Actividad antiparasitaria de
extractos de plantas colombianas
de la familia Euphorbiaceae
Laura Fernanda Neira1, Elena Stashenko2, Patricia Escobar1
1. Centro de Investigación de Enfermedades Tropicales (CINTROP), Escuela de Medicina, Departamento de Ciencias Básicas, Universidad Industrial de Santander, Bucaramanga, Colombia.
2. Centro de Investigación en Biomoléculas (CIBIMOL), Escuela de Química, Universidad Industrial de Santander, Bucaramanga, Colombia.
Correspondencia: Patricia Escobar. Dirección: Km2 vía Refugio Piedecuesta sede UIS Guatiguará.
Correo electrónico: pescobarwww@yahoo.co.uk Teléfono: 6344000 extensión 3565.
Recibido: septiembre 5 de 2013 Aprobado: marzo 5 de 2014
RESUMEN
Introducción: La familia Euphorbiaceae es un grupo heterogéneo de plantas distribuidas en el territorio colombiano utilizadas algunas de ellas, como plantas medicinales. Objetivo: Determinar la actividad tóxica de aceites esenciales (AE) y extractos de plantas obtenidos de la familia Euphorbiaceae contra tripanosomátidos. Materiales y métodos: Los AE de Croton pedicellatus Kunth (AE1) y C.leptostachyus Kunth (AE2) y el extracto de Phyllanthus acuminatus Vahl fueron obtenidos por hidrodestilación asistida por la radiación de microondas y maceración con metanol; se caracterizaron por cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas. Fueron evaluados contra las formas extracelulares e intracelulares de Trypanosoma cruzi, Leishmania (Viannia) panamensis, L. (V.) braziliensis y células Vero y THP-1. La actividad antiparasitaria fue determinada por recuento microscópico y el efecto tóxico en células por la prueba colorimétrica de MTT. Los resultados fueron expresados como la concentración que inhibe (CI50) o destruye (CC50) el 50% de parásitos o células. Resultados: Los componentes mayoritarios de los AE fueron borneol, γ-terpineno, germacreno D y trans-ß-cariofileno. Los AE1 y AE2 inhibieron el crecimiento de epimastigotes de T.cruzi y de promastigotesde L. (V.) panamensis y L. (V.) braziliensis con CI50 entre 7,14-8,78μg/mL y fueron activos contra amastigotes intracelulares de L. (V.) braziliensis (AE1:CI50 36,74 y AE2:19,77μg/mL). El extracto 1 mostró baja actividad contra los parásitos. Los AE y extractosmostraron toxicidad en células THP-1(CC50 9,29-64,12μg/mL) y células Vero (CC50 24,86-3,52μg/mL). Conclusión: Los AE obtenidos de plantas de la familia de Euphorbiaceae mostraron actividad antiparasitaria con toxicidad moderada en células de mamífero.
Palabras Clave: Trypanosomacruzi, Leishmania, plantas colombianas, aceites esenciales, Euphorbiaceae
Activity of Colombian plant extracts derived
from the Euphorbiaceae family
ABSTRACT
Introduction: The Euphorbiaceae family is a heterogeneous group of plants distributed in the Colombian territory used for medicinal proposes. Objective: To determine the toxic activity of Euphorbiaceae family essential oils and plant extract against tripanosomatides. Materials and methods: Essential oil from Croton pedicellatus Kunth (EO1) and C.leptostachyus Kunth(EO 2) and plant extract from Phyllanthus acuminatus Vahl (Ext1) were obtained by microwave-assisted hidrodistillation and characterized by gas chromatography coupled with mass spectrometry and methanol maceration. They were assessed against extracellular and intracellular forms of Trypanosoma cruzi, Leishmania(Viannia) panamensis, L.(Viannia)braziliensis and Vero and THP-1 cells. The parasite activity was determined by microscopic counting and cell toxicity by MTT colorimetric test. The results were expressed as the inhibitory (ICz50) or citotoxic (CC50) concentration for 50% of parasites or cells. Results: The EO-major components were borneol, γ-terpinene and trans-ß-caryophyllene. The EO1 and EO2 inhibited both T.cruzi-epimastigotes and L(V.) panamensis and L.(V.) brazilienses promastigotes growth with IC50 between 7.14 to 8.78 μg/mL They were active against intracellular amastigotes of L. (V.) braziliensis (EO1:IC50:36.74 and EO2:19.77μg/mL). The Ext 1 showed low activity against both parasites. The EOs and extracts were partially toxic to THP-1 (CC50 9.29 to 64.12μg/mL) and Vero cells (CC50 24.86 to 63.52μg/mL). Conclusions: The EO obtained from plants of the Euphorbiaceae family showed antiparasitic activity with some toxicity against mammalian cells.
Keywords: Trypanosomacruzi, Leishmania, Colombian plants, essential oils, Euphorbiaceae
INTRODUCCIÓN
]]> Las plantas, sus extractos y AE han sido utilizados en la medicina tradicional por muchos años, constituyéndose en una fuente de moléculas potencialmente activas contra parásitos patógenos1. Algunas moléculas obtenidas de plantas como la artemisa, la quinina y la emetina, entre otras, han sido utilizadas en el tratamiento de la malaria y la amebiasis1. Estos resultados han motivado los estudios, cada vez más numerosos, de la actividad antiparasitaria de componentes de plantas especialmente aromáticas y medicinales en modelos experimentales.La leishmaniasis y la enfermedad de Chagas son enfermedades parasitarias producidas por protozoarios de la familia Tripanosomatidae; consideradas "enfermedades huérfanas u olvidadas", afectando principalmente a personas que habitan en condiciones de pobreza o miseria2. La leishmaniasis se encuentra distribuida en más de 60 países en el mundo estando en riesgo más de 200 millones de personas con 500.000 casos nuevos por año en países endémicos3. La enfermedad de Chagas es endémica en 21 países del continente Americano donde están en riesgo más de 100 millones de personas con 56.000 casos nuevos por año4,5. No existe una vacuna ni un tratamiento ideal para su cura. El tratamiento de la leishmaniasis consiste en la administración de antimoniales pentavalentes (Glucantime y Pentostam) y en caso de falla se utiliza la anfotericina B (AmB), la pentamidina y la miltefosina. Para la enfermedad de Chagas el tratamiento de basa en el uso de benznidazol y nifurtimox. Estos tratamientos presentan contraindicaciones, efectos tóxicos, eficacia variable, y generalmente son aplicados en protocolos largos y dolorosos6,7.
La familia Euphorbiaceae está constituida por cerca de 8000 especies agrupadas en 317 géneros; aunque recientemente ha sido dividida en aproximadamente 14 familias8. Se caracterizan por presentar un látex o exudado coloreado, estípulas y están distribuidas en zonas tropicales, subtropicales y templadas. En Colombia se han encontrado 78 géneros con más de 390 especies distribuidas en todas las regiones del país principalmente en la región andina y la región amazónica siendo Euphorbia el género más cultivado8. Esta familia heterogénea de plantas tiene importancia en diferentes áreas como en la obtención de productos industriales (i.e. Hevea brasilienses se obtiene el caucho), alimentos (i.e. Manihotesculentase obtiene la yuca o mandioca), en medicina (i.e. Ricinuscommunis de donde se obtienen el aceite de ricino) y ornamentación8. Experimentalmente numerosos trabajos resaltan la actividad de esta familia de plantas en medicina. R. communis ha mostrado actividad insecticida y actividad contra promastigotes de L. major cuando es utilizado como parte de la dieta del vector Phlebotomuspapatasi. Extractos o componentes del látex de Euphorbia splendens var. hislopii (E. milli) han presentado actividad contra los moluscos hospederos intermediarios de los esquistosomas; siendo según sus autores uno de los más potentes y específicos molusquicidas descubiertos hasta la fecha9. Extractos de Euphorbia prostrata Ait han mostrado actividad antiinflamatoria, antiglicemiante, insecticida y antihelmíntica10. Especies de género Croton han presentado propiedades antinflamatorias, antitumorales, leishmanicidas y antimalárica11-13.
Dado que la leishmaniasis y enfermedad de Chagas constituyen un problema grave de salud pública en los países que las padecen y la problemática de los tratamientos actuales, la búsqueda de alternativas terapéuticas es un tema prioritario de investigación. Como parte del programa realizado en Colombia orientado a la evaluación de la actividad biológica de AE y extractos de plantas aromáticas obtenidas de diferentes regiones del país, el objetivo del presente trabajo fue evaluar la actividad de AE obtenidos de C. leptostachyus y C. pedicellatus y extractos metanólicos de P. acuminatus contra T. cruzi, L. (V.) brazilienses y L. (V.) panamensis y sus células hospederas.
MATERIALES Y MÉTODOS
Aceites esenciales (AE), extractos de plantas y medicamentos de referencia
Los AE de C. pedicellatus y C. leptostachyus fueron obtenidos de hojas frescas de las plantas por hidrodestilación asistida por la radiación de microondas (MWHD) y caracterizados por espectrofotometría de masas acoplado a un cromatógrafo de gases (GC-MS)14. El extracto de Phyllanthusacuminatus fue obtenido a partir de hojas secas por extracción por maceración en metanol15. Muestras de las especies fueron identificadas por el Dr. J. Murillo y los pliegos testigo de cada planta quedaron depositados como muestra permanente en el Herbario Nacional Colombiano, Universidad Nacional de Colombia sede Bogotá. La composición química de los AE está formada principalmente por el borneol, γ-terpineno, germacreno D y trans-ß-cariofileno y el extracto contiene 4,30 mg fenoles/100 g. Como medicamento de referencia se utilizó la AmB (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA) y el nifurtimox (Bayer, Germany).
Se prepararon soluciones patrón de los compuestos en dimetilsulfóxido (DMSO, Carlo Erba, Rodano, MI, Italy) y soluciones de trabajo en medio de cultivo RPMI 1640 (Gibco, Grand Island, NY, USA) antes de cada experimento. El porcentaje de DMSO en las soluciones de trabajo fue menor al 0,5%. Esta concentración no fue tóxica para las células ni parásitos.
Parásitos y células de mamífero
Los promastigotes de L. (V.) panamensis (MHOM/ PA/71/LS94) y L. (V.) braziliensis (MHOM/BR/75/ M2903) fueron cultivados en medio Schneider (Sigma- Aldrich) suplementado con 10% de suero bovino fetal inactivado con calor (SFBi, Gibco) a 28ºC. Los epimastigotes de T. cruzi (Silvio-X10, ATCC® 50823) fueron cultivados en medio infusión de hígado triptosa (LIT) suplementado con 10% de SBFi a 28ºC. Las células de monocitos leucémicos humanos,THP-1 (ATCCTIB-202) y células epiteliales de riñón de mono verde africano, Vero (CCL1-81 ATCC) se mantuvieron en medio de cultivo RPMI 1640 suplementado con 10% de SBFi a 37ºC, 5% de CO2 y 95% de humedad.
]]> Ensayos de actividad en parásitosLos promastigotes de Leishmania o epimastigotes de T. cruzi fueron tratados con diluciones seriadas 1:3 de los compuestos (3,7-100 μg/mL), por 72 horas a 28ºC. Parásitos control fueron mantenidos sin compuesto. La inhibición del crecimiento fue determinada microscópicamente por conteo directo de parásitos vivos en cámara de Neubauer16.
Los amastigotes intracelulares de Leishmania spp fueron obtenidos infectando las células hospederas THP- 1 diferenciadas con forbolmiristato acetato (PMA, siglas en inglés, Sigma-Aldrich) con promastigotes en fase estacionaria de crecimiento, en una proporción parásito:célula de 5:1 por 48 horas. Los amastigotes intracelulares de T. cruzi se obtuvieron infectando las células Vero con tripomastigotes, en una proporción parásito:célula de 10:1 por 24 horas. Los amastigotes intracelulares fueron tratados con los AEs y el extracto (3,7-100μg/mL), durante 120 horas a 37ºC, 5% de CO2 y 95% de humedad. Las células infectadas control fueron mantenidos sin compuesto. Los porcentajes de infección fueron determinados por conteo microscópico de células infectadas y no infectadas en preparaciones fijadas con metanol y coloreadas con Giemsa.
Ensayo de toxicidad en células
Las células Vero y THP-1 fueron tratadas con diferentes concentraciones de los compuestos (3,7-100 μg/mL). Células control fueron mantenidas sin compuesto. La toxicidad fue determinada por el método de colorimétrico de MTT (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)- 2,5difenil-tetrazolio bromuro)17. La densidad óptica se determinó por espectrofotometría a 580 nm usando un lector de microplacas (Anthos2020). El porcentaje de citotoxicidad fue calculado mediante la fórmula: Porcentaje de citotoxicidad =100* (DO grupo control- DO grupo tratado)/ DO grupo control.
Análisis de resultados:
La actividad fue expresada como la concentración del AE o extracto metanólico capaz de inhibir el 50% y el 90% de los parásitos (CI50,CI90) o la concentración toxica para el 50% y 90% de las células (CC50, CC90) calculados por regresión sigmoidal utilizando el software MsxlfitTM(ID Business Solution,UK). Los resultados mostrados corresponden al promedio de dos experimentos. Se calculó el índice de selectividad (IS) dividiendo la CC50/IC50 (células /parásitos); IS de tres o superior se consideró selectiva (más activa contra los parásitos que contra la célula de mamífero).
RESULTADOS
Actividad contra Leishmania
Los AE1 y AE2 derivados de Croton mostraron actividad contra las formas extracelulares de las dos especies de Leishmania estudiadas. De igual manera, el AE2 fue activo contra amastigotes intracelulares de ambas especies de Leishmania, sin embargo, el AE1 solo fue activo contra amastigotes de L. (V.) braziliensis (Tabla 1). Los AEs también fueron tóxicos contra las células hospederas THP-1 mostrando IS menores de tres (Tabla 1). El extracto metanólico estudiado mostró baja actividad contra los parásitos y fue ligeramente tóxico para las células THP-1. La AmB presentó actividad contra Leishmania presentando IS mayores de 30. Los amastigotes intracelulares de L. (V.) panamensis fueron menos susceptibles a la AmB que los de L. (V.) braziliensis (p=0,001).
]]>
Actividad contra T. cruzi
Los AE1 y AE2 derivados de Croton mostraron actividad contra las formas extracelulares de T. cruzi (Tabla 2). El AE2 presentó actividad en amastigotes intracelulares, sin embargo, fue tóxico contra las células Vero mostrando IS de 0,85. El Ext1 fue poco activo contra el parásito. El nifurtimox fue activo contra el T. cruzi presentando IS mayores de 15 (Tabla 2).
Actividad en células Vero y THP-1
Los AE de C. pedicellatus y C. leptostachyus mostraron actividad tanto en las células THP-1 (CC50 16,57 y 9,29 μg/mL) como en las células Vero (CC50 de 46,67 y 24,86 μg/mL) respectivamente (Tabla 1 y 2). El extracto metanólicode P.acuminatus fue menos tóxico para estas células de mamífero.
DISCUSIÓN
Los extractos obtenidos de plantas de la familia Euphorbiaceae presentan una gran variedad en su composición química, por su alto contenido de terpenos, flavonoides, ácidos grasos y alcaloides 18,19. Una de las motivaciones para probar estos compuestos en tripanosomatidos fueron los resultados encontrados en la literatura principalmente en especies de los géneros Crotonsppy Phyllanthus spp.
En el género Phyllanthus especies como P. amarus, P. embirica, P. urinaria y P. nenuri han sido utilizadas ampliamente en la medicina tradicional y en la ayuvédica20. Phyllanthus amarus ha mostrado propiedades hepatoprotectivas, radioprotectivas, an titripanosoma,antibacteriana,antiviral y antimalárica21,22. Phyllanthus emblica actividad hepatoprotectiva, antioxidante, antiviral, antibacteriana y anticancerígena20,23,24; P. urinaria ha mostrado actividad contra el cáncer25 y P. niruri antibacteriana y antitumoral26. La actividad de P. acuminatus o grosella de Jamaica ha sido menos estudiada; estudios realizados en 1990 encontraron una sustancia llamada filantostatina6 en las raíces de esta planta que inhibía el crecimiento de líneas tumorales27, sin embargo no existen reportes de estudios recientes con esta molécula. En este trabajo la actividad del extracto de P. acuminatus en células de mamífero tumorales y en parásitos fue similar presentando valores por encima de 50 μg/mL. Aunque la actividad presentada en amastigotes intracelulares de L. (V.) braziliensis no deja de ser interesante, la baja selectividad en esta respuesta nos indica que el efecto de inhibición del parásito se debe posiblemente a los efectos que tienen los componentes de los extractos sobre la célula hospedera.
El género Crotones el segundo género más numeroso y diverso de las Euphorbiaceae, (con cerca de 800 especies de distribución pantropical) ocupando en Colombia principalmente las regiones Andina y Caribe7. En este trabajo AE obtenidos de C .pedicellatus y C. leptostachyus fueron activos contra las formas extracelulares de los parásitos y mostraron alguna toxicidad en las células hospederas. Sin embargo los resultados obtenidos especialmente en las formas intracelulares de L. (V.) braziliensis son bastante interesantes.
La actividad de AE obtenidos de la especie de Croton (C. cajucara) obtenida en la región de la Amazonía brasileña contra las diferentes formas parasitarias de L. amazonensis fue demostrada previamente11. Valores de actividad extremadamente bajos (LD500,0083 μg/ mL contra promastigotes y LD500,0220 μg/mL contra amastigotes intracelulares) fueron encontrados11. Los valores de actividad de los AE1 y AE2 hallados en este trabajo fueron aproximadamente 1000 veces mayores indicando que estos fueron menos activos. Estas diferencias podrían deberse a varios aspectos tales como las diferencias en la composición de los AE utilizados, a la especie de eishmania estudiada y a diferencias en las metodologías empleadas. En otro estudio realizado con el AE obtenido de C. macrostachyus especie de Croton recolectada en Etiopia, se registraron actividades contra promastigotes y amastigotes intracelulares de L. donovani y L. aethiopica 28. Los IS calculados (IS de 0,5 para L. donovani 1,5 para L. aethiopica), fueron similares a los encontrados por nosotros indicando la baja selectividad de los AE por los parásitos. Por otro lado, algunos componentes de los AE de Croton han sido evaluados29. Un derivado alcaloide llamado "julocrotine", molécula extraída de la especie C. pullei obtenida en el territorio brasileño ha mostrado actividad contra L. amazonensis con valores de IC50 67,0 μM en promastigotes y IC50 19,8 μM en amastigotes intracelulares29.
]]> En un estudio reciente, el extracto metanólico de C. cajuara obtenido también en la Amazonía Brasilera, mostró actividad en diferentes aislados de T. cruzi30. El extracto de C. cajuara mostró actividad en tripomastigotes (IC50 10,7-49,4 μg/mL), epimastigotes (IC50 103-166 μg/mL) y en amastigotes intracelulares (IC50 19,5-69,7μg/mL) sin presentar toxicidad en macrófagos peritoneales de ratón a la máxima concentración evaluada de 100 μg/mL. Con respecto a esto, nuestros resultados de actividad con los AE1 y AE2 mostraron ser hasta 12 veces más activos que el extracto de C. cajuara en los epimastigotes. En relación a la actividad en amastigotes intracelulares y dada las diferencias en la actividad en relación al aislado de T. cruzi, podemos decir que el AE2 mostró una actividad similar al extracto de C. cajuara.La toxicidad presentada por los AE en el presente estudio puede deberse en parte a que las líneas utilizadas como hospederas de los parásitos son líneas tumorales o diferenciadas. La actividad de estos tipos de compuestos han sido demostradas en diferentes líneas celulares. Extractos metanólicos de C. lechleri han mostrado actividad contra células HeLa con IC50 de 17μg/mL relacionada con la expresión de annexina31. Un compuesto derivado de C. malambo (ent-16beta-17alpha-dihidroxikaurano), ha mostrado actividad contra células MCF-7 de carcinoma mamario con actividades de IC50 de 2,5μg/mL dosis que es 2,6 veces menor al valor correspondiente a las células no malignas32.
La actividad de los componentes mayoritarios de los AE han sido reportados en la literatura científica como el caso del borneol el metabolito que se encontró en mayor proporción en los AE. Este se caracteriza por su baja toxicidad y ha mostrado acción analgésica, antiinflamatoria en estudios in vivo a concentraciones de 5, 25 y 50 mg/kg33, además de actividad contra nematodos como Meloidogyne incognita a concentraciones de 500 mg/L34. Otros componentes mayoritarios de los AE estudiados han reportado actividad antiparasitaria contra formas libres de T. cruzi y L. chagasi como el caso del γ-terpineno (IC50 de 145.1 a 162.9 μg/mL) y p-cimeno (IC50 de 28.1 a 149.1 μg/mL)35 y de actividad antimicobacteriana contra Mycobacterium tuberculosis MIC 250 μg/mL en ambos monoterpenos 36. Los sesquiterpenos trans-ß-cariofileno y germacreno D se encuentran comúnmente en la naturaleza, hacen parte importante de la composición química de muchos AE de plantas aromáticas y es desconocido el efecto sinérgico en mezclas complejas; sin embargo los resultados obtenidos del estudio del trans-ß-cariofileno han sido interesantes por su acción leishmanicida y selectiva en L. infantum (IC50 2,89 a 24,54 μg/mL)37 y L. amazonensis (IC50 1,3 μg/mL) con un IS de 48,9 en macrófagos peritoneales murinos38, lo que orienta al estudio particular de este compuesto con el fin de desarrollar nuevas formulaciones que puedan ser evaluada en modelos in vitro e in vivo contra la leishmaniasis.
CONCLUSIONES
En el presente estudio se demostró la capacidad de AE obtenidos de C. pedicellatus y C. leptostachyus y en menos proporción del extracto de Phyllanthus acuminatus, de inhibir las formas extracelulares e intracelulares de L. (V.) panamensis y L. (V.) braziliensisy T. cruzi. Se encontraron IS< 2, indicando el efecto de los compuestos contra la célula hospedera. Dada la actividad que este tipo de compuestos han presentados en células tumorales se sugiere realizar experimentos utilizando células no tumorales. Igualmente se sugiere evaluar la actividad de los componentes mayoritarios de los AE y determinar cuáles están implicados en la muerte del parásito y cuales en las células de mamífero.
CONFLICTO DE INTERESES
Los autores declaran que no existe conflicto de interés en la realización del presente trabajo.
AGRADECIMIENTOS
Este trabajo fue financiado por Colciencias (Contrato RC-245-2011), Patrimonio Autónomo del Fondo Nacional de Financiamiento para la Ciencia, la Tecnología y la Innovación, Francisco José de Caldas) y por la Universidad Industrial de Santander.
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