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Developing and validating on HPLC-UV method for enlafaxine determination in serum
Desenvolvimento e validação de método analitico para determinação de da venlafaxina em soro empregando HPLC-UV
Luz A. Sarmiento-Rubiano1, Meibys P. Espinosa-Mejia2
1 Bacterióloga, PhD, Tecnología de Alimentos
2 Bacterióloga. Laboratorio de Cromatografía Universidad Metropolitana de Barranquilla - Fundación Hospital Universitario Metropolitano. Email: lusarru@hotmail.com
Recibido: marzo 6 de 2012 Aceptado: octubre 1 de 2012
Resumen
La Venlafaxina es un fármaco antidepresivo de la familia de los derivados sintéticos de las fenetilaminas bicíclicas cuya actividad consiste en inhibir la recaptación de serotonina, noradrenalina y en menor proporción dopamina en la neurona presináptica, potenciando la neurotransmisión a nivel del sistema nervioso central. Diversos métodos han sido reportados para el análisis de Venlafaxina en variados fluidos biológicos, siendo la cromatografía liquida de alta precisión HPLC uno de los más utilizados. En este estudio se ha desarrollado un método rápido y sencillo para la determinación de Venlafaxina en muestras de suero con extracción liquido-liquido, detección ultravioleta a 229 nm, fase móvil isocrática y Carbamazepina como estándar interno, el rango de detección es entre 0,1 a 10 µg/ml con precisión y exactitud del 95% y un tiempo total de elución de 25 minutos por muestra, el método es lo suficientemente sensible, exacto, y reproductible para ser usado en estudios farmacocinéticos.
Palabras clave. HPLC, Venlafaxina, antidepresivos, farmacocinética
]]> AbstractVenlafaxine is an antidepressant drug; it is asynthetic phenethylamine bicyclic derivative having antidepressant activity which consists of inhibiting serotonin, nor epinephrine and (to a lesser extent) dopamine reuptake in the presynaptic neuron, thereby promoting synaptic transmission in the central nervous system. Different methods have been reported for analysing venlafaxine in biological fluids, high-performance liquid chromatography (HPLC) being one of the most used to date. This study involved developing a rapid and simple method for determining venlafaxine in serum samples using liquid/liquid extraction, 229 nm UV detection, isocratic mobile phase and carbamazepine as internal standard. Linear (detection) range was 0.1 to 10 µg/ml (95% precision and accuracy) and 25 mintotal elution time per sample. This method was sufficiently sensitive, exact and reproducible for use in pharmacokinetic studies.
Key words: HPLC, venlafaxine, antidepressant, pharmacokinetic.
Resumo
Venlafaxina é um antidepressivo da família dos derivados sintéticos da bicíclico fenetilaminas e tem como objectivo inibir à recaptação da serotonina, noradrenalina e em menor proporção a dopamina no neurônio pré-sináptico, e a melhoria da neuro transmissão no sistema nervoso central. Há registados vários métodos para o análise da venlafaxina nos fluidos biológicos, um dos mais utilizados é cromatografia líquida de alta presição (HPLC). Neste estudo foi desenvolvido um método simples e rápido para determinação da venlafaxina em amostras de soro com extracção líquido-líquido, detecção UV a 229 nm, fase móvel isocrática e carbamazepina como padrão interno. O nivel de detecção situa-se entre 0,1 e 10 ug / ml, com precisão e exactidão de 95% e um tempo de eluição total de 25 minutos por amostra, o método é bastante sensível, preciso e reprodutível para serem usado em estudos farmacocinéticos.
Palavras-chave. HPLC, venlafaxina, antidepressivos, farmacocinética.
Introducción
La Venlafaxina es un fármaco antidepresivo de la familia de las fenetilaminas, su nombre químico es 1-[2-(Dimetilamino)-1-(4-metoxifenil)etil]ciclohexanol, se emplea comúnmente en la industria farmacéutica como Clorhidrato de Venlafaxina cuya formula empírica es C17H27NO2HCl, tiene un peso molecular de 313,8 gramos mol de los cuales 277.4 son Venlafaxina pura, es una sustancia cristalina blanquecina soluble a 572 mg/ml en NaCl 0,2M. Su actividad consiste en inhibir la recaptación de serotonina, noradrenalina y en menor proporción dopamina en la neurona presináptica, potenciando la neurotransmisión a nivel del sistema nervioso central. La Venlafaxina no tiene actividad inhibidora de la monoaminooxidasa (IMAO) es por ello que a diferencia de otros antidepresivos triciclicos no tiene efectos secundarios tan importantes a nivel ardiovascular (Pacher, 2004), aunque su efecto antiplaquetario puede representar un nivel de riesgo que ha generado la restricción de su uso en algunos países (Taylor. 2010). La dosis recomendada de Venlafaxina es de 75 mg al día en tres dosis, de ser necesario se puede incrementar hasta 150 mg/día e incluso ha 225 mg/día con aumento en intervalos de 75 mg cada cuatro días (Schatzberg 2000). Después de su consumo oral, aproximadamente el 92% de la Venlafaxina es absorbido alcanzando una biodisponibilidad absoluta del 42%, el grado de unión a proteínas plasmáticas es del 30% y es metabolizada en el hígado siendo su principal metabolito la O-desmetilvenlafaxina, molécula con igual actividad biológica, aproximadamente a las 48 horas el 87% de la Venlafaxina y sus metabolitos son eliminados por orina (FDA, 2005). Diversos métodos han sido reportados para el análisis de Venlafaxina en variados fluidos biológicos, siendo la cromatografía liquida de alta precisión HPLC uno de los más utilizados unido a diferentes métodos de detección, como fluorescencia (Mandrioli, 2007), ultravioleta (Samanidou, 2011; Matoga, 2001) o detección electroquímica (Blier et al 2007), esta técnica también ha sido utilizada en combinación con otras tecnologías como la espectrometría de masas LC-MS/MS con ionización electrospray (Kingbäck, 2011; He, 2005) o la cromatografía de gases (Mastrogianni, 2012). Respecto a los protocolos de extracción utilizados, la fase solida (SFE) es en muchos casos el método de elección (Clement, 1998). En este estudio se ha desarrollado un método rápido y sencillo para la determinación de Venlafaxina en muestras de suero para ser empleado en estudios farmacocinéticos y se ha validado de acuerdo a los parámetros establecidos por la Oficina de las Naciones Unidas (ONU, 2010) y la FDA Americana (U.S. FDA, 2001). El método propuesto utiliza una extracción liquido-liquido de la molécula de Venlafaxina con un solvente no polar en medio alcalino, detección ultravioleta a 229 nm, fase móvil isocrática y Carbamazepina como estándar interno. La Carbamazepina es un fármaco antiepiléptico derivado tricíclico del iminostilbeno de muy escasa solubilidad en agua, soluble en metanol y similar estructuralmente a los antidepresivos tricíclicos, contrariamente a la Venlafaxina cuya estructura difiere de estos, la diferencia estructural entre las dos moléculas permite una adecuada separación cromatográfica (figura 1).
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Reactivos y equipos
Se utilizó estándar secundario de Venlafaxina clorhidrato de Genfar lote NVF-10002- (JM-01)-001 con humedad 0,5% y pureza de 99,2%; Carbamazepina presentación comercial en tabletas de 200 mg de laboratorios Bussie S.A.; acetonitrilo y metanol al 99,9% grado HPLC de J.T. Baker; Fosfato de potasio monobásico KH2PO4, fosfato de potasio bibásico K2HPO4 y acido fosfórico H3PO4 fueron grado analítico de Merck. Los equipos utilizados fueron: centrífuga Mikro 200, agitador vortex RELAX top de Heidolph, microbalanza analítica Sartorius, concentrador Vacufuge plus de eppendorf y congelador a -20 °C thermo scientific.
Sistema cromatográfico
El equipo de cromatografía utilizado fué HPLC La-Chrom Elite dotado de: Bomba L2130, Inyector L2200 y Detector UV L2400, Columna Hypersil GOLD C8 250 x 4,6 y 5 µ Part No. 25205-254630. La separación cromatográfica se realizó a temperatura ambiente. La fase móvil fué isocrática con flujo constante de 0,7 ml por minuto y consistió en acetonitrilo y buffer fosfato 0,062 M en una proporción 30:70 ajustado el pH a 5,5 con acido fosfórico. El tiempo de elución total fué de 25 minutos por muestra.
Soluciones de trabajo
Soluciones de trabajo de Venlafaxina clorhidrato y Carbamazepina a concentraciones de 1mg/ml y 0,1 mg/ml respectivamente, fueron preparadas en metanol al 99,9% grado HPLC y colocadas inmediatamente a -20°C hasta su uso.
Sueros control
Con firma de consentimiento informado se tomó una muestra de sangre (tres tubos sin anticoagulante) a 10 voluntarios sanos quienes manifestaron no estar tomando ningún medicamento, las muestras fueron centrifugadas a 900 g por minuto durante 10 minutos, los suero fueron extraídos y almacenados a -20 °C hasta su uso. Casa suero de forma individual fué analizado en el HPLC para verificar la ausencia de picos interferentes con los analitos de interés y finalmente se realizo un pool de sueros a partir del cual se prepararon sueros control con concentraciones de Venlafaxina de 0.1, 0.5, 1, 4, 6 y 10 µg/ml a partir la solución de Venlafaxina de 1mg/ml.
Preparación de las muestras y curvas de calibración
]]> 400 µl de suero control fueron colocados en un tubo eppendorf de 1,5 ml junto con 20 µl de Carbamazepina de 0,1 mg/ml como estándar interno y 20 µl de hidróxido de sodio 1N, se mezclo en vortex por 1minuto y posteriormente se adiciono 1 ml de dietil éter para la extracción de los analitos de interés haciendo una agitación en vortex durante 20 minutos, posteriormente la muestra fue centrifugada 10 min a 17.320 g por minuto y 0,5 ml del éter fueron colocados en un nuevo eppendorf de 1,5 ml y evaporados ha sequedad en el concentrador Vacufuge plus de eppendorf a 30 °C y 450 g por minuto durante 25 minutos, el extracto seco fue reconstituido con 300 µl de fase móvil, agitado en vortex durante 15 minutos y colocado en un vial para HPLC, 50 µl del reconstituido fueron colocados en el automuestreador e inyectados en el HPLC. La curva de calibración se realizo procesando sueros control con concentraciones de Venlafaxina en un rango entre 0,1 a 10 µg ml-1 (0.1, 0.5, 1.0, 4.0, 6.0 y 10 µg ml-1) por triplicado. Para determinar la linealidad del sistema, se estableció el valor de R2 en la curva de calibración y el coeficiente de variación entre las mediciones de una misma concentración.Capacidad de recuperación
Soluciones de Venlafaxina de 0,1 y 10 µg/ml y sueros control con iguales concentraciones fueron analizados por triplicado para comparar los valores obtenidos en cada caso y se calculó el porcentaje de recuperación del analito.
Especificidad
La especificidad es la capacidad del método para diferenciar el analito en presencia de otros componentes de la muestra, debe determinarse en un nivel bajo de concentración. Diez muestras de suero provenientes de diferentes donantes fueron analizadas para verificar la ausencia de picos en el cromatograma interferentes con el analito en cuestión, posteriormente los cromatogramas fueron comparados con los de sueros control con concentraciones de Venlafaxina de 0,1 y 10 µg/ml adicionados de Carbamazepina como estándar interno.
Precisión y exactitud
Describe el grado de dispersión del valor obtenido respecto al valor real o conocido bajo las condiciones establecidas de análisis. Sueros control con concentraciones de Venlafaxina de 0.1, 4 y 10 µg/ml fueron analizados por triplicado y durante dos días diferentes para evaluar la repetitividad y reproducibilidad del sistema.
Estabilidad de los analitos
La estabilidad de los analitos se evaluó por triplicado en sueros control a concentraciones de Venlafaxina de 1, 4 y 10 ug/ml y adicionados de 20 µl de Carbamazepina de 0,1mg/ml bajo las siguientes condiciones:
Estabilidad de congelamiento y descongelamiento: Los sueros descritos fueros sometidos a periodos de congelación a -20 °C, descongelados a las 24 y 72 horas, procesados, evaluados y los resultados comparados con sueros sin congelar.
]]> Estabilidad de los sueros control a temperatura ambiente: Los sueros control descritos fueron analizados después de ser procesados y permanecer 24 y 72 horas a temperatura ambiente en el automuestreador.Estabilidad de las soluciones Stock: Soluciones stock de Venlafaxina de 10 µg/ml y de Carbamazepina de 0,1 mg/ml fueron analizadas después de permanecer 24 y 72 horas a temperatura ambiente en el automuestreador.
Resultados
Se desarrolló y validó un método analítico mediante HPLC-UV para la determinación de Venlafaxina en suero humano con estándar interno Carbamazepina del cual se resumen las condiciones instrumentales en la tabla 1.
Los resultados obtenidos en los ensayos de especificidad muestran que en los cromatogramas de 10 sueros de donantes sanos no se observan picos interferentes con los analitos de interés, cuando sueros adicionados con Venlafaxina a concentraciones de 0,1 y 10 µg/ml y Carbamazepina de 0,1 mg/ml 20 µl fueron analizados se observó la presencia de picos en el cromatográma correspondientes a estas dos sustancias en los tiempos de retención 9,1min y 17,5 min respectivamente (figura 2).
Al realizar la curva de calibración de Venlafaxina (figura 3) con sueros control en concentraciones de 0.1, 0.5, 1, 4, 6 y 10 µg/ml, los resultados del modelo lineal indican la correlación existente entre la concentración y la medida del área de los picos resultantes, se obtuvo un R2 estadístico de 0,999 y el coeficiente de variación entre las replicas de una misma concentración fue inferior al 2% en todos los casos, lo cual indica muy poca dispersión entre las mediciones (tabla 2).
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La eficiencia de la extracción se calculo mediante la comparación de las relaciones de área de los picos de sueros control extraídos y las soluciones no extraídas observándose que a una concentración de Venlafaxina de 10 µg/ml la recuperación es de 98,74% y a concentración de 0,1 µg/ml es de 98,69%, el coeficiente de variación de las replicas en cada caso es inferior a 1% (tabla 3).
La precisión de las mediciones en las concentraciones de Venlafaxina 0.1, 4 y 10 µg/ml siempre tuvo un coeficiente de variación inferior a 1,5%, respecto a la exactitud, el porcentaje de error de las mediciones a las concentraciones analizadas nunca fue superior a 3%. (Tabla 4).
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Discusion
La cromatografía liquida de alta resolución es una técnica cada día mas utilizada para estudios farmacocinéticos, al tratarse de una tecnología sencilla, rápida, confiable, con costos relativamente bajos y una sensibilidad adecuada para el análisis en fluidos biológicos de muchos fármacos de uso común en humanos y animales. Para la identificación y cuantificación de Venlafaxina y Carbamazepina se selecciono la cromatografía liquida de fase reversa, que permitió una muy buena separación de los analitos gracias a sus diferencias de polaridad y su interacción con la fase estacionaria apolar de la columna C8 utilizada y la fase móvil de polaridad moderada. Respecto al manejo de la muestra, aunque la extracción en fase solida permite la recuperación de los analitos con el mínimo de interferencias, es un método que resulta más costoso y dispendioso cuando se pretende hacer un gran número de análisis, en el método desarrollado se utiliza la extracción liquido-liquido con un solvente no polar como el dietil éter en medio alcalino que permite una buena extracción de la Venlafaxina, la cual es posteriormente fácilmente recuperada por la rápida evaporación del éter. Mayoga et al en el 2001 describe una extracción de esta molécula con hexano- alcohol isoamílico en medio alcalino seguida de una solubilización de la Venlafaxina en medio acido, pero en este caso es posible que el extracto contenga mayor cantidad de impurezas apolares presentes en el suero que al realizar la extracción con éter.
Algunos métodos analíticos logran la diferenciación de la Venlaxina y su principal metabolito la O-desmetilvenlafaxina utilizando técnicas como HPLC acoplado a espectrometría de masas (Bhatt et al., 2005, Qin et al., 2010), la presencia de O-desmetilvenlafaxina se ha observado no solamente en muestras biológicas, sino también en formas farmacéuticas de Venlafaxina como producto de una degradación acida de la molécula (Carneiro et al 2010), aunque ambas moléculas son efectivas en el tratamiento de desordenes depresivos, difieren en su metabolismo ya que la Venlafaxina es oxidada por el citocromo p450 mientras que su metabolito no, cerca del 55% de venlafaxina es eliminada por vía renal como O-desmetilvenlafaxina (Cohen. 2009). El método desarrollado en este trabajo, al igual que el reportado por Qin et al., 2008, se realizo con el fin de analizar solo la molécula de Venlafaxina en suero mas no sus metabolitos.
Conclusiones
El método analítico evaluado para la determinación de Venlafaxina en sangre utilizando como estándar interno Carbamazepina mediante la técnica HPLC-UV es especifico para el principio activo de interés, tiene la exactitud, precisión, linealidad y reproductividad adecuadas para dicho análisis, por lo tanto se puede utilizar en estudios de farmacocinética. Las condiciones cromatograficas utilizadas pueden permitir también la investigación de Venlafaxina en solución y pueden ser adaptadas y empleadas para el análisis cuantitativo en productos que contengan Venlafaxina como principio activo.
Agradecimientos
Al laboratorio de Toxicología Vargas-Melo de la Ciudad de Bogotá, por el aporte de algunos de los materiales y reactivos necesarios para la elaboración de este trabajo.
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