En este trabajo se presenta el estudio de la actividad alelopática de las lactonas terpénicas presentes en las fracciones clorofórmicas de Lagascea mollis Cav (Asteraceae). Para tal efecto se evalúa el porcentaje de semillas germinadas y la longitud de radícula de semillas de arroz (Oryza sativa L.). La bioactividad observada en las fracciones clorofórmicas es contrastada con la correspondiente en el extracto etanólico crudo. El mecanismo de interacción del metabolito se establece teniendo en cuenta el índice mitótico del meristema radicular, el estudio micromorfológico de la raíz y la conductividad del eflujo celular. Adicionalmente se caracteriza la arvense mediante su descripción morfológica y la determinación de los índices farmacognósticos. La investigación demuestra que los constituyentes químicos de las fracciones clorofórmicas de Lagascea mollis manifiestan efecto significativo sobre la división celular y el crecimiento radicular de Oryza sativa donde se observan alteraciones morfológicas, lo que evidencia la actividad alelopática de la arvense sobre el crecimiento de la gramínea.

Palabras clave: efecto alelopático, arvense, lagascea mollis, oryza sativa, asteraceae.

In this work, the study of the allelopathic activity of terpenic lactones on chloroformic fractions of Lagascea mollis Cav (Asteraceae) is reported. To this effect it is determined the percentage of germinated seeds and the radicular length of rice seeds (Oryza sativa L.). The observed bioactivity is contrasted with the corresponding one in the raw ethanolic extract. The mechanism of the metabolite interaction is established taking into account the mitotic index of the radicular meristeme, the micromorphologic study of the root and the conductivity of the cellular efflux. Additionally, the weed or arvense characterization is done by morphologic description and determination of pharmacognostic indexes. This research demonstrates that chemical constituents of the chloroformic fractions of Lagascea mollis manifest significant effect on cellular division and radicular growth of Oryza sativa where morphological alterations are observed, evidencing the allelopathic activity of the weed on the growth of the gramineous species.

Keywords: allelopathic effect, weed, lagascea mollis, oryza sativa, asteraceae.

"Vegetación espontánea", "maleza", "mala hierba", "plantas adventicias" o "plantas invasoras", son algunos de los términos utilizados con frecuencia para describir especies vegetales que a más de ser ajenas a un cultivo, desarrollan formas de competencia por nutrimentos, luz, agua, dióxido de carbono y espacio; asimismo hospedan y transmiten parásitos, plagas y enfermedades en los cultivos contribuyendo a su mal estado fitosanitario, por ello se les considera dañinas y tradicionalmente se ha inducido a su destrucción indiscriminada.

No obstante, estas plantas no sólo poseen su propia dinámica sino que además pueden evitar y controlar la erosión de los suelos, algunas son de importancia apícola, otras tienen aplicación como forrajeras para el ganado e incluso se conocen ciertas de ellas con valor alimenticio para el humano y en ocasiones se les da además uso etnomédico al constituirse en una rica fuente de sustancias medicinales ya sea para tratar heridas en el ganado o bien para curar hepatitis, conjuntivitis, cistitis, forúnculos y accesos, mordeduras de serpientes y picaduras de escorpiones o también como plaguicidas (1); se hizo entonces necesario la revaluación de su nombre por el de "arvense", término que se refiere a una comunidad de plantas que invade los cultivos interactuando en forma diversa con éstos. El estudio de las interacciones bioquímicas planta-planta y de los aleloquímicos involucrados puede contribuir en la investigación de modelos de herbicidas naturales.

Una de las familias vegetales con mayor número de especies entre las Magnoliópsidas es la Asteraceae (Compositae), la cual ubican Rai and Acharya (2) como una de las más abundantes, con aproximadamente 30000 especies distribuidas en 1100 géneros. Muchas arvenses de la familia Asteraceae presentan efecto alelopático sobre diferentes plantas cultivadas u otras malezas, bioactividad que en casi todos los casos se ha asociado directamente con la síntesis de sesquiterpenlactonas, las cuales afectan el DNA, el RNA e inhiben la germinación y el crecimiento de las plántulas (3-7).

La sesquiterpenlactonas conforman un grupo numéricamente importante de sustancias evocadas bajo el nombre de "principios amargos" encontradas en hongos, briofitas y en algunas angiospermas de las familias Apiaceae, Lauraceae y mayoritariamente en la Asteraceae, de la que se han aislado aproximadamente 3000 estructuras diferentes. Estos constituyentes químicos se localizan frecuentemente en pelos secretores situados a nivel de los tallos, hojas y brácteas de las inflorescencias, al igual que en los aquenios y raramente en los órganos subterráneos (8-12); constituyen uno de los mayores grupos de productos naturales y su aplicación en la quimiotaxonomía (13-15) junto con las actividades fitotóxicas (3, 5, 16, 17), alergénicas (18), antivirales (8), antitumorales (19), antifúngicas (20-22), entre otras, todo lo cual podría ser la base fundamental para abordar el estudio de las especies invasoras de la familia Asteraceae, relacionadas con el cultivo del arroz (Oryza sativa).

Partiendo de una arvense abundante y asociada al producto agrícola de mayor importancia económica en el Tolima, en este trabajo se seleccionó a Lagascea mollis Cav. (Asteraceae), entre muchas otras arvenses, como especie modelo para investigar su potencial alelopático y el posible mecanismo de acción, buscando con ello explorar posteriormente su uso como herbicida natural y además suministrar una base biológica para el manejo de las arvenses.

Material vegetal

Del total de especies vegetales colectadas e identificadas como invasoras de cultivos de arroz establecidos en los municipios de mayor producción (23), se seleccionó a Lagascea mollis Cav (Pincelillo), adoptando como criterios la abundancia poblacional, la presencia manifiesta de lactonas terpénicas a través de pruebas químicas y análisis espectroscópicos, y la actividad revelada a través del bioensayo realizado sobre semillas de Oryza sativa L., variedad Fedearroz 50, proporcionadas por FEDEARROZ-Ibagué.

La recolección del vegetal se realizó mediante muestreos al azar durante los meses de Noviembre de 2003 a Febrero de 2004, en zonas ubicadas a alturas comprendidas entre los 280 y los 1000 m.s.n.m, temperatura promedio de 27°C y en un total de 62 lotes (491 Ha). Se prensaron 3 muestras para su determinación en el Herbario TOLI de la Universidad del Tolima y se complementó la identificación a través de una descripción morfológica, un ejemplar de la especie se depositó en el herbario.

Preparación de los extractos

La parte aérea seca y molida de L. mollis, fue macerada con etanol (1:10); la extracción se incrementó mediante agitación ocasional durante 7 días, el solvente se renovó cada 24 horas hasta el agotamiento de la muestra. El extracto así obtenido fue caracterizado mediante la determinación de la densidad, los sólidos totales, el índice de refracción, el olor, el color y el pH.

El extracto etanólico crudo se concentró a presión reducida, se evaporó el solvente y el sólido obtenido fue resuspendido en etanol del 96%, se diluyó con agua (1:2) y se subdividió por polaridad creciente mediante extracción discontinua líquido- líquido con éter de petróleo y cloroformo como solventes. El extracto etanólico crudo y los subextractos orgánicos concentrados a presión reducida fueron sometidos a pruebas químicas, siguiendo la marcha fitoquímica establecida por Wall M. E., Krider M. y col., adaptada en algunas de sus partes en el Laboratorio de Fitoquímica de la Universidad del Tolima (25,26), análisis espectroscópicos y ensayos de actividad biológica, con el propósito de evidenciar la presencia lactonas terpénicas.

Dado que el subextracto clorofórmico fue donde se detectó la mayor presencia del metabolito, se fraccionó por cromatografía líquida en columna de sílica gel 60 (relación 1:30), mezclas de cloroformo- acetato de etilo en polaridad creciente (95:5 a 100% de acetato de etilo) fueron aplicadas como eluentes.

Las fracciones recolectadas se monitorearon mediante cromatoplacas de sílica gel, desarrolladas con cloroformo-acetato de etilo (95:5) y como revelador ácido sulfúrico al 50% con calentamiento a 110ºC, agrupándolas según el perfil evidenciado en los cromatogramas.

Bioensayo

Con el extracto etanólico crudo y las fracciones en las que se evidenció la presencia del anillo lactónico, se realizó un bioensayo para medir el efecto de las lactonas terpénicas sobre el número de semillas germinadas y el crecimiento radicular de O. sativa.

Siguiendo el método de Kato y col. recomendado por Krautmann, et al. (27), se impregnaron papeles de filtro (Whatman No 1, 9 cm de diámetro) colocados en cajas de Petri de vidrio, con 2 ml de soluciones clorofórmicas de 200, 400 y 600 ppm de cada fracción seleccionada y del extracto etanólico completo; como testigo se empleó cloroformo. Después de evaporar el solvente se colocaron 20 semillas de O. sativa var. Fedearroz 50 y se agregaron 5 ml de agua bidestilada para conservar el ambiente húmedo.

Al cabo de 120 horas de incubación (25°C en oscuridad), de las cajas de Petri con su contenido, se determinó el número de semillas germinadas, se midió la longitud de las radículas y se realizaron observaciones macro y micromorfológicas para detectar alteraciones. Cada experimento se repitió cuatro veces, tanto para las muestras como para el blanco.

Una parte de las radículas que emergieron después de las 120 horas, se incubaron (16 h, 25°C) en 10 ml de agua bidestilada y desionizada, al final se midió la conductividad específica frente a una solución patrón de KCl 0,1 M por medio de un CONDUCTIMETER 522-CRISOL.

Análisis estadístico

En la determinación del posible efecto alelopático de las fracciones se definieron las siguientes variables continuas de análisis: porcentaje de germinación, longitud de la radícula, conductividad eléctrica e índice mitótico. Con ellas se realizó un Análisis Exploratorio de Datos (AED), constituído por un conjunto de estadísticas descriptivas aplicadas a las variables de análisis consideradas como únicas, como también clasificadas por las variables fracción y concentración.

Paralelamente se llevó a cabo un Análisis de Varianza (ANOVA), a fin de concluir acerca del efecto de los diferentes tratamientos considerados en las cuatro variables analizadas. Estas variables se sometieron a análisis estadístico, mediante un diseño 3 x 4, desbalanceado para la longitud de radícula y balanceado para las demás.

El análisis de varianza se validó con la verificación de cuatro supuestos básicos: igualdad de varianzas, independencia de los residuos y los valores predichos, normalidad de los residuos, y la no autocorrelación de los mismos.

Los diseños antes mencionados se ejecutaron utilizando los programas MINITAB-13, SPSS 9.0 y el STATISTICA 4.5, utilizando como soporte Windows XP.

La frecuencia de aparición del vegetal en el cultivo se estableció dividiendo cada lote en tres áreas: centro (dentro del cultivo), borde (en los caballones) y periferia (alrededor del lote); sobre esta base se calificó como "abundante" cuando se localizó más de 30 especímenes en 50 m², "frecuente" si se encontró de 6 a 30 especímenes y "escasa" cuando sólo apareció hasta 5 especímenes. De 12 especies vegetales invasoras colectadas en la zona arrocera establecida (datos no mostrados) pertenecientes a diferentes tribus, y por ende con características macromorfológicas diferentes en la forma de la hoja y en la disposición de las flores,. Lagascea mollis Cav (Pincelillo) superó los criterios de selección satisfactoriamente. La especie se tipifica como una planta sufruticosa con hojas opuestas, ovadas, nervación actinodroma, borde dentado ciliado y pelos glandulares cortos, su inflorescencia aparece en glomérulo protegido por 5 - 6 brácteas foliosas y velludas de 5-12 mm de largo con ápice filamentoso.

En el análisis micromorfológico las hojas se notan provistas en gran abundancia de largos tricomas simples pluricelulares, células parenquimatosas corticales y esponjosas. Los tallos presentan fibras de esclerénquima, haces vasculares colaterales y una médula parenquimatosa. Se observa la presencia de celulosa.

Índices farmacognósticos

Junto a las características morfológicas y a la clasificación taxonómica, los índices farmacognósticos, se constituyen en la huella digital de una especie vegetal, permitiendo por este medio agrupar parámetros para identificarlo o bien para establecer su origen.

Se ha observado que, los autores de folletos sobre "malezas", los agrónomos y campesinos con frecuencia confunden fácilmente las plantas arvenses, en especial las de la familia Asteraceae, por su gran diversidad y dificultad en el acceso a literatura actualizada; se plantea entonces la necesidad de una completa descripción para la correcta clasificación de estos vegetales no sólo para programar métodos de control adecuados, pues para aplicar productos químicos la selección y la respectiva dosis dependen de la clase de arvense sino además para un mejor conocimiento de especies que por años han sido subestimadas y por ende subutilizadas. La práctica de reconocimiento hacia el final del período vegetativo-reproductivo del cultivo en los lotes de descanso, sirve para predecir cuáles serán las arvenses predominantes en las futuras cosechas.

Particularmente se encontró un contenido de materia orgánica extraña relativamente bajo (1.96%), dando a entender que se recolecta biomasa viva aunque acompañada de tierra, arena o piedrecitas (materia inorgánica extraña), el porcentaje de humedad alto (70.39%), el cual parece encontrar explicación en las condiciones agrícolas (arroz riego) establecidas para O. sativa. El vegetal demora 2 d para el secado en estufa (40°C) y 4 d para el secado natural.

Resultó notorio el contenido de hierro (1043 mg/Kg). Para Olivares (28), 500 ppm puede aceptarse como un nivel normal de hierro en plantas terrestres; el resultado obtenido permite pensar en L. mollis como una especie indicadora de este micronutriente. Sin embargo, el contenido de cenizas totales (15.5%) insinúa que el vegetal puede considerársele como de buena calidad (29).

Importa mencionar que los valores que pueden alcanzar los índices farmacognósticos están altamente influenciados por las condiciones de cultivo de las plantas, así como por los diversos factores ecológicos tanto bióticos (plagas o microorganismos) como abióticos (fertilización, insecticidas, cambios de temperatura, técnicas de riego, etc.).

Análisis químico

El fraccionamiento en columna cromatográfica del subextracto clorofórmico permitió obtener 75 fracciones; aquellas separadas con mezclas de CHCl₃:AcOEt 95:5 (f1-f11) y 90:10 (f12-f20) mostraron resultados positivos para el metabolito secundario. El análisis por CCD y las pruebas químicas de Kedde y de Legal condujeron a la determinación de reagrupar a f1 y f2 llamándolas en lo sucesivo F1 y unir de f3 a f20, denominándolas en adelante F2.

Los resultados obtenidos en las pruebas anteriores se confirmaron mediante un análisis espectroscópico aplicado a F1, F2 y F3, aprovechando el alto grado de desarrollo alcanzado por la espectrometria IR moderna. Se obtuvieron espectros que dejaron ver frecuencias de absorción en 3400 cm^-1 (OH), 2900 cm^-1 (C-H), 1729 cm^-1 (C=O), 1600 cm^-1 (C=C), 1284 cm^-1 (tensión asimétrica C-O-C), 1124 y 1074 cm^-1 (tensión simétrica C-O-C).

El espectro UV del extracto etanólico y de las fracciones dejó ver bandas en 247 y 349 nm (A=3.812 y 2.279, respectivamente), insinuando la presencia de moléculas con grupos cromóforos en conjugación (dienos, anillos aromáticos), o que tal vez el cromóforo además de estar conjugado posee un heteroátomo (enonas) con un par de electrones no compartidos (31).

Bioensayo alelopático

La actividad alelopática fue determinada tanto para las fracciones clorofórmicas F1y F2 como para el extracto etanólico crudo (F3), a diferentes concentraciones. Un análisis descriptivo aplicado a la proporción de semillas germinadas en las tres fracciones dejó ver un promedio homogéneo (70%) con un bajo error estándar (0.01) y un coeficiente de variación de 6.42%.

Un ANOVA mostró que no hay diferencias significativas entre las fracciones (P> 0,05), mientras que si entre las concentraciones (P < 0.05), de lo que se infiere que el número de semillas germinadas es dependiente del nivel de concentración utilizado. La figura 1, muestra los intervalos de confianza del 95% para el porcentaje de semillas germinadas en las diferentes concentraciones consideradas, diferenciándose sólamente el blanco con 400 ppm y 600 ppm.

Figura 1. Proporción de germinación (intervalos de confianza del 95%) por concentración

Adicionalmente se observa actividad inhbitoria sobre la germinación a las mayores concentraciones, lo cual podría ser atribuído, en principio, a la cantidad relativamente alta de lactonas terpénicas detectada a este nivel. El efecto de estos metabolitos secundarios o de algunos de sus análogos ha sido probado (5, 25, 32) sobre la germinación de semillas de algunas dicotiledóneas (Lactuca sativa, Trichocereus pasacana) y en Lolium sp. (monocotiledónea).

El efecto alelopático de las diferentes fracciones en la longitud de la radícula deja ver un coeficiente de variación alto (33-53%), se deduce que las tres fracciones influyen de manera independiente en la elongación de la radícula. F1 y F2, que poseen lactonas terpénicas como constituyente más abundante, ejercen una acción más drástica que F3 (extracto etanólico completo).

La figura 2 deja ver para el blanco una distribucion de frecuencia asimétrica a la derecha con tendencia hacia el aumento de radículas largas, en contraste con la mayor simetría para las diversas concentraciones, aunque con desplazamiento de las frecuencias hacia menores longitudes radiculares en tanto aumenta la concentración. Debe entenderse que las fracciones influyen sobre la longitud de la radicula en forma diferente (CV: 27-43%), a pesar de ello muestran un comportamiento similar, es decir, que en cualquier caso a medida que se incrementa la concentracion, disminuye la longitud radicular.

El ANOVA aplicado confirma lo antes dicho (P < 0,05) para todas las interrelaciones, (fracción y concentración), es decir que F1, F2 y F3 además de diferenciarse por la actividad inhibitoria del crecimiento de la radícula, dicha acción resulta dependiente de la concentración empleada, como se visualiza en la figura 3. Se destaca F2 como el tratamiento que evidencia mayor influencia sobre el crecimiento radicular y por presentar diferencias a 400 ppm con todas las demás fracciones. Tanto el análisis espectroscópico como las pruebas químicas mostraron señales evidentes que permiten identificar a esta última fracción como la de mayor contenido en lactonas terpénicas.

Figura 3. Longitud radicular (intervalos de confianza del 95%)

Los valores de conductividad del eflujo celular obtenidos mostraron poco efecto sobre la permeabilidad de la membrana. El ANOVA demostró que no existe diferencias significativas entre las fracciones ni entre las concentraciones ensayadas así como tampoco entre sus interacciones y el testigo (P > 0,05).

Las medias estadísticas de los índices mitóticos (0.074, 0.139 y 0.215) indican una cierta proporcionalidad directa con la concentración; esta observación da a entender que en la radícula existe un alto número de células en división dependiente de la concentración.

Un análisis de las fases de la mitosis revela que todas las células se presentan en profase, con algunas excepciones en F3 a 200 ppm, en la cual aparecen otras fases de división como metafase y anafase, indicando que el aumento en el índice mitótico es debido a un bloqueo en el ciclo celular y no a una alta tasa de divisón.

Estas observaciones han sido reportadas por Dayan et al. (3) en estudios comparativos de fitotoxicidad con la artemisinina y análogos, quienes afirman que la interferencia en la división celular es un efecto directo de los mecanismos de acción de las sesquiterpenlactonas que ellos estudiaron; proponen, basados en evidencias en raíces de Allium cepa L., que estos metabolitos irrumpen en la formación de los centros organizadores de los microtúbulos.

Autores interesados en el estudio del efecto alelopático de arvenses de la familia Asteraceae (3, 16, 17, 27), han reportado resultados similares a los encontrados en este trabajo; en todos los casos la bioactividad ha sido atribuida a las sesquiterpenlactonas, sin perder de vista que el 80% de las encontradas en la naturaleza han sido aisladas de vegetales pertenecientes a la familia Asteraceae (26). Podría pensarse que la accion revelada por L. mollis se debe básicamente al contenido de este tipo de lactonas terpénicas, constituyentes principales de las fracciones clorofórmicas (F1 y F2).

Sin embargo F2 y F1 presentan diferencias significativas en su efecto sobre la elongación radicular a 400 ppm, lo que podría encontrar explicación en el diferente contenido del componente fitotóxico como también a la presencia de otros metabolitos constituyentes que pueden realizar una acción antagónica o sinergística.

Si se tiene en cuenta que las fracciones clorofórmicas afectan la etapa germinativa al influir sobre el crecimiento radicular, se puede afirmar que la acción de los metabolitos se fundamenta básicamente sobre el bloqueo del ciclo de división celular.

El efecto de los aleloquímicos de la arvense estudiada sobre Oryza sativa representa un deterioro de los procesos fisiológicos de esta planta, evidenciado en malformaciones de la radícula que seguramente reducen su vigor y crecimiento, situación ya reportada para otras plantas alelopáticas (33-35).

Los agentes químicos que inhiben la división celular pueden actuar afectando la síntesis o la estructura del DNA – RNA o por disminución de la producción de energía necesaria para los procesos de mitosis (4, 5). Quizá otros procesos pueden también verse involucrados, incluyendo respiración, fotosíntesis, dinámica enzimática y síntesis de proteínas (36-39) dando a entender que la influencia sobre el ciclo celular pueda ser una manifestación secundaria de un cambio en otros procesos del metabolismo primario inducido por los metabolitos secundarios.

Nuestros resultados son una evidencia clara de que las fracciones clorofórmicas de Lagascea mollis muestran un efecto significativo sobre la división celular y el crecimiento radicular de Oryza sativa; estas fracciones presentan diferencias en su actividad alelopática entre si, dependientes de la concentración de lactonas terpénicas,; distinguéndose a su vez su comportamiento con el del extracto etanólico completo, indicando la fitotoxicidad de este metabolito. En general la especie estudiada podría ser utilizado como herbicida constituyéndose en una ayuda en sistemas de agricultura ecológica, como una alternativa para los cultivadores de escasos recursos económicos. De otra parte, el trabajo permitió la completa determinación de una especie invasora de los cultivos de arroz en el Tolima utilizando nomenclatura actualizada, ya que esta labor casi siempre se hace por comparación con ilustraciones de libretos de malezas; la sistematización por simple comparación y sin análisis de caracteres, fácilmente conduce a identificaciones erróneas. Se pretende ahora la identificación del tipo de lactonas terpénicas presentes en la fracción clorofórmica de la arvense estudiada.

Los autores agradecen el soporte económico del Comité Central de Investigaciones de la Universidad del Tolima. El apoyo logístico del Departamento de Química es altamente apreciado.

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* Autor a quien debe dirigir la correspondencia: emurillo8@hotmail.com