener en cuenta al realizar la técnica de hibridación, y el empleo de FISH junto con otras técnicas.
Bases moleculares de la hibridación
La hibridación se basa en la unión de dos cadenas sencillas de ácidos nucléicos que da origen a estructuras de doble hebra, las cuales pueden ser híbridos ADN-ADN, ARN-ARN (ambos homodúplex) ó ADNARN (heteroduplex). El apareamiento se da por la complementariedad de bases a través de los puentes de hidrógeno que se forman entre adenina–timina (ADN) o uracilo (ARN) y citosina-guanina (ADN y ARN)10 (Figura 1).
En las técnicas de hibridación se parte de dos moléculas de ácidos nucléicos: una homogénea de secuencia conocida que actúa como sonda y la otra heterogénea de secuencia desconocida, la cual contiene la secuencia diana que se quiere detectar. Para visualizar si existe hibridación una de las dos cadenas debe estar marcada. Si se marca la sonda, la hibridación es estándar, pero si lo está la molécula diana, la hibridación es reversa.
Los ácidos nucléicos de partida son de cadena sencilla, pueden proceder de ADN clonado y fragmentado por enzimas de restricción, o mediante oligonucleótidos sintéticos. La hibridación puede producirse en medio líquido o sobre un soporte sólido, como nitrocelulosa, al que se encuentra unida una de las dos poblaciones de ácidos nucléicos. Como se comentó antes, las técnicas de hibridación se utilizan a menudo para detectar una molécula diana partiendo de una sonda complementaria a ella. A raíz de esto, muchas técnicas moleculares están basadas en la hibridación, entre ellas la PCR (reacción en cadena de la polimersa) o las tecnologías Northern Blot, Southern Blot, microarrays de ADN, screening de genotecas o la hibridación in situ10.
]]> HistoriaCon el desarrollo de marcadores fluorescentes, los marcadores radioactivos fueron sustituidos por colorantes no isotópicos15. En 1989, DeLong y su equipo de trabajo emplearon oligonucleótidos marcados con fluorocromos para detectar células microbianas crecidas de manera individual9. Comparada con las sondas radiactivas, las sondas fluorescentes son seguras, tienen mayor resolución y no necesitan ningún paso adicional para su detección. Además, las sondas fluorescentes se pueden marcar con colorantes de diferente emisión de longitud de onda, permitiendo de esta manera detectar varios tipos de sondas en un mismo experimento16.
ARN ribosomal como molécula diana para FISH
Las bacterias y arqueobacterias contienen ARNr de 5S, 16S y 23S, con tamaños de aproximadamente 120, 1500 y 3000 nucleótidos respectivamente. En microbiología la molécula diana más usada para FISH es el ARNr 16S, debido a que se puede encontrar en todos los organismos vivos, es relativamente estable y presenta un elevado número de copias, generalmente algunos miles por célula y además contiene regiones tanto variables como muy conservadas17.
El incremento de secuencias del gen ARNr 16S que aparecen en las bases de datos ha facilitado la identificación por FISH de la mayoría de microorganismos, especialmente cuando se quiere identificar poblaciones microbianas que no se pueden cultivar8-18. El alto número de copias del gen ARNr 16S en cada replicación y en células metabólicamente activas, ofrecen suficientes moléculas diana que permiten visualizar células bacterianas individuales, aun cuando se encuentren formando parte de una asociación.
Las bases de datos publicas incluyen la secuencia del ARN 16S de la mayoría de las especies microbianas cultivadas, así como de muchas secuencias aisladas directamente del ambiente19,20. Las secuencias del gen ribosómico se pueden consultar libremente en bases especializadas, como por ejemplo la del laboratorio europeo de biología molecular (EMBL), el RDP The Ribosomal Database Project o el GenBank que es la base de datos de secuencias nucleotídicas del NCBI. Por otra parte, se han realizado trabajos los cuales muestran la factibilidad y las limitaciones del análisis comparativo de secuencias ARNr 16S y del diseño de sondas del ARNr21, además del empleo de ARNr 23S22,23, del uso del gen ribosómico 18S24,25 y recientemente del ARNm, que también ha sido detectado exitosamente por FISH26,27.
Sondas y marcaje
En la selección de sondas para FISH se debe considerar la especificidad, la sensibilidad y la facilidad para penetrar los tejidos. Una sonda típica de oligonucleótidos presenta entre 15-30 bases de longitud y se construye en un sintetizador automatizado. Un ejemplo es la sonda universal EUB 338, que es específica para la mayoría de células del dominio bacteria (5'-GCTGCCTCCCGTAGGAGT-3')28.
Hay diferentes vías de marcaje (Figura 2). La marcación directa con fluorescencia, es la más común y también la vía más rápida, económica y fácil, ya que no requiere ningún paso adicional para su detección luego de la hibridación29. Una o más moléculas teñidas con el compuesto fluorescente son unidas directamente al oligonucleótido, tanto químicamente durante la síntesis a través de uniones amino al extremo 5' de la sonda (Figura 2a) o enzimáticamente usando transferasas terminales que se unen al extremo 3' del nucleótido (Figura 2b)29.
]]>
En la detección indirecta, la sensibilidad de FISH se incrementa al unir la sonda a moléculas como digoxigenina (DIG), la cual es luego detectada por un anticuerpo fluorescente (Figura 2c)30. De igual manera, el empleo de enzimas amplifican la señal y por ende la sensibilidad del FISH. En este caso, los oligonucleótidos son marcados con peroxidasa de rábano picante (HRP) que usa fluoresceína tiramida (TSA) como sustrato (Figura 2d). Probablemente la técnica más sensible sea el uso combinado de sondas de polirribonucleotidos marcados con digoxigenina y TSA (Figura 2e), ya que se ha encontrado que la TSA incrementa entre 10-20 veces la intensidad de la señal31,32.
Marcadores fluorescentes
El uso de fluorocromos de diferente longitud de onda de excitación y máxima emisión permite la detección simultánea de dos o más microorganismos, para esto se debe contar con un microscopio que permita observar los diversos espectros de colores del FISH. El empleo combinado de fluorocromos debe tener picos de emisión en los que no se presente solapamiento de espectros entre las sondas. Los marcadores que sean más fotoestables se deben usar en muestras con baja cantidad de sitios diana.
Dentro de los marcadores más usados en FISH para estudios microbiológicos (Tabla 1), están los derivados de la fluoresceína, fluoresceína isotiocianato (FITC) y 5-(6) carboxifluoresceina-N-hidroxisuccimida ester (FluoX). De los derivados de la rodamina se encuentran la tetrametil rodamina isotiocianato (TRITC) y el rojo Texas.
Entre los colorantes de cianina de amplia longitud de onda están Cy5.5- Cy7, los cuales son excitados en la región roja del espectro (675 nm) y emiten en el rojo lejano (760 nm). Existen además fluoróforos de la familia Alexa fluor y partículas de cristal nanométricas llamados "puntos cuánticos" que son ampliamente utilizados, estos fluoróforos permiten observar un brillo intenso y son más fotoestables33,34.
La selección de un sitio específico del gen ARNr, el diseño de la sonda así como el tipo de marcaje se debe realizar con especial cuidado porque de esto depende en parte, la calidad de la hibridación y la visualización de las células. Generalmente las sondas son diseñadas empleando la información de la secuencia de las bases de datos mediante paquetes informáticos como el ARB35, o el sistema SILVA el cual da información actualizada de secuencias de ARNr de los dominios Bacteria, Archaea y Eucaria20.
Aspectos metodológicos de FISH
Un protocolo típico para FISH incluye 4 pasos: fijación y permeabilización de la muestra, hibridación, lavado y la detección de las células marcadas mediante el uso del microscopio de epifluorescencia o confocal (Figura 3).
Las condiciones de fijación y permeabilización pueden variar dependiendo del organismo y del tipo de muestra o de tejido. Aunque la permeabilización es un paso crucial para obtener resultados satisfactorios a veces resulta difícil de optimizar y está sujeto al tipo de célula microbiana o muestra donde se encuentre presente. En general el empleo de formaldehído o paraformaldehido entre un 3-4% (v/v) es suficiente para la mayoría de bacterias Gram negativas. Para organismos Gram positivos se recomienda el empleo de etanol (50%), etanol-formalina (9:1 v/v), el tratamiento con calor28, o el empleo de lisozima y/o lisostafina37.
Previo a la permeabilización, las muestras deben ser puestas en láminas de vidrio, y con el fin de mantener una adherencia adecuada y que no se desprendan durante el procesamiento, se recomienda cubrir la superficie con ciertos compuestos como gelatina, Poly-L.lisina38 o hidruro de silicio (IV)29. Cuando se trabaja con suspensión de células microbianas, una vez fijadas y colocadas en la lámina de vidrio, se dejan secar al ambiente y luego son deshidratadas en soluciones crecientes de alcohol (50-70-96%) lo cual ayuda a permeabilizar las células.
Al emplear FISH en cortes de tejidos, los pretratamientos se aplican para incrementar el acceso de la sonda al objetivo específico y disminuir las uniones a los sitios no específicos39. En cortes realizados en tejidos incluidos en parafina, primero se debe realizar el procedimiento de des-parafinado empleando xileno y alcohol40. Además, se puede realizar un pre-tratamiento empleando proteinasa K para tejidos con parafina o para cortes en frío41, o cuando se trabaja con muestras ambientales, se puede utilizar la mezcla de de lisozima y proteinasa K42.
Se ha usado la técnica de FISH en tejidos que han sido incluidos en cierto tipo de resinas poliméricas en las cuales se obtiene una excelente conservación histológica, así como una eficiente visualización de las células sin que se requiera de ningún pre-tratamiento de digestión43,44.
Hibridación
La hibridación es la capacidad que tiene la sonda de ADN para aparearse, unirse y formar moléculas de cadena doble. En este paso se requiere de un tampón de hibridación el cual de manera estándar contiene NaCl 5 M, Tris / HCl 1 M, Formamida, agua destilada y SDS al 10% 45. La muestra fijada se incuba en el tampón que contiene la sonda marcada, sometida a calentamiento y cuando la temperatura alcanza el punto de fusión del ácido nucléico, la sonda de oligonucleótidos de interés la cual está marcada con un fluorocromo, se une a la secuencia escogida del ARNr. La temperatura varía para los diferentes organismos, dependiendo sobre todo del contenido en pares guanina-citosina, G-C, que son los que confieren mayor estabilidad a la molécula27.
En el procedimiento de FISH, la hibridación se realiza en la oscuridad en una cámara húmeda, con temperaturas entre 37°C a 50°C y con tiempos que oscilan entre 30 minutos y varias horas. La hibridación se puede llevar a cabo bajo condiciones astringentes para obtener un óptimo anillamiento, en este caso, el tampón de hibridación es precalentado y luego es aplicado a la muestra que contiene la sonda marcada. El nivel de astringencia se puede ajustar variando tanto la concentración de formamida o la temperatura de hibridación45.
La función que cumple la formamida es debilitar las uniones de hidrogeno de los duplex ADN-ADN y ADNARN, permitiendo de esta manera que se pueda bajar la temperatura de anillamiento al incrementar el nivel de astringencia29. La formamida reduce la Tm entre 0.6- 0.72°C por porcentaje utilizado, así mismo, reduce el ruido de fondo en la hibridación. En la hibridación de micro ARN (miARN) en vez de la formamida con el cual se presentan pérdidas de miARN, se ha utilizado el compuesto 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida que inmoviliza las moléculas en su extremo 5' fosfato46.
]]> LavadoSi se utiliza el tampón de lavado, se adiciona un poco a la lámina con la muestra y la lámina se transfiere a un tubo que también contiene tampón de lavado pero precalentado (48°C) y se incuba durante 25 min a 48 °C (en baño de maría). Finalmente las laminas portaobjetos son lavadas con agua destilada una vez más y secadas al ambiente. Para evitar la pérdida de fluorescencia antes de observar al microscopio se debe adicionar al montaje compuestos "antifading" como el gelvatol o citifluor.
Visualización
El paso final de la hibridación in situ es la detección de la sonda marcada que hibridó con las células. Se requiere de un microscopio de epifluorescencia equipado con diferentes filtros para los diversos espectros de color, en este caso se debe tener en cuenta el tipo de fluorocromo con el que fue marcada la sonda y de esta manera emplear la longitud de onda adecuada que excitará el fluorocromo y emitirá la fluorescencia.
La tecnología de procesamiento digital de imágenes mejora la detección de la señal mediante la aplicación de técnicas, que en últimas, busca procesar una imagen con el fin de hacerla más adecuada para una determinada aplicación o procesamiento posterior. El sistema más sensible utilizado en FISH es mediante el empleo de la cámara CCD (Charge Coupled Device), la cual detecta fotones con una alta eficacia sobre rangos de amplio espectro de longitud de onda y que además, mediante un paquete informático apropiado para el análisis de imágenes, permite la digitalización y manipulación de las mismas.
Otro equipo usado para FISH es el microscopio láser confocal (CLSM). Al restringir la señal a una sección fina de la muestra que se investiga, la fluorescencia desenfocada es removida, lo cual genera imágenes mas definidas. El sistema es muy sensible y es de gran ayuda en muestras críticas donde se presenta una baja intensidad de la señal como muestras densas de cortes de biopsias, tejidos lodos, o bio-películas, así mismo, el CLSM ha permitido el recuento de microorganismos presentes en la muestra48,49.
Empleo de FISH con otras técnicas
A medida que se ha utilizado FISH en diversas áreas del conocimiento, se han introducido otras técnicas que permiten trabajar con una mayor sensibilidad y a la vez corregir inconvenientes que se presentan con el uso de la técnica convencional.
Una de las dificultades del empleo de FISH se debe al bajo contenido del ARNr que puedan tener los organismos, lo que conlleva a que se generen señales de fluorescencia muy tenues que podrían no ser detectables al enmascararse con la fluorescencia de fondo que presente la muestra. Esta limitación puede ser mejorada por modificaciones del ensayo, mediante el empleo de CARD- FISH (catalyzed reporter deposition), la cual se basa en la deposición de un gran número de moléculas marcadas con tiramina (componente fenólico) por actividad de la peroxidasa la cual está acoplada a la sonda de oligonucleótidos, lo que incrementa la sensibilidad de la detección de las células hasta en 12 veces, en el caso de que exista un bajo número de copias del ARNr36.
]]> Así mismo, las sondas PNA (Peptide Nucleic Acid) se han introducido dentro de las técnicas de hibridación. Los PNAs son análogos del ADN (pseudopéptidos) pero en lugar del azúcar fosfato tienen un esqueleto de poliamida el cual no tiene carga. Comparado con las sondas tradicionales de ADN, son estables a la degradación, hibridan con las secuencias complementarias con una alta afinidad y mejoran la cinética de hibridación7,49. Usualmente las sondas de PNAs son mas cortas que los oligonucleótidos convencionales requeridos para uniones específicas. Debido a su esqueleto de carga neutra, los PNAs difunden a través de paredes celulares hidrofóbicas y se han utilizados para la exacta cuantificación y la distribución espacial de cada una de las especies que se encuentran presentes en biopelículas donde existe una comunidad polimicrobiana51.Con el fin de mejorar los métodos para detectar y caracterizar variantes de ARN in situ, se ha desarrollado una técnica que combinan los PNA-FISH con la transmisión de energía de resonancia (FRET) mediante microscopía confocal52. FRET permite investigar las interacciones moleculares, las cuales dependen de la transferencia de energía de un fluoróforo a otro fluoróforo cuando dos moléculas se encuentran en proximidad cercana. FRET basado en la hibridación in situ fluorescente de PNA (FP-FISH) ofrece nuevas herramientas que permiten la caracterización a nivel subcelular tanto de la ubicación o estructura isofórmica del ARN, como de la amplia variedad de interacciones que se presentan entre ARN-ARN que estén en distancias muy cercanas.
El empleo de FISH con la espectrofotometría de masa iónica (FISH- NanoSIMS), facilita el análisis metabólico de células individuales a partir de grupos filogenéticos microbianos53,54. La principal ventaja que presenta esta técnica es la capacidad de correlacionar la identidad filogenética del gen ARNr 16S con la función metabólica específica que tiene.
Por otra parte, con el advenimiento de las tecnologías "omicas" los estudios apuntan al empleo de FISH con la metagenómica, transcriptómica y proteómica. Con la metagenómica se persigue obtener secuencias del genoma de los diferentes microorganismos que componen una comunidad, mediante la extracción y análisis del ADN de forma global, lo que hace que en conjunto con FISH sea una herramienta útil para acceder a la elevada biodiversidad de las muestras ambientales, obviando las dificultades encontradas en el cultivo en laboratorio de determinados microorganismos55.
CONCLUSIONES
Es importante destacar que hoy en día los estudios tendientes a la identificación de nuevas especies microbianas están enfocados a conocer la composición y distribución de los microorganismos que se encuentra presentes en sus diferentes hábitats ya sean tejidos, nódulos, suelo, etc. Gracias a técnicas de identificación molecular como lo es la hibridación in situ que emplea marcadores genéticos y, de manera tradicional el gen ribosómico 16S, ha permitido la localización y cuantificación de células microbianas sin importar el lugar que se encuentren. Esto es posible debido a que el alto número de copias del gen ARNr 16S que se obtiene en cada replicación y en células metabólicamente activas, ofrecen suficientes moléculas diana que permiten visualizar bacterias de manera individual, aun cuando se encuentren formando parte de una asociación.
Mediante el uso de sondas específicas de especie, se favorece la identificación de los diferentes microorganismos presentes en el complejo de comunidades, lo cual proporciona un soporte sólido que facilita entender la interacción que hay entre las diversas especies que componen el micro-hábitat. En este contexto, la hibridación in situ fluorescente (FISH) es considerada una poderosa herramienta para estudios filogenéticos, ecológicos, ambientales y de diagnóstico, debido que provee información acerca de la presencia, número, morfología y distribución espacial de las células microbianas, para lo cual la técnica FISH también se ha valido del apoyo de otras tecnologías que han surgido y que le permite ser cada vez más selectiva eliminando los inconvenientes que surgen al aplicarla en diferentes muestras.
AGRADECIMIENTOS
A la Facultad de Salud de la Universidad de Pamplona, Norte de Santander y al departamento de Microbiología de la Universidad de Salamanca, España, por todo el material bibliográfico aportado para la realización del artículo.
CONFLICTOS DE INTERESES
]]> Este trabajo no presenta ningún tipo de conflicto de intereses.REFERENCIAS
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