Marielsa Gil1³ González Luis² Mendoza Vanessa³ Ochoa Maureen³ Castrülo Smirna⁴ Sánchez Julieta⁵ Briceño Andris ³

marielsagilfd@hotmail.com

1    Bioanalista Microbiólogo, Docente e Investigador del Departamento de Microbiología de la Universidad de Carabobo, Venezuela. Jefe del Laboratorio de Diagnóstico Bacteriológico de la Escuela de Ciencias Biomédicas y Tecnológicas, Universidad de Carabobo Venezuela.

2    Bioanalista Micólogo, Jefe del Laboratorio de Micologia de la Escuela de Ciencias Biomédicas y Tecnológicas, Universidad de Carabobo Venezuela. Presidente de la Sociedad Venezolana de Microbiología Capítulo Carabobo, Docente de la Facultad de Odontología de la Universidad de Carabobo, Venezuela.

3    Bioanalista, Laboratorio de Diagnóstico Bacteriológico, Escuela de Ciencias Biomédicas y Tecnológicas, Universidad de Carabobo Venezuela.

4    Bioanalista, Magíster en Investigación Educativa, Doctora en Ciencias Sociales, Docente del Departamento de Metodología de Investigación y Desarrollo Profesional de la Escuela de Bioanálisis, Universidad de Carabobo, Venezuela.

5    Bioanalista Microbiólogo, Laboratorio Clínico la Viña, Estado Carabobo, Venezuela.

Fecha de envío: 22/08/216

Fecha de aceptación 27/07/2017 

Fecha de publicación: 31/07/2017

Resumen

El objetivo de la investigación fue evaluar la capacidad de formación de biopelículas en especies del género Candida provenientes de muestras clínicas con procesos infecciosos. La muestra estuvo constituida por 70 aislados obtenidos de laboratorios clínicos privados. Para la identificación de las especies se utilizó la Prueba de tubo germinativo y la técnica de microcultivo en agar harina de maíz con tween 80, mientras que la cuantificación de la capacidad de formación de biopelículas se realizó por la técnica de microplaca de poliestireno. Entre los resultados obtenidos en la investigación las especies aisladas fueron: Candida glabrata (34%), Complejo Candida albicans (30%), Complejo Candida parapsilosis (27%) y Candida tropicalis (9%), de las cuales 41 aislados (59%) formaron biopelículas, resultando el Complejo Candida albicans y Candida glabrata las especies con mayor grado de formación de biopelículas con 29% cada una, seguida de Complejo Candida parapsilosis con 27% y Candida tropicalis con 15%. Las cepas que tuvieron mayor formación de biopelículas provenían de orina, seguidas de secreción ótica, secreción vaginal y sangre, sin embargo al aplicar la prueba de Chi-cuadrado (x²) de Pearson se determinó que no existe asociación estadísticamente significativa entre la capacidad de formación de biopelículas y el grado de formación con la procedencia clínica así como tampoco hay asociación entre la capacidad de formación de biopelículas y grado de formación con la especie involucrada (p > 0,05).

Palabras clave: Biopelículas, Candida, procedencia clínica.

Copyright © Facultad de Ciencias de la Salud de la Universidad Tecnológica de Pereira. 1995-2017. Todos los derechos reservados ®

Abstract

Capability of biofilm formation in Candida genus species of clinical origin.

The aim of this research was to evaluate the capability of biofilm formation in Candida genus species from clinical samples with infectious conditions. The sample consisted of 70 isolates obtained from private clinical laboratories. Germ tube test and agar cornmeal with tween 80 microculture technique were used as species identification, meanwhile, quantification of biofilm formation capacity was performed by the polystyrene microplate technique. Among the results obtained in the research, isolated species were: Candida glabrata (34%), Candida albicans Complex (30%), Candidaparapsilosis Complex (27%) and Candida tropicalis (9%), of which 41 isolates (59%) formed biofilms, resulting Candida albicans and Candida glabrata Complex species with the highest degree of biofilms with 29% each, followed by Candida parapsilosis Complex with 27% and Candida tropicalis with 15%. Strains with more biofilm formation came from urine, followed by ear discharge, vaginal secretion and blood. However, by applying the Chi squaretest the Pearson, it was determined that there was no statistically significant association between thecapability of biofilm formation and the formation degree with clinical origin, neither there is association between the ability of biofilm formation and the formation degree with the species involved (p> 0.05).

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Introducción

El género Candida está constituido por un gran número de especies, entre las que se encuentran Complejo C. albicans, C. glabrata, C. tropicalis, Complejo C. parapsilosis, C. krusei, C. guilliermondii, entre otras [1].

Entre los factores de patogenicidad del género Candida se destacan: las adhesinas de glucoproteína y manano que favorecen la colonización y permanencia en la superficie corporal; enzimas como la proteasas, fosfolipasas, lisofosfolipasas. Y entre los factores de virulencias están la morfología celular, la actividad enzimàtica extracelular, el cambio fenotípico y los factores de adhesión que favorecen la formación de biopelículas [2].

Las biopelículas son organizaciones microbianas que se adhieren a las superficies gracias a la secreción de un exopolímero compuesto de glicocálix. Este exopolímero que es producido por los mismos microorganismos, forma una matriz adherente en donde estos quedan atrapados y comienzan a organizarse en colonias con diferentes requerimientos metabólicos. Entre las características de las biopelículas están la adherencia y heterogeneidad, que proporcionan resistencia contra defensas del hospedero, agentes antimicrobianos, detergentes, y capacidad de comunicación intercelular que las convierten en complejos difíciles de erradicar de los ambientes donde se establecen [3-5].

Su aparición como patógeno nosocomial es importante, ya que la infección por Candida es un factor de riesgo asociado a pacientes con enfermedades predisponentes, inmunodeficientes, con neoplasias y además se asocia a procedimientos médicos modernos, como tratamientos con fármacos inmunosupresores y antibióticos de amplio espectro, implantes de catéteres intravasculares o urinarios, tubos endotraqueales, válvulas cardíacas, marcapasos, reemplazos de articulaciones (cadera o rodilla), entre otros aparatos o dispositivos biomédicos. En los cuales se ha evidenciado la formación de biopelículas en la superficie de estos implantes, pudiendo alterarlos, disminuir su funcionabilidad o inhabilitarlos [2, 4, 6].

Se ha observado que, en poblaciones sésiles del género Candida hay modificaciones en su capacidad de respuesta metabólica en comparación con las células planctónicas, ya que las células dentro de las biopelículas modifican su respiración mitocondrial debido al gradiente de oxígeno y nutrientes, lo que genera heterogeneidad fisiológica, que constituye una característica de las biopelículas, por lo tanto la capacidad de formar biopelículas está relacionada directamente con el aumento de la resistencia antifúngica debido a estas modificaciones entre otros factores, favoreciendo la permanencia de la Candida en el hospedador y desarrollando cronicidad en los procesos infecciosos [4, 7-13]. Es por ello que, la presente investigación tuvo como objetivo principal evaluar la capacidad de formación de biopelículas en especies del género Candida aisladas de distintos procesos infecciosos, con la finalidad de comparar la capacidad de formación de biopelículas entre las distintas especies aisladas del género Candida y además relacionar la formación de biopelículas de las especies aisladas del género Candida con la procedencia clínica.

Materiales y métodos

Esta investigación es de tipo descriptivo, de corte transversal, prospectivo y con un diseño no experimental [14,15]. La población estuvo conformada por 70 cepas de levaduras del género Candida de diversas procedencias clínicas, aisladas en dos Laboratorios Privados de la Ciudad de Valencia, estado Carabobo Venezuela, entre mayo a noviembre de 2015. Los aislados fueron recolectados después de obtener la permisología otorgada por cada Laboratorio, cumpliéndose con el requisito del consentimiento informado de los pacientes involucrados. La muestra estuvo constituida por el total de las cepas que conformó la población.

Las cepas se sembraron en Agar Sabouraud Marca BD-BBL' suplementada con antibiótico para inhibir el crecimiento bacteriano. A las colonias aisladas se les realizó un examen directo, seguido de una tinción de Gram a cada uno de los aislados, para observar sus características morfotintoriales [16]. Las que poseían las características típicas de una levadura se resembraron en Agar Sabouraud a temperatura ambiente por 48 horas [16]. Luego se procedió a su identificación a través de la prueba de tubos germinativos para diferenciar las especies del Complejo Candida albicans de las Candida no albicans, posteriormente se realizó la detección de clamidosporas en Agar- Harina de Maíz con Tween 80, para la identificación de cada especie [16].

Cuantificación de la formación de biopelículas de los aislados de levaduras del género Candida

Una vez identificadas se procedió a la cuantificación de la capacidad de formación de biopelículas, la cual se efectuó mediante la técnica de microplaca en pozos de poliestireno (método colorimétrico) siguiendo la metodología de Rojas y cols adaptándola para levaduras, por lo cual se modificó el tiempo y temperatura de incubación por tratarse de un microorganismo fúngico [17].

Se preparó una suspensión de levadura ajustada al patrón de 1% Mc Farland para cada especie de Candida aislada en caldo de soya tripticasa (CST) marca BD-BBL". Ajustado el inoculo se procedió a colocar en cada pozo 20 pL de dicha suspensión más 180 pL de CST con glucosa al 0,25% (dilución 1:10) y luego se incubo en cámara húmeda por 48 horas a temperatura ambiente. Pasada la incubación, en cada pozo se realizaron 3 lavados con solución salina fisiológica estéril (SSF), pH 7,2 para eliminar las células no adheridas. Luego se añadieron 200 pL de solución de cristal violeta al 0,01% manteniéndose a temperatura ambiente por 30 min, para posteriormente realizar 3 nuevos lavados con SSF. A continuación se colocaron 200 pL de etanol al 95% para solubilizar el colorante adherido a las paredes, cuantificándose su densidad óptica (DO) como una estimación de la capacidad de formación de biopelículas, para lo cual se lee a 490 nm utilizando un lector de micro ELISA (Stat Fax 303 Plus).

Cada aislado se evaluó por cuadruplicado, incluyendo en cada ensayo ocho pozos controles sin inocular interpretándose estos como negativos y ocho pozos controles con aislados conocidos por sus altas capacidades de formación de biopelículas (4 pozos para P aeruginosa ATCC 27853 y 4 pozos para Complejo Candida albicans ATCC 10231) estos últimos se interpretaron como controles positivos ⁽¹⁷⁾. La clasificación de cada aislado, en cuanto a su capacidad de formación de biopelículas, fue hecha utilizando el protocolo de Gil y col 2015 [18] el cual consiste en usar el valor de la media aritmética (E3) de las DO obtenidas a 490nm de los controles positivos (DOc pos) y de los controles negativos (DOc neg) en tres fórmulas diferentes tal como sigue: VM: DOc (+) - (DOc -)/2

PC1: VM - Doc (-)/2 + DOc (-)

PC2: (DOc (+) -VM)/2 + VM

Donde las siglas significan:

VM: Valor Medio.DOc (+): Densidad óptica a 490 nm del Control Positivo.

PC2: Segundo punto de corte ⁽¹⁸⁾

Estos valores sirvieron para establecer los cuartiles de clasificación semicuantitativa de la capacidad de formación de biopelícula en cuatro categorías: Fuerte (F), Moderada (M), Débil (D) y No formadora (N). Interpretado de la siguiente manera: Desde DO del Control negativo hasta valores < primer punto de corte: No formadora, Valores > al primer punto de corte y < al valor medio: Débilmente formadora, Valores > al valor medio y < al 2do punto de corte: Moderadamente formadora, Valores > al 2do punto de corte: Fuertemente formadora [18].

El análisis descriptivo de los datos se expresó mediante tablas. Por otra parte, la asociación de la capacidad de formación de biopelículas con la especie del género Candida y con la procedencia clínica se efectuó mediante la prueba Chi-cuadrado (x²) de Pearson, con un nivel de confianza de 95%.

Resultados

El número total de aislados de especies del género Candida de procedencia clínica evaluados en este trabajo de investigación fue de 70, representando el 100%. Las especies identificadas fueron: Candida glabrata (34%), Complejo Candida albicans (30%), Complejo Candida parapsilosis (27%) y Candida tropicalis (9%). [Figura N° 1]

Las especies aisladas se agruparon según la capacidad de formación de biopelículas, como formadoras (59%) y no formadoras (41%). [Figura N° 2]

En la Tabla N° 2 se describen los 41 aislados de especies de Candida formadoras de biopelículas agrupándose según el grado de intensidad como fuertemente formadora y débilmente formadora. No hubo especies moderadamente formadoras. Se evidencia que Complejo Candida albicans obtuvo el mayor porcentaje de fuertemente formadora seguido de Complejo Candida parapsilosis y Candida

glabrata, siendo Candida tropicalis la única especie en que todos sus aislados fueron débilmente formadoras de biopelículas. [Tabla N° 2]

En la Tabla N° 3 se relaciona la capacidad de formación de biopelículas con la procedencia clínica en la cual se observa que las muestras de orina y secreción ótica son las procedencias en la que se evidencia el mayor porcentaje de cepas capaces de formar biopelículas, seguidas de las que provenían de secreción vaginal y hemocultivo. [Tabla N° 3]

En la Tabla N° 4 se describen 41 aislados de diferentes procedencias clínicas donde hubo formación de biopelículas, a partir de esto se evaluó la relación que tenía la procedencia del proceso infeccioso con el grado de formar biopelículas. En urocultivo prevalecen cepas con bajo grado de formación de biopelículas, las que provenían de hemocultivo eran en su mayoría altamente formadoras de biopelículas, y las de secreción ótica y vaginal poseían alto o bajo grado de formación de biopelículas en igual porcentaje. [Tabla N° 4].

Cuadro 1

Por otra parte, en la Tabla N° 5 se observa la procedencia clínica en relación a las especies del género Candida. La especie más frecuentemente aislada fue Candida glabrata, seguida de Complejo Candida albicans y Complejo Candida parapsilosis, siendo Candida tropicalis la menos frecuente. La procedencia clínica donde se aisló más especies del género Candida fue urocultivo, seguido de secreción ótica, secreción vaginal y hemocultivo. En donde resalta el predominio de Complejo Candida albicans en secreción vaginal, en tanto que Candida glabrata y Candida tropicalis prevalece en los urocultivos, seguido de Complejo Candida parapsilosis en secreciones óticas y hemocultivo. [Tabla N° 5]

Al analizar la frecuencia de las especies de Candida aisladas de cada procedencia clínica, se obtuvo un mayor porcentaje de Candida glabrata. Este dato es importante, ya que a pesar que esta especie es considerada menos virulenta que Complejo Candida albicans o C. tropicalis debido a la ausencia de seudohifas, también es cierto que actualmente se presenta como un patógeno oportunista emergente [19]. Existen investigaciones que han demostrado que C. glabrata produce proteinasas y que la hidrofobicidad de su superficie celular es similar a la de C. albicans, lo que asegura su capacidad de adherencia a las células del huésped, evidenciándose una rápida diseminación de las infecciones por C. glabrata en los enfermos inmunodeprimidos, en quienes se produce una elevada tasa de mortalidad. Este comportamiento se ve favorecido por alteraciones del huésped que contribuyen al desarrollo de las infecciones por esta especie, entre ellas la disminución en los niveles de IgA secretora vaginal, una menor respuesta inflamatoria y sobre todo, una disminución cuantitativa o cualitativa de los linfocitos T, hecho que explica su mayor frecuencia en los paciente con SIDA, trasplantados y con neoplasias [19].

En relación a Complejo Candida albicans en la presente investigación fue la segunda especie más aislada, lo cual es controversial con otras investigaciones de años anteriores, como la de Harriott y Noverr 2012, que expresan que la especie con mayor incidencia en las muestras clínicas es el Complejo Candida albicans [20]. Esto pone de manifiesto, que no solo las especies de Candida no albicans vienen en constante aumento, sino que además está superando al Complejo Candida albicans. Sin embargo, se mantiene que la especie más aislada en secreciones vaginales es Candida albicans lo cual coincide con Ciudad-Reynaud 2007 [21], aunque García en el 2009 reportó aumento de C. glabrata en vulvovaginitis [22]. Estos datos son médicamente relevantes debido a que el Complejo Candida albicans, tiene la propiedad de producir una mayor secreción de proteinasas aspárticas (Saps), lo cual conlleva una importante implicación clínica, ya que las Saps pueden comprometer la integridad normal de la vagina por hidrólisis de la inmunoglobulina A de la mucosa, una de las más efectivas barreras vaginales contra la infección [23]. Además de ser capaz de formar biopelículas bajo un intervalo amplio de pH y temperatura [6].

Por su parte, Complejo C. parapsilosis aún cuando es menos virulenta que C. albicans, en los últimos años se ha destacado como principal agente causal de candidemias de origen exógeno a partir de las manos del personal de salud, originando brotes de infección hospitalaria especialmente en recién nacidos y adultos jóvenes usualmente asociados a la presencia de dispositivos venosos centrales y alimentación parenteral, de allí que en la presente investigación se observó esta especie principalmente en hemocultivos [24, 25].

En tanto, Candida tropicales a pesar de ser la especie que se aisló en menor proporción, no deja de tener importancia clínica, pues aunque los factores de virulencia son menos conocidos, se ha estudiado que la secreción de hidrolasas y otras enzimas, así como la formación de biopelículas y el dimorfismo, son mecanismos que favorecen la colonización e invasión a los tejidos a la vez que evade al sistema inmune [26].

Conocer el comportamiento de agentes infecciosos en relación a la capacidad de formación de biopelículas ayuda a entender por qué en ocasiones el tratamiento con antimicrobianos sensibles in vitro no funciona in vivo, persistiendo de esta manera la infección en el organismo [27]. Estos conocimientos tienen que apuntar a la búsqueda de sustancias que no solo elimine al microorganismo en forma planctónica, sino también en estado sésil. Al analizar la capacidad de formación de biopelículas en relación a las distintas especies del género Cándida se observa que indistintamente a la especie involucrada todas presentaron esta capacidad, así como también hubo cepas de cada especie que no formaron biopelículas, por lo tanto no hubo diferencias significativas en relación a la especie, sin embargo Treviño 2011 y Rossignol y cols, 2009, aseguran que Complejo Candida parapsilosis produce menor formación de biopelículas que el Complejo Candida albicans [23,28], ya que existen diferencias considerables entre las biopelículas generadas por Complejo Candida parapsilosis pues estas son más pequeñas y simples al no formar hifas, aunque esto depende de la concentración de glucosa disponible, en cambio las biopelículas generadas por el Complejo Candida albicans son más complejas y forman hifas que le confiere una mayor capacidad de formar biopelículas [28].

Por otra parte, Tournu y Van Dijck 2012, mencionan que la especie con mayor grado de formación de biopelículas es el Complejo Candida albicans [8]. No obstante, en la presente investigación no se evidenció diferencias estadísticamente significativas entre la especie y el grado de intensidad de formación de biopelículas (p=0.1395).

En relación a la capacidad de formación de biopelículas de especies del género Candida en relación a la procedencia clínica en esta investigación se evidenció porcentajes más altos de formación de biopelícula en las cepas que provenían de muestras de orina y de secreciones especialmente (ótica y vaginal). Estos resultados coinciden con Castrillón y cols, en el año 2013 afirmaron que las especies que tenían mayor tendencia a formar biopelículas provenían de orina, por otra parte dicen que las que provienen de sangre y mucosas también poseen con frecuencia esta capacidad [11].

Esto se debe a diversos factores, como el flujo del medio que las rodea (orina, sangre y moco), el pH, la temperatura y además esto ayuda a la adhesión y colonización de estas especies de Candida; recordando que la formación de la matriz extracelular favorece en buena medida la adhesión celular y la maduración de la biopelícula [2]. Sin embargo en la presente investigación al aplicar la prueba de Chi-cuadrado (x²) no se obtuvo una diferencia estadísticamente significativa.

Por otra parte, Winn y cols, en el 2008, al igual que Fidel y cols en 1999, expresan que la especie que se aísla con más frecuencia en urocultivo es Candida glabrata, concordando con esta investigación [16, 29].

En cuanto al grado de formación de biopelículas en especies del género Candida en relación a la procedencia clínica Tournu y Van Dijck en el año 2012 afirmaron que, las especies que provenían de hemocultivos tenían tendencia hacer fuertemente formadoras de biopelículas, seguida de punta de catéter, secreciones óticas y vaginales estos resultados tienen similitud con esta investigación [8]. Estos resultados son coherentes debido a que son áreas que por lo general ofrecen condiciones propicias para que las especies del género Candida puedan instalarse y de esta manera provocar infecciones recurrentes con participación de formación de biopelículas, generalmente en grado fuerte. Sin embargo, al asociar ambas variables aplicando la prueba de Chi-cuadrado (x²) se obtuvo que no hay asociación estadísticamente significativa entre la procedencia y el grado de intensidad de formación de biopelículas (p=0,3716). La presente investigación concluye en primer lugar, que las principales especies presentes en diversos procesos clínicos son Candida glabrata, seguida de Complejo Candida albicans y las menos frecuentes Complejo Candida parapsilosis y Candida tropicalis, siendo este un dato importante ya que coincide con otros autores en que la frecuencia de Candida no albicans se ha incrementado en los procesos infecciosos causados por levaduras.

Así mismo, se demuestra que todas las especies del Género Candida son capaces de formar o no biopelículas en diferentes grados en un momento determinado.

Finalmente, se determinó que no hay relación entre la capacidad de formación de biopelículas y el grado de formación con la procedencia clínica, así como tampoco hay asociación entre la capacidad de formación de biopelículas y grado de formación con la especie involucrada.

Conflictos de interés

Los autores declaran no tener conflictos de interés.

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