El extracto crudo y la fracción orgánica de la esponja marina Cliona delitrix, recolectada en San Andrés Islas (Caribe Colombiano), muestra actividad antifouling en ensayos de campo. La fracción orgánica es separada por cromatografía en columna logrando obtener fracciones enriquecidas en glicéridos, glicolípidos, fosfolípidos, ácidos grasos libres, ésteres metílicos y monohidroxiesteroles. Cada una de las fracciones es identificada de manera preliminar por TLC y técnicas de dereplicación (RMN). Los ácidos grasos obtenidos de la hidrólisis de cada una de las fracciones de glicéridos, glicolípidos y fosfolípidos son transformados en sus correspondientes ésteres metílicos, los cuales son analizados por CGAREM; luego se convierten en sus derivados pirrolidínicos y también se analizan por CG-EM. El estudio cuidadoso de los EM, tanto del éster metílico como de las pirrolidina, y los valores de ECL permiten identificar 89 ácidos grasos diferentes. Entre éstos se destacan: el ácido 7,10,12,14-icosatetraenoico, que se reporta por primera vez, y los ácidos 5,9-hexacosadienoico y hexadecanoico, por ser los más abundantes en todas las fracciones. Adicionalmente se identifican, mediante análisis de CG-EM y ¹H-RMN, 19 monohidroxiesteroles. Se destacan el colestanol y el clionasterol, por ser los más abundantes, y también es de notar la presencia de estanoles (cerca del 30%) que no se habían informado antes para este género.

Palabras Clave:Cliona delitrix, lípidos, ácidos grasos, esteroles, antifouling.

In a field test for antifouling activity the raw extract and the organic fraction obtained from the marine sponge Cliona delitrix, collected at the San Andrés Islas (Colombia, Caribbean Sea), showed activity. The organic fraction was separated by column chromatography to obtain enriched fractions of glycerides, glycolipids, phospholipids, free fatty acids, fatty acids methyl esters (FAMEs) and monohydroxysterols identified by TLC and dereplication techniques (NMR). The glyceride, glycolipid, and phospholipid fractions were hydrolyzed, and the fatty acids methyl esters obtained, together with the initial fatty acids fraction were converted into their methyl esters and analyzed by HRGC-MS. In order to locate unsaturations and alkyl branches in fatty acids, their methyl esters derivates were transformed to the corresponding pyrrolidides and subsequently analyzed by HRGC-MS. The identification of the fatty acids was carried out using their ECL value as methyl esters, and particularly the study of their pyrrolidide spectra was used to locate unsaturations and alkyl branch positions. The analysis allowed the identification of 89 fatty acids. The main acids include the new 7,10,12,14-icosatetraenoic acid, as well as 5,9-hexacosadienoic acid and hexadecanoic acid. Additionally, 19 monohydroxysterols were identified by HRGC-MS and NMR ¹H. Cholestanol and clionasterol were the most abundant compounds and the stanols presence (near to 30%) was not previously reported for this genus.

Keywords: Cliona delitrix, lipids, fatty acids, sterols, antifouling.

Los organismos marinos han mostrado ser una fuente de compuestos químicos de estructuras muy diversa, y en muchos casos con potente actividad biológica. Es notoria la enorme diversidad química de las esponjas, los corales, y más recientemente los microorganismos. Esta diversidad química puede obedecer a la interacción entre ellos; así, en invertebrados, la producción de compuestos químicos puede tener propósitos diversos, tales como evitar la depredación, capturar presas, combatir microorganismos, o detener el fouling, entre otros (1-2). El fouling marino se entiende como un proceso de deposición de moléculas seguido del asentamiento y desarrollo de organismos vivos sobre las superficies sumergidas. Este fenómeno obedece a la necesidad que tienen muchos organismos marinos de asentarse para su desarrollo, y hace parte de la competencia natural por colonizar y defender el espacio adquirido en el bentos, recurso que es muy limitado en el mar (3-4); así, los organismos bentónicos pueden producir sustancias químicas que los ayuden a controlar ese proceso (compuestos antifouling) (5).

Por otra parte,se sabe que también hay moléculas químicas que actúan como inductores del asentamiento de larvas de los organismos que hacen parte del fouling. Algunas de las más representativas son la serotonina, que induce el asentamiento y metamorfosis de Balanus amphitrite; la histamina, involucrada en la percepción de luz/oscuridad de estos balanos, que de esta manera influye en su asentamiento (9). También se ha visto que algunos derivados bromados de la serotonina, como la barrettina y 8,9-dihidrobarrettina, aislados de la esponja Geodia barretti, compiten por los receptores de la serotonina en los cirripedios, actuando así como inhibidores del asentamiento de las larvas de cirripedios más que como inductores (3).

La esponja excavadora e incrustante Cliona delitrix Pang, 1973 (Orden: Hadromerida; familia: Clionaidae) mantiene su superficie limpia de epibiontes y es capaz de colonizar y defender su sustrato (10-11), por lo que puede ser una fuente interesante de compuestos con actividad antifouling. No obstante, sólo hay un reporte sobre la química de esta especie, recolectada en Bahía, Brasil (12). En cuanto al género, se ha encontrado que es fuente de alcaloides peptídicos (13), de aminoácidos (11), de esteroles modificados (14) y de lectinas (15). También se estudiaron los lípidos de otras especies de este género, como los esteroles de Cliona caribbaea (16), esteroles y ácidos grasos de C. celata (17-18), esteroles de C. viridis (19), fosfolípidos de C. aprica (20), y recientemente ácidos grasos de C. tenuis (21). Estos lípidos aislados de fuentes marinas han mostrado actividad citotóxica, fungicida, inmunoestimulatoria, de inhibición enzimática (2, 22) y algunos ácidos grasos tienen posibilidades de aplicación como agentes antifouling (8, 23-25), por lo que actualmente se hacen esfuerzos tendientes a obtenerlos mediante síntesis química (26-27).

Por todo lo anterior, y con el fin de contribuir al conocimiento de los lípidos del género Cliona, este estudio expone los resultados sobre la determinación de actividad antifouling del extracto crudo de Cliona delitrix y la caracterización química de la fracción lipídica responsable de dicha actividad.

Recolección de muestras

Individuos de la esponja marina C. delitrix fueron recolectados, con ayuda de cincel y martillo, en buceo autónomo en la localidad de Wildlife, Isla de San Andrés (Colombia), a una profundidad entre 6 y 10 m, en los meses de mayo de 2003 y septiembre de 2004. Los organismos congelados (-30°C) fueron enviados a Bogotá para su estudio. Ejemplares de dicho material fueron identificados por el profesor Sven Zea S., del Departamento de Biología de la Universidad Nacional de Colombia, y un espécimen fue depositado en la colección de INVEMAR con el código INV-POR 629.

Equipos de análisis y materiales

Para la CCD se emplearon cromatoplacas de gel de sílica HF₂₅₄ Merck, observadas con lámpara ultravioleta a 254 y a 366 nm y reveladas con solución de ácido fosfomolíbdico (al 20% en etanol); además, para la detección de glicolípidos se utilizó H₂SO₄-α-naftol (al 5% en metanol), y para los fosfolípidos, azul de molibdeno (0,5% en H₂SO₄ diluido). Los espectros de RMN fueron registrados en un equipo Brucker-400 (¹³C a 100 MHz), empleando CDCl₃ y CD₃OD como solventes y TMS como referencia interna. Los análisis por CLAE se llevaron a cabo en un cromatógrafo Merck-Hitachi L-6000A, equipado con un detector de índice de refracción Merck LaChrom L-7490. Los análisis por cromatografía de gases de alta resolución-espectrometría de masas CGAR-EM se efectuaron en un cromatógrafo Shimadzu GC-17A acoplado a un espectrómetro de masas QP5050A (IE a 70eV), empleando una columna capilar de sílica fundida DB-1 de 25 m x 0,25 mm d. i., 0,25 μm de espesor de película y como gas de arrastre helio a 1 mL/min.

Extracción y fraccionamiento de los lípidos

Aislamiento de compuestos polares

La subfracción butanólica WB (5 g) se pasó por una columna cromatográfica empacada con 750 g de resina XAD-4, lavando con 2 L de agua 1 mL/min. La fracción orgánica retenida se eluyó c on 1,5 L de metanol y 3 L de metanol:diclorometano 8:1. Esta fracción se separó luego con Sephadex LH-20 (3.0 cm x 85 cm), eluyendo con metanol a 1 mL/min. Mediante análisis por CCD sobre gel de sílice con la fase móvil butanol:ácido acético:agua (12:3:5), y por RMN ¹H, RMN ¹³C, se reunieron 12 fracciones. La fracción 2 fue purificada por CLAE (30), en RP-18 (Columna Scharlau Science, Nucleosil, de 300 x 8 mm, 10 μm), usando agua:metanol (97:3) con TFA al 0,05% a 1 mL/min, y detector de índice de refracción, obteniendo así la serotonina (90% de WB). Su identificación se hizo por RMN ¹³C, y comparación con datos de literatura (31-32). Adicionalmente, una porción de la subfracción WW (62 g) se pasó por una columna de XAD-4 en agua, la fracción adsorbida fue luego eluida con acetona, metanol y diclorometano. Este residuo se purificó por cromatografía en Sephadex LH-20 con H₂O:MeOH (9:1), obteniendo el compuesto 1H-imidazol-2(3H)-imina (169 mg) puro, cuya identificación se hizo por RMN ¹H y ¹³C, y comparación con datos de la literatura (33).

Preparación de los ésteres metílicos de ácidos grasos y sus derivados N-acilpirrolididas

Las fracciones de ácidos libres, acilglicéridos, glicolípidos y fosfolípidos fueron convertidas a sus respectivos ésteres metílicos por reacción con hidróxido de potasio metanólico (10%) y luego con BF₃-MeOH (14%). Los ésteres metílicos fueron extraídos con hexano, y el extracto orgánico, luego de ser secado sobre NaSO₃ anhidro, fue concentrado. Para obtener los derivados pirrolidida, a 1 a 2 mg de los ésteres metílicos disueltos en pirrolidina (0,1 mL) se les adicionó ácido acético (0,01 mL) y la mezcla fue calentada a 110°C durante dos horas; una vez llevada a temperatura ambiente, la mezcla fue extraída con diclorometano, la fase orgánica se lavó con HCl 1M y tres veces más con agua en porciones de 1mL. Finalmente fue secada sobre NaSO₄ anhidro y purificada por cromatografía en columna sobre sílica gel (34).

Análisis por CGAR-EM de los ésteres metílicos y pirrolididas de ácidos grasos

Los ésteres metílicos (muestra de 1 mg/mL) fueron analizados por CGAR-EM con el siguiente programa de temperatura: 5 min isotérmica a 100°C, incremento a 4°C/min hasta 300°C durante 40 min. La temperatura del inyector y detector fue mantenida a 300°C. Para las pirrolididas (muestra de 1 mg/mL) se usó un programa de temperatura desde 200°C durante 5 min, calentando a 4°C/min hasta 300°C durante 55 minutos. En la identificación de los ácidos grasos y sus derivados se analizaron los índices de retención ECL (longitud equivalente de cadena, por sus siglas en inglés) y los datos del espectro de masas de cada compuesto. La cuantificación se llevó a cabo por el método de normalización de áreas en CGAR.

A continuación se presenta el índice de retención ECL y los datos del espectro de masas del ácido graso nuevo.

7,10,12,14-icosatetraenoato de metilo (44): ECL 19.46; EM, m/z 318 (M⁺, 1%), 289 (1%), 267 (1%), 249(1%), 235 (1%), 217 (1%), 191 (2%), 161 (6%), 147 (4%), 133 (7%), 119 (10%), 105 (12%), 93 (40%), 91 (50%), 79 (100%), 67 (80%).

Pirrolidida del ácido 7,10,12,14-icosatetraenoico (44): EM, m/z 357 (M⁺, 5%), 342 (1%) 328 (4%), 314 (3%), 300 (1%), 286 (1%), 273 (1%), 260 (2%), 247 (1%), 234 (2%), 221 (1%), 208 (8%), 194 (2%), 181 (1%), 168 (12%), 154 (6%), 140 (12%), 126 (75%), 113 (100%), 98 (50%).

La fracción esterólica, obtenida a partir de la subfracción FH, se separó por CLAE semipreparativa y cada fracción obtenida se analizó por CGAR-EM. La CLAE se realizó con una columna ShimpackCLC-ODS (150 mm x 6 mm, 5 μm), con metanol como fase móvil (1,0 mL/min), y la CGAR-EM se hizo en la columna DB-1 mencionada antes, a una temperatura de 300ºC y un flujo de 1mL/min. Como criterio de identificación se usaron los espectros de masas y el valor del tiempo de retención relativo al colesterol. Para algunas características estructurales, tales como la estereoquímica en el C-24, se empleó la RMN ¹H (400 MHz). La cuantificación de los esteroles se llevó a cabo por el método de normalización de áreas tanto en CGAR como en CLAE (35).

Ensayo en campo de actividad antifouling

Para este ensayo se utilizaron geles de Phytagel^TM siguiendo la metodología usada por Henrikson and Pawlik (36), y empleando cajas de petri (90 mm de diámetro x 10 mm de altura) para verter los geles con los extractos de prueba, ECT (63 mg/mL), WW (51 mg/mL), WB (6,5 mg/mL) y NP (5 mg/mL), obtenidos de la esponja. Los geles control se prepararon mezclando la misma cantidad de Phytagel y agua, y agregando la cantidad equivalente de metanol o diclorometano empleados en el proceso de disolución de las fracciones. Las cajas fueron amarradas bocabajo, con los geles en dirección al sustrato, en dos andamios de tubos de PVC, y se sumergieron a 8 m de profundidad en Punta de Betín (Santa Marta) durante 30 días. Los experimentos tuvieron lugar en marzo de 2005 y durante marzo y abril de 2006. Luego se sacaron del mar, teniendo cuidado de mantenerlas siempre sumergidas en agua marina, y se llevaron a los laboratorios de INVEMAR donde se colocaron en acuarios con flujo continuo de agua marina filtrada. Bajo el estereoscopio se evaluó la abundancia y porcentaje de cobertura de organismos sésiles. Se hicieron comparaciones entre estas variables en extractos crudos, fracciones y el control por medio de las pruebas estadísticas Kruskal-Wallis y Dunn y ANOVA (37).

Actividad antifouling de los extractos de Cliona delitrix en campo

La esponja C. delitrix enseña una superficie libre de macroorganismos, por lo cual resultó interesante valorar la capacidad antifouling del extracto crudo y hacer un monitoreo bioguiado. Con tal fin se ensayaron las fracciones y el extracto crudo disueltos en Phytagel atendiendo la metodología de Pawlik (38). Como resultado de los ensayos en campo se encontró que el ECT tiene un efecto antifouling estadísticamente significativo como se indica em la tabla 1, pues tanto la abundancia como la cobertura de organismos epibiontes disminuyeron notablemente con su uso. En el ensayo se encontró también que la fracción no polar NP presentó el menor número de organismos en la superficie del gel y el menor porcentaje de cobertura, mientras la fracción acuosa WW y la butanólica WB no mostraron actividad significativa.

Tabla 1. Ensayo de actividad antifouling: abundancia y cobertura de organismos encontrados sobre los geles después de un mes en campo. Extracto y fracciones de C. delitrix.

Así, se pudo establecer que en la fracción lipídica (NP) se concentró la actividad antifouling exhibida por el ECT de esta esponja.

De la subfracción butanólica WB de C. delitrix fue purificado como metabolito mayoritario la serotonina (5-hidroxitriptamina), reconocido neurotransmisor de los animales con sistema nervioso. La serotonina había sido previamente aislada como metabolito del extracto metanólico de la esponja Hyrtios reticulatus (32) y de un ejemplar de C. delitrix, recolectado en Salvador de Bahía, Brasil (12). Además, a partir de la subfracción acuosa WW, también inactiva al ensayo antifouling, se purificó otra amina heterocíclica identificada como imidazol-2(3H)-imina, la cual es parte estructural de varias sustancias farmacológicamente activas de compuestos naturales como los alcaloides marinos isonaamina, dorimidazol y preclatridina (33).

La actividad antifouling de la fracción no polar se puede considerar muy importante para la supervivencia de la esponja, porque le permite mantener su superficie libre de epibiontes, resistiendo a la ocupación de su espacio superficial por otros organismos. Se pueden considerar los compuestos responsables de esta actividad particularmente activos porque, por la gran cantidad de serotonina que contiene esta esponja, se esperaría un notable asentamiento larval (de cirripedios en particular), dadas las propiedades promotoras conocidas del asentamiento de la serotonina y sus agonistas (9, 39), situación que no se observó en nuestros ensayos de campo donde, por el contrario, la esponja presentó una superficie limpia. No obstante, es importante mencionar que no existe ninguna evidencia de que la serotonina sea liberada por este organismo hacia su superficie, y en consecuencia, las larvas de los invertebrados colonizadores no podrían detectar la presencia del inductor.

Por otra parte se sabe que a los lípidos de fuentes marinas, como es el caso de algunos esteroles (40), esfingolípidos (23), glicerolípidos y ácidos grasos

(8, 25) se les ha reconocido actividad antifouling. Esta clase de compuestos se detectaron también en la fracción bioactiva y no polar NP de C. delitrix, y por ello el estudio de la composición química de la fracción lipídica de la esponja resultó de gran interés.

Composición de ácidos grasos en la fracción lipídica

La cromatografía en columna permitió, a partir de la fracción no polar NP, la separación de fracciones enriquecidas en ésteres metílicos, glicéridos, glicolípidos, fosfolípidos y ácidos libres, como se describió en la sección experimental. Cada fracción fue identificada por su movilidad y aspecto del revelado por CCD con respecto a los patrones de los lípidos respectivos, así como por el análisis de los espectros de RMN de protónica y carbono. Los ácidos grasos componentes de cada fracción lipídica fueron luego transformados a sus ésteres metílicos y pirrolididas. La asignación estructural de los ácidos grasos se hizo mediante la comparación del parámetro cromatográfico ECL (longitud equivalente de cadena, de sus siglas en inglés) y el estudio de los espectros de masas de los ésteres metílicos, con los valores o con los espectros registrados en la literatura y los obtenidos por nosotros para muestras verdaderas (21, 41). La posición de las insaturaciones y de las ramificaciones se asignó mediante el estudio detallado del espectro de masas de las pirrolididas obtenidas (42, 43). Las técnicas aquí empleadas tienen una limitación: no es posible la asignación de la estereoquímica de los dobles enlaces si no se cuenta con los patrones de cada diastereoisómero. La cuantif icación se efectuó por el método de normalización de áreas, tanto en el TIC como en el cromatograma. En la tabla 2 pueden observarse los ésteres metílicos de los ácidos grasos identificados en la fracción de ésteres metílicos libres, y aquellos obtenidos por transformación química a partir de glicerolípidos, glicolípidos, fosfolípidos y ácidos libres, indicando su peso molecular y abundancia relativa en cada caso. Adicionalmente se indica el valor promedio de ECL para cada uno de ellos.

Tabla 2. Ácidos grasos^a de las fracciones de ésteres libres, glicéridos, glicolípidos, fosfolípidos y ácidos grasos libres de la esponja marina Cliona delitrix.

Dentro del conjunto de ácidos grasos de Cliona delitrix se destaca el ácido 7,10,12,14-icosatetraenoico (No 44), que por primera vez se reporta como un compuesto natural. Algunos otros, como el ácido 4,8-hexadecadienoico (No 12), ácido 6,9,12,14-icosatetraenoico (No 42) y el ácido 6,9,12,14,17-icosapentenoico (No 43), son muy poco frecuentes en la naturaleza, y se han hallado en otra de las especies de este género, la Cliona tenuis (21).

y el ión m/z 113, resultante de una ruptura entre el C-2 y el C-3 y con transposición de hidrógeno del tipo McLafferty se indican en la figura 1.

Figura 1. Espectro de masas y los fragmentos diagnóstico de la pirrolidida del ácido 7,10,12,14-icosatetraenoico (No 44), obtenidos por espectrometría de masas en el modo de ionización electrónica.

La forma general del espectro es típica de la pirrolidida de un ácido graso con cuatro dobles enlaces. A partir de los fragmentos observados se encuentra que los dobles enlaces se localizan en las posiciones C-7, C-10, C-12 y C-14, de acuerdo con la diferencia de 12 u.m.a entre los fragmentos m/z 181 y m/z 168, m/z 221 y 208, 247 y 234 y entre m/z 273 y m/z 260, así como la presencia de los fragmentos m/z 140, 154, 168, 194, 208, 234, 260, 286, 300, 314, 328 y m/z 342 (datos de ECL y de los espectros de masas se incluyen en la parte experimental). Todo lo anterior confirma la estructura del éster metílico del ácido 7,10,12,14-icosatetraenoico. El valor ECL de 19,46 de este compuesto no se encuentra reportado en la literatura para un ácido graso con las características antes mencionadas. La elucidación estructural del resto de los ésteres metílicos se hizo de la misma manera, permitiendo la identificación de 89 ácidos grasos en esta especie.

Al comparar la composición de ésteres metílicos de ácidos grasos en algunos lípidos de C. delitrix se halló que en la fracción de ésteres metílicos libres, el ácido 5,9-hexacosadienoico (No 79; 18,5%) es el más abundante, seguido del 6,9,12,14-icosatetraenoico (No 42; 8,8%), el ácido 17-hexacosenoico (No 82; 6%) y el hexadecanoico (No 16; 5,4%). En la fracción de glicéridos se pudo advertir que el ácido 5,9-hexacosadienoico (No 79; 12,6 %) es mayoritario; los ácidos restantes tienen cantidades inferiores al 10%, y se destacan el 6,9,12,14-icosatetraenoico (No 42; 6,7%) y el hexadecanoico (No 16; 3,9%). Entre los ácidos identificados en la fracción de glicolípidos se apreció que el hexadecanoico (No 16; 17,8%) prevalece, y que los restantes son inferiores al 10; son también abundantes el 5,9-hexacosadienoico (No 79; 9,3%), el tetradecanoico (No 6; 6,8%), el 5,9-octadecadienoico (No 28; 5,4%) y el octadecanoico (No 33; 5,1%). En la fracción de fosfolípidos se encontró que el ácido 5,9-hexacosadienoico (No 79; 27,7%) está en mayor cantidad. Todos los ácidos restantes de esta fracción son inferiores al 10%, como los ácidos 5,8,11,14-icosatetraenoico (No 41; 6,6%), hexadecanoico (No 16; 5,6%) y el 17-hexacosenoico (No 82; 5,4%). En la fracción de ácidos libres se encontró que los ácidos 5,9-hexacosadienoico (No 79; 24,9%) y hexadecanoico (No 16; 11,6%) se destacan. Los ácidos restantes son inferiores al 10%, entre ellos los ácidos 9-hexadecenoico (No 14; 5,2%), 4,8,12-trimetiltridecanoico (No 7; 4,5%) y el tetradecanoico (No 6; 4,0%).

Con respecto a la composición de ésteres metílicos agrupados por características estructurales en C. delitrix, se encontró que los ácidos grasos de cadena par y no ramificada predominan en todas las clases de lípidos, como se evidencia en la figura 2a y en la figura 2b, respectivamente.

Figura 2. Abundancia relativa de los ácidos grasos agrupados por características estructurales y tipos de lípidos en C. delitrix. 1. Ésteres metílicos libres, 2. Glicéridos, 3. Glicolípidos, 4. Fosfolípidos y 5. Ácidos grasos libres.

En la figura 2c, se observa que los ácidos demospóngicos, aquellos con más de 24 átomos de carbono (44), prevalecen sólo en la fracción de fosfolípidos, donde están en un 1,5% más que los de cadena más corta; en los otros casos son minoritarios; no obstante, en todas las clases de lípidos aquí estudiadas, su proporción es superior al 10%, y llega a ser casi la mitad en los glicerolípidos. Se puede apreciar que los ácidos grasos con cadena Δ^5,9, indicados en la figura 2d, se distinguen en C. delitrix y que, en general, su concentración es superior al 20% en toda la variedad de lípidos estudiados, lo cual ha mostrado ser común en porífera y no en otros taxones.

De acuerdo con las investigaciones precedentes para esponjas del género Cliona, era de esperarse una mayor abundancia de ácidos isoprenoides porque los ácidos grasos tipo terpenoide: 15, 18, 21, 24-triacontatetraenoico y 4, 8, 12-trimetiltridecanoico han sido propuestos como quimiotrazadores para las familias Spirastrellidae y Clionidae, donde se ubica éste género (20). Pero este dato no se verifica en nuestros resultados con C. delitrix y C. tenuis (21). En otras investigaciones, a los ácidos grasos con cadena ramificada se les atribuye un origen bacteriano, en el caso específico del TMTD la transformación del fitol, que a su vez se produce por la transformación de la clorofila por cianobacterias (45). Esto concuerda con la observación en campo, en el sentido de que C. delitrix no tiene zooxantelas asociadas, en contraparte con las otras especies de Cliona presentes en el Caribe Colombiano. Es importante anotar que los ácidos grasos insaturados son elevados en todas las clases de lípidos estudiados, con una distribución heterogénea y una preponderancia de los ácidos grasos mono- y diinsaturados, como se evidencia en la figura 2f.

Otros estudios acerca de lípidos de esponjas del género Cliona en cuanto a la composición de sus ácidos grasos, muestra que en C. celata, (18), esponja recolectada en el Atlántico noroccidental, los ácidos demospóngicos son mayoritarios (79%), con gran representación de ácidos de más de 30 átomos de carbono, seguidos por los de 25 y 27 carbonos, mientras en C. aprica, esponja recolectada en el mar Caribe (20), son minoritarios (40%), pero se destaca la abundancia de los ácidos tetracosanoico (16,7%) y 5,9-hexacosadienoico (15,1%). Nuestros resultados concuerdan con los de C. aprica, ya que los ácidos desmospóngicos en C. delitrix están en una proporción cercana al 40%; sobresale también la presencia del ácido 5,9-hexacosadienoico en la fracción de fosfolípidos. No se halló correlación entre las otras clases de ácidos grasos de C. delitrix con los de estas dos especies de esponjas, en tanto que al comparar los ácidos grasos de C. delitrix con los de Cliona tenuis, se encuentra que los de cadena par y no ramificados igualmente predominaron entre todos los lípidos de C. tenuis, al igual que los ácidos grasos mono y diinsaturados, excepto en la fracción de ácidos grasos libres, donde se hallaron en abundancia inferior al 10% en C. tenuis (21). Los ácidos de cadena larga, en cambio, se observan en menor porcentaje entre los diferentes lípidos de C. tenuis y prevalecen sólo entre los glicolípidos (un 40%). La abundancia relativa de los ácidos grasos de cadena Δ^5,9 fue tan baja como en C. delitrix, aunque más heterogénea, del 35,7% en la fracción de ésteres metílicos libres y tan sólo de un 2.6% en la de los ácidos libres de C. tenuis. Similar comportamiento tienen los ácidos grasos tipo isoprenoide, que representan el 3,4% de la fracción de fosfolípidos, el 2,1% de la fracción de glicolípidos y están ausentes entre los ésteres metílicos libres de C. tenuis.

Por otra parte, el ácido 5,8,11,14-icosatetraenoico, No 41 (ácido araquidónico), presente en fosfolípidos y glicolípidos de Cliona delitrix, y el ácido 9-octadecenoico No 31 (ácido palmitoleico), presente en todas las mezclas de compuestos estudiados, pueden contribuir a las propiedades antiepibióticas de la fracción lipídica, por sus reconocidas características antifouling (8, 25).

Composición de monohidroxiesteroles en la fracción lipídica

Las esponjas representan una rica fuente de esteroles con estructuras sin precedentes, cuyas combinaciones pueden caracterizar a nivel taxonómico algunos órdenes, familias y géneros del phylum. A continuación, informamos también sobre el conjunto de esteroles identificados en la fracción no polar de Cliona delitrix, datos que no han sido publicados con anterioridad.

En la tabla 3 aparece la identidad de cada esterol identificado, su tiempo de retención relativo en CGAR o en CLAE, obtenidos como se describió en la parte experimental.

Como puede observarse en la tabla 3, se identificaron para la esponja C. delitrix 19 monohidroxiesteroles diferentes, cuyas cadenas y núcleos convencionales se indican en la figura 3 .

Tabla 3. Composición de monohidroxiesteroles de C. delitrix.

Son los más abundantes el colestanol (No 6; 24,8%), clionasterol (No 16; 18,1%), (22E, 24R^*)24-metilcolesta-5,22-dien-3b-ol (No 8; 16,1%), sitosterol (No 17; 12%), poriferasterol (No 13; 9,1%) y el colesterol (No 5; 6,6%). Todos estos esteroles son de amplia distribución en el phylum Porifera. Los esteroles del género Cliona han sido estudiados desde el siglo pasado y, según Valentine y Bergmann (46), es el clionasterol el más sobresaliente. En otras esponjas de este género, como C. caribbaea (16), C. celata (17), C. viridis (19) y C. aprica (20), se han hallado también en gran cantidad el clionasterol y colesterol. Sin embargo, en Cliona delitrix resulta bastante notoria la abundancia de estanoles Δ⁰, como el colestanol (cercana al 25%), puesto que en ninguna de las otras especies del género Cliona hasta ahora estudiadas en la bibliografía, pueden observarse este tipo de esteroles.

Finalmente, aunque en la literatura no exista evidencia de esteroles como los anteriores con actividad antifouling, otros estudios han demostrado cómo algunos esteroides de esponjas sí poseen dicha bioactividad, Así, de la esponja marina Lendenfeldia chondrodes se aislaron cuatro epidioxi esteroles con actividad antifouling contra el mejillón Mytilus edulis galloprovincialis (40), y de la esponja Acanthella cavernosa se aislaron tres A-noresteroles, con actividad antifouling debida a la inhibición del asentamiento de Balanus albicostatus (47).

En conclusión, en un ensayo en campo se encontró que la fracción lipídica del extracto de C. delitrix era la responsable de la actividad antifouling, porque condujo al menor porcentaje de recubrimiento superficial por parte de otros organismos. Se reconoció que aunque la serotonina, inductor del asentamiento larval, es abundante en C. delitrix, su superficie se encuentra marcadamente limpia, probablemente porque este metabolito no es liberado por el organismo hacia su superficie, o porque contiene compuestos con actividad antifouling muy potente. Se determinó también que la fracción lipídica está constituida por ésteres metílicos, glicéridos, glicolípidos, fosfolípidos, ácidos libres y esteroles. En cada fracción se estableció el contenido de ácidos grasos, identificando el ácido 7,10,12,14-icosatetraenoico, no reportado antes en la literatura, y 88 ácidos conocidos, además de 19 esteroles comunes. Este trabajo es el primero acerca de la caracterización lipídica de la esponja marina Cliona delitrix.

Agradecemos a Colciencias (COL-20101007015), Fundación para la promoción de la investigación y la tecnología (Banco de la República), y a la Universidad Nacional de Colombia (DIB), por la financiación del presente estudio. Leonardo Castellanos agradece a la Universidad Nacional de Colombia por la comisión de estudios de doctorado.

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* Autor a quien debe dirigir la correspondencia: cduqueb@unal.edu.co