INHIBICIÓN DE LAS ACTIVIDADES PROTEOLÍTICA, COAGULANTE Y HEMOLÍTICA INDIRECTA INDUCIDAS POR EL VENENO DE Bothrops asper POR EXTRACTOS ETANÓLICOS DE TRES ESPECIES DE HELICONIAS.

INHIBITION OF PROTEOLITIC, COAGULANT AND INDIRECT HEMOLYTIC ACTIVITIES INDUCED BY Bothrops asper VENOM, BY ETHANOLIC EXTRACTS FROM THREE HELICONIAS SPECIES

Jaime A. PEREAÑEZ J. 1,2*; Silvia L. JIMÉNEZ.1,2; Juan C. QUINTANA.1,2; Vitelbina NUÑEZ.1,3; Maritza FERNANDEZ.2; Yessica RESTREPO.2
1. Programa Ofidismo/Escorpionismo. Universidad de Antioquia. A.A. 1226. Medellín-Colombia.
2. Facultad Química Farmacéutica. Universidad de Antioquia. A.A. 1226. Medellín-Colombia. ]]> 3. Escuela de Microbiología. Universidad de Antioquia. A.A. 1226. Medellín-Colombia.

En Colombia, Bothrops asper (mapaná) es la especie causante del 70 al 90% de los cerca de 3.000 accidentes ofídicos informados cada año. Durante varios siglos, la medicina tradicional ha utilizado plantas para el tratamiento de la mordedura de serpiente. En nuestro país, el 60% de las mordeduras son atendidas inicialmente por curanderos o chamanes, que usan al menos 100 especies de plantas medicinales en diferentes formas, de acuerdo al estado clínico del paciente. En este estudio se evaluó la capacidad inhibitoria de tres especies de la familia Heliconiaceae, H. latispatha Benth, Hemidesmus indicus Petersen y H. curtispatha Petersen, sobre los efectos proteolítico, coagulante y hemolítico indirecto inducido por el veneno de Bothrops asper. La primera indujo un mayor porcentaje de inhibición del efecto hemolítico indirecto del veneno de B. asper que la Heliconia wagneriana, así como una reducción en la intensidad en las proteínas del veneno con masa molecular de 14 KDa, mientras que el extracto de la segunda planta mostró una mayor inhibición del efecto proteolítico inducido por el veneno de B. asper, así como mayores cambios en las bandas de proteína del veneno con masas moleculares entre 95 y 110 KDa. El extracto de Heliconia curtispatha, mostró la mayor capacidad inhibitoria de los efectos hemolítico, proteolítico y coagulante; además indujo una degradación de todas las proteínas del veneno completo de B. asper, como había sido reportado previamente.

Palabras clave: veneno de serpiente, actividad proteolítica, actividad hemolítica, actividad coagulante, Bothrops asper, extractos de plantas, Heliconias.

In Colombia, Bothrops asper (mapaná) inflicts at least 70 to 90% of an approximated 3.000 snakebites reported each year. For many centuries, traditional medicine has used plants for treatment of snakebites. In Colombia, 60% of snakebite victims are initially attended by traditional healers or "chamanes", who use at least 100 medicinal plants species in different forms according to clinical conditions of patients. In this work, the ethanol extracts of three species of Heliconiaceae family, H. latispatha Benth, Hemidesmus indicus Petersen and H. curtispatha Petersen, were examined for their possible inhibitory ability against proteolytic, coagulant and indirect hemolytic effects induced by B. asper. The first of three induced more inhibition percentage of Indirect Hemolytic Activity than the Heliconia wagneriana, as well as induced reduction of venom proteins intensity with 14 KDa of molecular weight, belonging to phospholipases A2. The extract of H. latispatha showed major inhibition on the proteolytic effect induced by Bothrops asper venom, as well as greater change on the protein bands with molecular weights between 95 and 110 KDa, possibly belonging to proteases (metalloproteases). Heliconia curtispatha showed the greatest inhibitory ability against mentioned effects, including coagulant induced by Bothrops asper venom, and it did present degradation of all venom proteins , as well as it had been reported previously.

Keywords: snake venom, indirect hemolytic activity, proteolitic activity, coagulant activity, Bothrops asper, plant extracts, Heliconias

INTRODUCCIÓN

Desde hace más de un siglo, el tratamiento específico para el accidente ofídico ha sido el suministro de antivenenos (Bon C. 1996); sin embargo, se ha demostrado que estos no resuelven todos los efectos inducidos por los venenos de víboras, ya que tienen limitada capacidad de neutralización de los efectos locales tales como hemorragia, edema y mionecrosis (Bon C. 1996; Gowda T 1997; Lomonte B et al., 1994), debido a su rápida instalación.

Durante varios siglos, la medicina tradicional ha utilizado plantas para el tratamiento de la mordedura de serpiente. Aunque se han reportado cerca de 700 plantas usadas a nivel mundial como antiofídicas, pocas han sido evaluadas en su efectividad en ensayos controlados (Houghton P et al, 1993; Otero R et al, 2000b; Otero R et al, 2000c; Núñez V et al, 2004a; Núñez V et al, 2005; Alam M et al, 1994; Alam M et al, 1995; Ode OJ et al, 2006). En Colombia, el 60% de las mordeduras son atendidas inicialmente por curanderos o chamanes, que usan al menos 100 especies de plantas medicinales en diferentes formas, de acuerdo al estado clínico del paciente (Otero R et al, 2000c; Otero R et al, 1992; Otero-Patino R et al, 1998). En trabajos recientes, el extracto de Heliconia curtispatha Petersen demostró actividad inhibitoria de los efectos letal, edematizante, desfibrinante, coagulante, mionecrosante, proteolítico y hemolítico indirecto frente a los venenos de Bothrops asper, Lachesis muta, Crotalus durissus cumanensis y Micrurus mipartitus (Otero R et al, 2000a; Otero R et al, 2000b; Núñez V et al, 2004a; Núñez V et al, 2004b). Este estudio pretendía demostrar si otras especies de Heliconias, como H. latispatha Benth y Hemidesmus indicus Petersen también poseen actividad frente al veneno de B. asper.

MATERIALES Y MÉTODOS

Venenos y Extractos

El veneno fue una mezcla homogénea, obtenida por ordeño manual de 40 especímenes adultos de B. asper procedentes de los departamentos de Antioquia y Chocó, mantenidos en cautiverio en el Serpentario de la Universidad de Antioquia. El veneno fue centrifugado, el sobrenadante liofilizado y congelado a -70º C hasta su uso.

H. curtispatha fue colectada en las comunidades rurales de la costa pácífica (Nuquí, Bahía Solano), su número de archivo en el Herbario de la Universidad de Antioquia es RF 6486 (Otero R et al, 2000c); H. latispatha y Hemidesmus indicus fueron colectadas en Barbosa (Antioquia, Colombia). El material vegetal (rizomas) se secó a 38ºC por dos días, una vez seco fue molido y percolado con etanol al 96% durante 48 horas. Los extractos se concentraron al vacío hasta sequedad, finalmente el residuo se liofilizó y congeló hasta su uso.

Inhibición de la actividad hemolítica indirecta

Se utilizó el método de agarosa - yema de huevo - eritrocitos, descrito por Gutiérrez et al. (Gutiérrez JM 1988). Se definió como dosis hemolítica indirecta mínima (DHmI) del veneno de B. asper, aquella que genera un halo de hemólisis de 20 mm de diámetro, después de 20 horas de incubación. Los ensayos de inhibición se llevaron a cabo incubando mezclas de cantidades variables de cada extracto con una DHIm del veneno a 37ºC por 30 minutos. La hemólisis se evaluó como se describió previamente. Los experimentos fueron realizados por triplicado.

Se siguió la técnica descrita por Lomonte y Gutiérrez (Lomonte B et al, 1983). En resumen, a dos mililitros de caseína al 1 % en PBS, pH 7.2 se les adicionó un mililitro de solución que contenía cantidades variables de veneno de 0.02 a 2.0 mg/ml; la reacción fue detenida con la adición de ácido tricloroacético al 5 %, se dejó en reposo 30 minutos, finalmente los tubos fueron centrifugados a 3500 RPM por 10 minutos. La absorbancia del sobrenadante fue determinada a 280 nm en un espectrofotómetro contra un blanco de reactivos. La dosis proteolítica mínima (DPm) es aquella que causa un cambio de 0.5 en la absorbancia con respecto al control negativo, (DPm 1.5 mg para el veneno de B. asper). Las pruebas de inhibición se realizaron preincubando a 37 ºC mezclas de cantidades variables de cada extracto con una DPm durante 30 minutos. Finalmente, a estas mezclas se les determinó la actividad proteolítica de acuerdo al método descrito previamente. Los experimentos fueron realizados por triplicado.

Inhibición de la actividad coagulante

La actividad coagulante se determinó por el método descrito por Theakston y Reid (Theakston, RDG. et al, 1983). Las pruebas de inhibición se efectuaron preincubando a 37°C un microgramo de veneno de B. asper disuelto en 50 µl de PBS pH 7.2, con diferentes cantidades (0.25 -20µg) de cada uno de los extractos, durante 30 minutos. La mezcla fue adicionada a 300 µl de plasma y el tiempo para su coagulación fue registrado. Los experimentos fueron realizados por triplicado.

Electroforesis SDS-PAGE

La electroforesis se realizó sobre geles de poliacrilamida al 15% en condiciones no reducidas, como lo describe Laemmli (Laemmli, U K. 1970). Cuarenta µg de veneno se incubaron con 400 µg de cada extracto durante 30, 60 y 120 minutos a 37°C y se corrieron en una cámara Mini Protean-II® de BioRad durante 60 minutos a 150 voltios. Veneno solo fue incubado en los mismos tiempos y corrido en las mismas condiciones. Las proteínas fueron coloreadas empleando azul de Coomasie R 250.

Westernblotting

Las proteínas separadas en la electroforesis fueron transferidas a una membrana de nitrocelulosa a 200 mA. Las membranas fueron bloqueadas utilizando una solución de caseína al 1% y albúmina al 1% en PBS pH 7.2. Posteriormente, fueron incubadas durante 2 horas con el antiveneno polivalente (antilachésico, anticrotálico y antibothrópico), producido en el instituto Clodomiro Picado, San José de Costa Rica, lote: 3450403LQ, en una dilución 1/250. Después de lavar, se incubó durante una hora con una solución de IgG de conejo anti-IgG de caballo conjugada con peroxidasa en una dilución 1:2000. Las membranas se revelaron utilizando 2-cloronaftol como sustrato.

Análisis estadístico

Se realizó un ANOVA de una vía seguido por un test de Dunnet para comparar los controles positivos (veneno solo) realizados en cada prueba con los resultados obtenidos de la mezcla de cada extracto con el veneno. Todos los ensayos fueron realizados por triplicado y los resultados se expresaron como la media ± S.E.M (error estándar de la media). Se consideraron diferencias significativas cuando p<0.05.

RESULTADOS

Inhibición de la actividad coagulante

Un microgramo de veneno indujo coagulación del plasma en 20.9 ± 0.53 segundos. Cuando el veneno se preincubó con cada uno de los extractos en una relación veneno: extracto de 1:10, se observó un aumento en el tiempo de coagulación; siendo más activo el extracto de H. curtispatha (Véase figura 1). Así mismo, este extracto presentó una concentración inhibitoria 50 (IC₅₀) muy baja, seguido por el de H. latispatha. El extracto de Hemidesmus indicus presento una IC₅₀ superior a 20 µg (Véase tabla 1).

Figura 1. Inhibición del efecto coagulante inducido por el veneno de B. asper por extractos de H. latispatha, Hemidesmus indicus y H. curtispatha.

Tabla 1. Inhibición de los efectos coagulante, hemolítico indirecto y proteolítico inducidos por el veneno de B. asper por extractos de H. latispatha, Hemidesmus indicus y H. curtispatha.

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Inhibición de la actividad hemolítica indirecta

La dosis hemolítica mínima indirecta (DHIm) del veneno de B. asper fue de 2.2 μg. Cuando el veneno se preincubó con los extractos de H. latispatha y Hemidesmus indicus en una relación veneno: extracto de 1:10, mostraron una inhibición de este efecto del 14.6 ± 2.7% y 4.2 ± 1.4% respectivamente. Cuando la relación veneno:extracto fue de 1:20 los porcentajes de inhibición se incrementaron a 15 ± 0.9% y 10.6 ± 1.5% respectivamente. El extracto de H. curtispatha inhibió en un 100% el efecto hemolítico indirecto en las relaciones ya mencionadas. Estas diferencias fueron estadísticamente significativas en todos los casos, excepto cuando se comparó el control positivo con el extracto de Hemidesmus indicus en una relación 1:10 (Véanse figura 2 y tabla 1).

Figura 2. Inhibición del efecto hemolítico indirecto inducido por el veneno de B. asper por extractos de H. latispatha, Hemidesmus indicus y H. curtispatha.

La dosis hemolítica mínima indirecta (DHmI) fue de 2.2 µg, la cual es la dosis que induce un halo de hemólisis de 20 mm. Mezclas de cada extracto fueron incubadas con una DHmI en una relación 1:10 y 1:20. Los resultados se muestran como la media ± SEM de tres ensayos. *** p<0.05.

Inhibición de la actividad proteolítica

Figura 3. Inhibición del efecto proteolítico inducido por el veneno de B. asper por extractos de H. latispatha, Hemidesmus indicus y H. curtispatha

La dosis proteolítica mínima (DPm) del veneno fue de 1.5 mg. Mezclas de cada extracto con una DPm fueron incubadas en una relación 1:1 y 1:2. Los resultados se muestran como la media ± SEM de tres ensayos. *** p<0.05.

Figura 4. Actividad proteolítica del veneno de B. asper y H. latispatha, Hemidesmus indicus y H. curtispatha.

El control positivo fue una dosis proteolítica mínima (DPm) de veneno que equivale a 1.5 mg. Cada uno de los extractos fue utilizado en una cantidad de 3.0 mg. Los resultados se muestran como la media ± SEM de tres ensayos. *** p<0.05 con respecto a los controles positivo y negativo, respectivamente.

La electroforesis de proteínas en geles de poliacrilamida, mostró que el extracto de H. curtispatha induce una degradación de todas las bandas de proteína del veneno (Véase figura 5), mientras que el extracto de H. latispatha produjo solamente una disminución en la intensidad de algunas bandas de proteínas del veneno, especialmente las que tienen una masa molecular entre 95 y 110 KDa y las de 14 KDa. El extracto de Hemidesmus indicus solamente redujo la intensidad de las bandas con pesos moleculares de 95 y 110 KDa (Véase figura 5). Estos efectos fueron dependientes del tiempo de incubación, es decir a mayor tiempo, mayor disminución en la intensidad de las bandas (Véase figura 6). En el westerblott se observó que la mezcla del veneno con los extractos de H. latispatha y Hemidesmus indicus no disminuía el reconocimiento de las bandas de proteína por el antiveneno (Véase figura 6). Así mismo, aunque el extracto de H. curtispatha indujo una degradación de las proteínas del veneno, se evidenció que el antiveneno lograba reconocer algunos productos de esa degradación (Véase figura 7).

Figura 5. SDS-PAGE del veneno de B. asper después de 30 minutos de incubación con los extractos en una relación de 1:10.

Figura 6. SDS-PAGE del veneno de B. asper preincubado a diferentes tiempos con cada extracto.

Figura 7. Western Blotting del veneno de B. asper después de 30 minutos de incubación con los extractos en una relación de 1:10.

DISCUSIÓN

Varias investigaciones han reportado la presencia de actividad antiofídica en diversas plantas. El extracto de Eclipta prostrata y su componente wedelolactona, inhibió in vitro el efecto hemorrágico del veneno de Bothrops jararaca, Bothrops jararacussu y Lachesis muta (Melo P et al, 1999), así como el efecto letal y miotóxico de Crotalus durissus terrificus (Mors WB et al. 1989). Así mismo, los extractos de las raíces de Hemidesmus indicus, Pluchea indica, Vitex negundo, Emblica officinalis y Aristolochia indica, neutralizaron in vitro e in vivo el efecto hemorrágico inducido por el veneno de Vipera russellii, Echis carinatus, Naja naja, Ophiophagus hannah (Alam M et al, 1995). Un compuesto aislado de la raíz de Hemidesmus indicus, denominado HI-RVIF, al ser administrado vía intravenosa a ratones, demostró inhibición significativa de los efectos letal, hemorrágico y desfibrinante del veneno de Vipera russellii (Alam, M. et al, 1994). El mecanismo de inhibición de los efectos tóxicos de los venenos por extractos completos aún no es conocido, pero se sugiere que esta acción puede ser la suma de uno o varios efectos, mediados ya sea por uno o un grupo de compuestos del extracto (Gowda, T. 1997). Los extractos de Piper peltatum y P. umbellatum inhibieron la actividad enzimática de la miotoxina I del veneno de Bothrops atrox; uno de sus compuestos, el 4-nerodilcatecol, demostró una reducción en la actividad enzimática y de los efectos miotóxico y edematizante inducidos por esta toxina; de este compuesto se demostró que inducía modificaciones de tipo covalente en la molécula de miotoxina (Núñez et al, 2005).

El mecanismo de acción de los extractos de heliconias no es claro aún, pero los cambios observados en el patrón electroforético y en el westernblotting del veneno inducidos por el extracto de H. curtispatha sugieren una acción proteolítica inespecífica, la cual se hizo evidente en los ensayos de actividad sobre la caseína, en los cuales el extracto mostró alta capacidad de degradación de la proteína mencionada; no obstante esta proteólisis deja algunos fragmentos que contienen algunos epítopes que pueden ser reconocidos por el antiveneno. Es interesante anotar que el mecanismo de acción para los extractos de H latispatha y H wagneriana no parece ser el mismo, ya que sólo indujeron una leve disminución en la intensidad de algunas bandas de proteína.

El extracto de Hemidesmus indicus presentó un mayor porcentaje de inhibición sobre la actividad proteolítica inducida por el veneno de B. asper, que el de H. latispatha. Este efecto podría estar relacionado con los cambios inducidos por este extracto sobre las proteínas de alto peso molecular (95 y 110 KDa) del veneno, evidenciado en el patrón electroforético. Entre los componentes del veneno que tienen este rango de masa molecular están algunas proteasas, como las hemorraginas, que son metaloproteasas, cuyo peso molecular varía ente 20 y 100 KDa (Kamiguti A et al, 1996; Bjarnason J et al, 1994; Bjarnason J et al, 1988/89); algunas de estas enzimas ya han sido aisladas de la especie B. asper (Borkow G et al, 1993; Franceschi A et al, 2000; Gutiérrez JM et al, 1995b), y son las responsables de efectos tóxicos como hemorragia, edema, dermonecrosis, inhibición de la agregación plaquetaria, mionecrosis, entre otros (Gutiérrez JM et al, 2000) y gran parte de su mecanismo de acción está mediado por la proteólisis, la cual es dependiente de zinc; por ello sería importante evidenciar, en trabajos futuros, la presencia de sustancias quelantes en este extracto.

Otras enzimas presentes en el veneno de B. asper son las fosfolipasas A2, que hidrolizan fosfolípidos en la posición sn2 liberando ácidos grasos y lisofosfolípidos. Estas enzimas son responsables de efectos como neurotoxicidad, cardiotoxicidad, anticoagulación y mionecrosis, entre otros (Chang, C. 1985. Gowda, T. 1997). La actividad enzimática de estas proteínas puede ser evaluada por varios métodos, entre ellos el de hemólisis indirecta. El extracto de Heliconia latispatha mostró un mayor porcentaje de inhibición de la actividad hemolítica indirecta del veneno de B. asper, que el de Hemidesmus indicus; así mismo, este extracto indujo cambios, principalmente en las proteínas de 14 KDa, el cual corresponde a la masa molecular de las fosfolipasas A2.

El estudio demostró que aunque las tres plantas pertenecen a la familia Heliconeaceae, no presentan la misma capacidad inhibitoria de los efectos tóxicos inducidos por el veneno de B. asper; esto podría estar relacionado con diferentes mecanismos de inhibición. En conclusión, los extractos de H. latispatha y H. wageneriana presentan diferencias en su capacidad inhibitoria dependiendo del efecto sobre el cual se evalúe; esto quizás esté relacionado con su efecto sobre una u otra clase de toxina. En un trabajo realizado por Da Silva (Da Silva J et al, 2007) se evidenció un fenómeno similar, donde los compuestos denominados macrolobina A (Saponina triperpenoide) y macrolobina B (Triterpeno), obtenidas del extracto de Pentaclethra macroloba, inhibieron en mayor proporción el efecto hemorrágico que el efecto miotóxico. Trabajos futuros son necesarios para el aislamiento de las moléculas responsables de los efectos inhibitorios sobre el veneno, ya que el hallazgo de estas sustancias permite profundizar en los mecanismos de acción de las toxinas y posibilita el desarrollo de productos farmacéuticos que mejoren el pronóstico del accidente ofídico.

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AGRADECIMIENTOS

Agradecemos a la doctora y experta en heliconias Aura Urrea por colectar e identificar H. latispatha y Hemidesmus indicus, y a la Universidad de Antioquia por el soporte financiero que nos brindó.