El objetivo del presente trabajo fue evaluar la viabilidad de tres microorganismos considerados probióticos: Lactobacillus casei 01, Bifidobacterium BB12, y Lactobacillus acidophilus La-5, durante la vida útil del queso Cottage (0, 7 y 14, y 7 días adicionales, para un total de 21 días, y su influencia sobre las características sensoriales. El estudio se llevó a cabo en cuatro tratamientos y tres repeticiones: el tratamiento control T1, sin agregado de probiótico; el tratamiento 2, con agregado de Lb. casei 01; el tratamiento 3, con agregado de Lb. acidophilus La – 5; y el tratamiento 4, con agregado de Bifidobacterium BB12. Los probióticos fueron adicionados a la crema que se agrega al queso, el cual es almacenado a 4ºC. La viabilidad de los microorganismos se midió en análisis microbiológicos; y las características de calidad de los productos mediante análisis físicos, microbiológicos, químicos y sensoriales. Bifidobacterium presentó recuentos superiores a 1 x 10⁶ ufc/g hasta el final de la vida útil del producto (14 días); además, los tratamientos con Lb. acidophilus y Lb. casei registran recuentos superiores a 1 x 10 ⁶ ufc/g hasta los 21 días de almacenamiento; no obstante Lb. casei tuvo la mayor pérdida de viabilidad en el tiempo. Los parámetros de calidad físicoquímica y microbiológica de los quesos presentaron valores normales y sin diferencias significativas entre tratamientos (P<0,05). La calidad sensorial se vió afectada por el agregado de los microorganismos en algunos atributos sensoriales: el sabor y la firmeza de grano no registraron diferencias significativas entre tratamientos, al contrario del aroma y la sensación de humedad, parámetros que sí mostraron diferencias significativas entre tratamientos (P>0,05).

Palabras Clave:queso, probióticos, supervivencia celular.

The objective of this research was to evaluate the viability of three microorganisms considered as probiotics: Lactobacillus casei 01, Bifidobacterium BB12 and Lactobacillus acidophilus La-5, during cottage cheese shelflife (0, 7, 14, and 7 days thereafter equivalent to 21 days), and the influence on sensory characteristics of the products. The study was carried in four treatments and three replications. Control treatment (T1) without probiotics; treatment T2 containing Lb. casei 01; treatment T3 containing Lb. acidophilus La-5; and treatment 4, with the addition of Bifidobacterium BB12. The cream with the addition of probiotics was added to the cheese which is stored at 4ºC. The viability evaluation of microorganisms was carried through microbiology analysis and its quality characteristics obtained through physical, chemical and sensory analyses of the products at 0, 7 and 14 days. Bifidobacterium had higher counts than 1 x 10⁶ ufc/g up to the end to the shelflife (14 days) and treatments with Lb. acidophilus and Lb. casei presented higher counts than 1 x 10⁶ ufc/g up to 21 storage days. However, Lb. casei presented a greater viability loss through the time. Physicochemical and microbiology quality were normal and there were no significant differences between treatments (P<0.05). The sensory quality is in a way affected by the addition of microorganisms, while sensory attributes like flavour and grain firmness does not present significant differences, but aroma and humidity sensation does present significant differences between treatments (P>0.05).

Keywords:cheese, probiotics, cell survival.

Desde hace algunas décadas se sabe que las enfermedades crónicas han llegado a ser las causales más frecuentes de morbilidad y mortalidad en el mundo. Paralelamente, algunas investigaciones científicas han podido establecer que tales enfermedades están asociadas, en mayor o menor medida, a desórdenes en la dieta y falta de actividad física, entre otros factores (1).

La obesidad y el sobrepeso suponen un alto riesgo de padecer enfermedades crónicas como la diabetes tipo II, la hipertensión, las enfermedades cardiovasculares y coronarias y algunos tipos de cáncer (3).

El queso Cottage es un producto de muy buenas características nutricionales y organolépticas, y una alternativa viable e interesante para quienes buscan un queso bajo en grasa, rico en proteínas y de fácil digestión que, además, tiene un gusto fresco y un delicado aroma, que le confiere buenas perspectivas en las preferencias de los consumidores.

Las principales características en las que se destaca el queso Cottage son su original, bajo contenido en grasa (4%); su alto contenido de proteínas y bajo contenido de sal. La humedad del producto es cercana al 80%, y su pH se encuentra entre 4,8 y 5,0. Es de color muy blanco y de apariencia apetecible (4).

La coagulación ácida necesaria para producir el queso Cottage se logra por el proceso de fermentación con el agregado regular de cultivos mesófilos Lactococcus lactis subsp. cremoris y/o Lactococcus lactis subsp. lactis, lo cual constituye ya una de sus ventajas, porque al producirse un coágulo más pequeño y liviano que el de los quesos elaborados por coagulación enzimática, se facilita la digestibilidad de la proteína (4).

FAO (5) define los probióticos como microorganismos vivos que ejercen una acción benéfica sobre la salud del huésped cuando son suministrados en cantidades adecuadas. Los efectos fisiológicos pueden ocurrir mediante dos mecanismos: por efecto directo de las células vivas, o indirectamente, por vía de los metabolitos producidos por estas células, lo cual es conocido como efecto biogénico (6).

Para que un producto sea considerado adecuado para el transporte de los probióticos, los microorganismos deben ser viables en el momento del consumo; y para que puedan ejercer sus efectos clínicos y terapéuticos, deben estar en una concentración igual o superior a 10 ⁶ufc/g (7, 8).

La sobrevivencia de los probióticos depende, además, de las propiedades del microorganismo y de ciertas característica en la composición del producto al cual ha sido adicionado, como acidez, fuentes de nitrógeno, actividad de agua, etc. (6).

Desde un punto de vista técnico, los lácteos son alimentos bastante adecuados para la adición de probióticos, y tienen un apreciable potencial en el sector de los alimentos funcionales, con un mercado creciente de yogures y bebidas fermentadas, hasta ahora la matriz alimentaria más usada para la incorporación de probióticos (6). Los quesos frescos, en particular, han resultado promisorios para la adición de probióticos porque no tienen un período de maduración, su vida útil es corta, y su almacenamiento, a temperatura de refrigeración. Tienen, además, alta actividad de agua, bajo pH, bajo contenido de sal y se pueden producir sin agregado de preservantes, etc., lo que permite el crecimiento adecuado de microorganismos en ellos. (9).

La literatura técnica informa de interesantes investigaciones sobre quesos frescos con agregado de microorganismos considerados probióticos. Blanchette et al., 1996 (10), mencionan el queso Cottage elaborado con agregado de B. infantis, donde los microorganismos se han mantenido viables por 14 días en una concentración igual o superior a 10⁶ ufc/g. También se han probado los agregados de B. bifidum, B. infantis y B. longun en queso Crescenza, donde B. bifidum y B. longun mantuvieron un nivel de 10 ⁸ufc/g, y el B. infantis, de 10⁷ ufc/g a los 14 días de almacenamiento (8). Masuda et al., 2005 (11) informan haber tenido un buen resultado al agregar Lb. acidophilus al queso fresco; también con éxito ha sido incorporado Lb. acidophilus a quesos Minas fresco (9).

Tratamientos

Las variables estudiadas fueron: a) la adición de tres microorganismos considerados probióticos, correspondientes a cultivos liofilizados procedentes del Laboratorio Chr. Hansen: Lactobacillus casei 01, Lactobacillus acidophilus La-5, Bifidobacterium BB12, y b) el tiempo de observación: 0, 7, 14 y 21 días. En la elaboración de queso cottage, como iniciadores propios de esta variedad, se usaron cultivos liofilizados mesófilos homofermentativos que contenían Lactococcus lactis subsp. lactis y Lactococcus lactis subsp. cremoris (R-704), procedentes del Laboratorio Chr. Hansen.

Se practicaron cuatro tratamientos con tres réplicas cada uno y los análisis se hicieron por duplicado.

Tratamiento 1 (control): queso Cottage con 4% de materia grasa (MG).

Tratamiento 2: queso Cottage con 4% de MG y adición de Lb. casei 01.

Tratamiento 3: queso Cottage con 4% de MG y adición de Lb. acidophilus La-5.

Tratamiento 4: queso Cottage con 4% de MG y adición de Bifidobacterium BB12.

Protocolo de elaboración del queso Cottage

Crema con cultivos probióticos

La crema fue preparada al 25% de materia grasa; se le adicionó 2,8% de sal; luego fue homogeneizada (homogeneizador Rannie homo-mic con capacidad de 100 L/h) a 100 psi, se pasteurizó a 85ºC durante 30 minutos y se mantuvo en refrigeración (6ºC) hasta el momento de agregarla al queso (24 horas) (3). Los cultivos probióticos liofilizados se prepararon por separado, inoculando 1 g de cultivo en 600 mL de leche reconstituida al 10% de sólidos no grasos, usando leche en polvo descremada, tratada luego por tindalización (95ºC x 30mins, durante tres días consecutivos a fin de eliminar las esporas). Los cultivos fueron incubados a 36ºC por 24 - 48 horas (recuento de 10⁸ ufc/g). Cada cultivo se adicionó a la crema que posteriormente fue agregada a la cuajada del queso Cottage, de acuerdo con el tratamiento en estudio. Al tratamiento control (T1) se le adicionó crema sin agregado de microorganismos (13).

Controles físicos y químicos

Los quesos obtenidos en cada tratamiento se analizaron en los siguientes parámetros y con los métodos mencionados a continuación: pH, método potenciométrico NCh. 1671-1979 (14) mediante un pHmetro Radiometer modelo PHM 26; humedad: en estufa de desecación, por el método gravimétrico IDF/FIL 4A: 1982, descrito por Pinto et al., 1998 (15), y grasa, medida en butirómetro para queso con el método Gerber van Gulik. NEN 3059:1957 Leiden, Holanda; ISO No.3433, descrito también por Pinto et al., 1998 (15). Todas las muestras de Cottage se envasaron en potes plásticos, se sellaron con foil de aluminio y se almacenaron en refrigeración (4ºC) hasta el momento de su análisis.

Valoración de la viabilidad de los cultivos probióticos

Se midió la viabilidad de los probióticos colocando 10 g de muestra de queso en 90 mL de buffer fosfato estéril (pH 7,2); luego fue homogenizada (2 min) en un Stomacher Lab (homogeneizador masticador IUL S.A. modelo Basic, 19K). Posteriormente se efectuaron diluciones decimales (10^-8 10^-5) con buffer fosfato y se utilizó la técnica de siembra en superficie en los diferentes medios. Para el recuento de Lactobacillus casei 01 se utilizó agar MRS con glucosa, incubación durante 72 horas a 36ºC. Para Lactobacillus acidophilus La-5, se empleó agar MRS con maltosa, incubación 72 horas a 43ºC en anaerobiosis (Gas Pack system, OXID), y el Bifidobacterium BB12 se sembró en agar MRS modificado con cloruro de litio y L-cisteína con adición de glucosa; finalmente fue incubado a 36ºC en anaerobiosis (Gas Pack system, OXID) (16).

Análisis sensorial

Los productos se sometieron al análisis sensorial en una prueba de valoración numérico con una escala de 1 a 5 puntos, donde 1 corresponde a la menor intensidad, 5 a la mayor, y 3 puntos representa el valor “normal” del respectivo atributo sensorial. La prueba fue aplicada por un panel de ocho jueces entrenados en los aspectos técnicos y de aplicación del test y familiarizados con las características típicas de la variedad, así como con los defectos mas frecuentes en el Cottage. Los cuatro tratamientos fueron evaluados en sabor, aroma, firmeza y sensación de humedad (13), en el Laboratorio de Análisis Sensorial del Instituto de Ciencia y Tecnología de los Alimentos de la Universidad Austral de Chile.

El análisis estadístico se cumplió mediante el análisis de varianza ANDEVA, previa comprobación del supuesto de homogeneidad de varianza realizado por el test de Levene. En aquellos casos donde hubo diferencias significativas, se aplicó el test de comparación múltiple de Tukey. Además, se llevó a cabo el análisis de covarianza, donde el tiempo de observación fue incluido como covariable. Todo el análisis estadístico se hizo en ambos niveles de significancia, 1% y 5%, y los resultados del estudio fueron analizados mediante el software Statgraphics Plus versión 5.1.

La tabla 1 presenta los resultados de pH, humedad y grasa del queso Cottage en los diversos tratamientos.

Tabla 1. Composición física y química del queso Cottage en los tratamientos (0 y 14 días de almacenamiento).

Los resultados obtenidos no presentaron diferencias significativas (P>0,05) entre tratamientos en los parámetros grasa, humedad y pH.

El pH de los quesos obtenido en los tratamientos fue entre 4,6 y 4, 8, valores considerados normales para la variedad (4, 12, 17).

La humedad del queso en los diferentes tratamientos resultó menor de 80%, lo que lo sitúa dentro de lo estipulado por la norma del Codex Alimentario (18); y no se dieron diferencias significativas (P>0,05) entre tratamientos; además, no varió en el tiempo ni entre tratamientos, lo cual indica que se efectuó un buen drenaje del suero antes del envasado y un adecuado sellado del gránulo durante el proceso. Paralelamente, la temperatura de almacenamiento de los quesos se mantuvo constante (4ºC) a través de los 21 días, lo que evitó una sinéresis inadecuada del suero en el queso durante el almacenamiento. Estos resultados son concordantes con los señalados por los jueces en la evaluación sensorial.

La grasa tampoco presentó diferencias significativas entre tratamientos (P>0,05); se mantuvo en el nivel programado en el estudio y acorde con la estandarización de grasa que se practicó en la crema.

La valoración de los resultados de viabilidad de los probióticos estudiados en esta investigación se presenta en la tabla 2 , al igual que los resultados del análisis estadístico; existen diferencias significativas (P<0,05) entre tratamientos, y la mayor diferencia corresponde al tratamiento con Lactobacillus casei 01.

Tabla 2. Evolución de los probióticos viables en queso Cottage (Log ufc/g +DE).

Día cero (0) de elaboración (24 horas de envasado): el tratamiento que registra los mayores recuentos el día cero de elaboración es el Cottage con Lactobacillus casei 01, que llega incluso a 10⁹ ufc/g, con incubación previa del probiótico de sólo 24 horas a 36ºC. y presenta diferencias significativas con Bifidobacterium BB12 y Lactobacillus acidophilus La-5, los cuales, además, requieren 48 horas previas de incubación a 36ºC para llegar a recuentos máximo de 10⁸ ufc/g. Esto tiene su explicación en los requerimientos más exigentes de estos dos microorganismos, y en el hecho de que la leche no es el mejor medio de cultivo para Bifidobacterium BB12 y Lactobacillus acidophilus (19, 20).

Día siete (7) de elaboración: El Lb. casei, heterofermentativo y menos exigente en sus requerimientos nutricionales es, sin embargo, el tratamiento que pierde mayor viabilidad al comienzo del almacenamiento (1 ciclo logarítmico), lo que puede obedecer a las condiciones de acidez y a la temperatura de refrigeración (4ºC) que parecen afectarlo; no obstante, considerando toda la vida útil del producto y los siete días posteriores estudiados, registra los niveles más altos de microrganismos, estableciendo una diferencia significativa con los otros tratamientos, Bifidobacterium BB12 y Lb. acidophilus La-5, pero entre estos últimos no se apreció una diferencia significativa (P>0,05).

Día catorce (14) de elaboración: La tendencia se mantiene. El Lb. casei sigue perdiendo viabilidad, el Bifidobacterium BB12 presenta igual recuento que el día cero, lo que quiere decir que no hay reducción de su población, y el Lb. acidophilus La-5 registra una ligera pérdida, ambos con diferencias significativas frente al Lb. casei.

Día veintiuno (21) de elaboración: El Lb. acidophilus es el probiótico que menos viabilidad pierde (menor a 0,5 ciclos logarítmicos) durante los 21 días de almacenamiento; en cambio, el Bifidobacterium BB12 registra la mayor pérdida en viabilidad (1 ciclo logarítmico durante los 21 días de almacenamiento). Estos datos coinciden con lo citado por Masuda et al., 2005 (11), quienes incorporaron Lb. acidophilus La-5 a un queso fresco, que se mantuvo sobre 10⁷ ufc/g durante tres semanas, sin sufrir alteraración en sus características organolépticas. Al parecer, este organismo se adapta muy bien a las condiciones adversas del medio, y puede incluso desarrollarse a pH menores de 5,0 (21).

La disponibilidad de oxígeno es quizás el factor que más afecta las bifidobacterias, que son anaerobias estrictas. Es así como los recuentos tienen grandes fluctuaciones que reflejan la complejidad de crecimiento del organismo, la baja tolerancia al medio ácido y, principalmente, la toxicidad debida al oxígeno, el cual generalmente es incorporado durante la agitación producida al mezclar la cuajada con la crema, y está en el espacio de cabeza propio del envase.

Los tratamientos con Lb. casei y Lb. acidophilus mantuvieron recuentos mayores a 10⁶ ufc/g hasta los 21 días de almacenamiento, a pesar de los mohos y levaduras, que alteraron las propiedades sensoriales del queso, no interfiriendo con la actividad de los microorganismos probióticos.

La tendencia en el recuento de células viables en el transcurso del almacenamiento fue decreciente en todos los tratamientos. Este dato destaca la importancia de lograr un alto recuento de microorganismos probióticos el día cero de elaboración del queso, puesto que no se observa desarrollo de organismos en este período y, por el contrario, la población decrece.

Calidad sensorial

La tabla 3 presenta los resultados emitidos por los jueces sobre la calidad sensorial de los tratamientos realizados en queso Cottage. Se observa que el sabor y la firmeza no presentaron diferencias significativas (P>0,05) entre tratamientos.

Tabla 3. Características sensoriales del queso Cottage.

El aroma se pudo percibir muy bien porque cada muestra individual se presentó sellada a los panelistas, pero los resultados arrojaron diferencias significativas entre tratamientos (P<0,05). El tratamiento control y el tratamiento con Lb. acidophilus La-5 resultaron homogéneos; en cambio, los tratamientos Lb. casei 01 y Bifidobacterium BB12 son significativamente diferentes. Bifidobacterium fue el preferido por los panelistas debido a su mejor aroma.

La diferencia en aroma se explica porque el Lb. acidophilus La-5 es homofermentativo y produce básicamente ácido láctico, a diferencia del Bifidobacterium BB12, que es heterofermentativo y produce varios compuestos aromáticos, particularmente al fermentar los citratos, que confieren aromas puros y atractivos al producto (19).

El análisis del atributo sensación de humedad registró diferencias significativas entre el tratamiento control y el tratamiento 2 (Lb. acidophilus) (P<0,05), probablemente relacionadas con la adición de cultivo a la crema, que aumenta la viscosidad porque el cultivo está coagulado y reduce el pH de la crema en 0,1 unidades, elevando así la viscosidad y mejorando la adhesión y la absorción de la crema por los gránulos de cuajada y, al reducir la grasa libre que recubre el grano, disminuye la sensación de humedad. El tratamiento control suscita mayor sensación de humedad que el tratamiento con el Lb.casei, este último con el menor pH, factor que, al parecer, afecta también el atributo sensación de humedad y marca la diferencia de los otros tratamientos con probióticos y del control.

No obstante, los resultados de la evaluación sensorial obtenidos en este estudio no son concluyentes porque, en general, los puntajes de los atributos sensoriales en los tratamientos están ligeramente por debajo del valor normal (3 ptos).

En la tabla 4 se puede apreciar la evolución del crecimiento de enterobacterias y, mohos y levaduras.

Tabla 4. Recuentos microbiógicos (Log ufc/g) del queso Cottage a los días 0, 7 y 14 días de almacenamiento.

Como se observa en la tabla 4 , al inicio, las enterobacterias obtuvieron recuentos dentro de los rangos permitidos por la legislación chilena (22) para queso fresco (<10³ ufc/g), pero éstos disminuyeron a partir del día 7 de almacenamiento en todos los tratamientos, lo que se atribuye principalmente a la baja tolerancia de estas bacterias a la acidez normal del queso Cottage.

Desde el primer momento los recuentos de Staphylococcus aureus fueron menores de 10 ufc/g en todos los tratamientos, lo que indica una buena manipulación durante la elaboración del queso.

Los recuentos de mohos y levaduras, principales responsables del deterioro del producto, se incrementaron durante el almacenamiento desde 2,9x10² hasta 5,3x10⁵ ufc/g. Los mohos y levaduras provienen del ambiente donde se elaboró y envasó el queso; es así como los cuatro tratamientos no presentaron diferencias significativas entre ellos en los recuentos de S. aureus, enterobacterias, y mohos y levaduras.

Los organismos probióticos que se agregan en el procesamiento de queso Cottage, Lb. casei 01, Lb. acidophilus La-5 y Bifidobacterium BB12, permanecen viables y en número superior a 10⁶ ufc/g durante la vida útil (día 14) del producto mantenido en refrigeración (4ºC).

De las tres cepas evaluadas, el Lactobacillus acidophilus La-5 es el que registra una menor reducción de población de microorganismos durante el almacenamiento del queso Cottage y su recuento se mantiene alto hasta pasados 21 días de almacenamiento.

La calidad microbiológica de los productos con agregado de organismos probióticos, evaluada mediante recuento de S. aureus, enterobacterias, y mohos y levaduras, estuvo dentro de las especificaciones que establece la Reglamentación Sanitaria Chilena, hasta el día 14 de almacenamiento a 4ºC.

Respecto a las características sensoriales del queso Cottage elaborado con agregado de Lb. casei 01, Lb. acidophilus La-5 y Bifidobacterium BB12, los productos resultaron afectados ligeramente en los atributos de aroma y sensación de humedad, no así en los atributos sabor y firmeza de grano; no obstante, los valores encontrados en todos los tratamientos fueron ligeramente inferiores al considerado normal.

Los autores agradecen a la Dirección de Investigación de la Universidad Austral, por su apoyo a esta investigación. Proyecto DID – UACh S- 2006-53, Prospección de desarrollo de un producto lácteo funcional: queso tipo Gouda reducido en grasa láctea y en sodio, adicionado de probióticos y prebióticos. 2006 - 2008.(Investigadora principal Carmen Brito C.).

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* Autor a quien debe dirigir la correspondencia: cbrito@uach.cl